Próbki krwi są przydatne do oceny biomarkerów stanów fizjologicznych lub chorób in vivo. Tutaj opisujemy metodologię pobierania krwi z bocznej żyły ogonowej u szczura. Ta metoda zapewnia szybkie pobieranie próbek przy minimalnym bólu i inwazyjności.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek krwi z bocznej żyły ogonowej szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Próbki krwi są powszechnie uzyskiwane w wielu kontekstach eksperymentalnych do pomiaru interesujących celów, w tym hormonów, czynników odpornościowych, czynników wzrostu, białek i glukozy, jednak skład krwi jest dynamicznie regulowany i łatwo go zaburzyć. Jednym z czynników, który może zmienić skład krwi, jest reakcja na stres wywołana procedurą pobierania próbek, co może przyczynić się do zmienności interesujących nas pomiarów. Tutaj opisujemy procedurę pobierania krwi z bocznej żyły ogonowej u szczura. Ta procedura ma znaczące zalety w porównaniu z innymi, częściej stosowanymi technikami. Pozwala na szybkie pobieranie próbek przy minimalnym bólu i inwazyjności, bez znieczulenia i znieczulenia. Dodatkowo może być stosowany do uzyskiwania próbek o dużej objętości (do 1 ml u niektórych szczurów) i może być używany wielokrotnie w ciągu dni eksperymentalnych. Minimalizując reakcję na stres i ból wynikający z pobierania krwi, pomiary mogą dokładniej odzwierciedlać prawdziwy stan podstawowy zwierzęcia, przy minimalnym wpływie samej procedury pobierania próbek.
Wprowadzenie
Biomarkery uzyskane z krwi dostarczają użytecznych środków diagnostycznych, predykcyjnych i stratyfikacyjnych w wielu kontekstach klinicznych, wtym w chorobach układu krążenia1,naukach o raku2 i chorobach psychicznych3. Mogą być również wykorzystywane w naukach podstawowych do oceny "stanu" organizmu, w tym stopnia głodu, stanu zapalnego lub obecnego stresu. Na takie miary mogą mieć wpływ zmienne, które mogą, ale nie muszą, mieć kluczowe znaczenie dla interesującego nas pytania, w tym pora dnia, w której pobierana jest próbka, oraz płeć badanych. Wpływ na to może mieć również stres wywołany podczas samych procedur pobierania krwi. Hormony stresu i percepcja bólu mogą szybko zmienić skład krwi.
Gryzonie są najczęściej używanymi zwierzętami laboratoryjnymi, a wiele metod pobierania krwi zostało opracowanych. Idealna metoda pobierania próbek krwi powinna mieć minimalny wpływ fizjologiczny na zwierzę, nie wymagać znieczulenia, umożliwiać szybkie i wielokrotne pobieranie próbek oraz zapewniać wystarczającą objętość krwi do wielu dalszych zastosowań. Popularne techniki pobierania krwi, takie jak cewnikowanie żyły szyjnej lub amputacja końcówki ogona, nie spełniają tych kryteriów.
Celem tego protokołu jest opisanie techniki pobierania próbek krwi do stosowania u szczurów, która jest minimalnie stresująca, nie wymaga znieczulenia, pozwala na wielokrotne pobieranie krwi w obrębie jednego obiektu i zapewnia stosunkowo dużą objętość próbki, dzięki czemu można przeprowadzić wiele testów na jednej próbce. Celem tej metody jest uzyskanie próbek krwi, na które w minimalnym stopniu wpływa ostra reakcja na stres.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na dorosłych samcach szczurów Long-Evans. Wszystkie procedury były zgodne z Przewodnikiem amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Massachusetts Institute of Technology oraz Biuro Przeglądu Opieki i Użytkowania Zwierząt USAMRMC.
1. Przygotowanie
- Heparynizacja cewnika i strzykawki polega na umieszczeniu osłoniętej igły w probówce o pojemności 500 μl zawierającej heparynę (1 000 jednostek USP/ml), a następnie zasysanie i wydalanie roztworu heparyny przez igłę.
- Podłączyć cewnik motylkowy do strzykawki. Trzymaj osłonę nad igłą cewnika, aby chronić ostrą końcówkę przed uszkodzeniem.
- Pobrać objętość heparyny, która jest nieco większa niż objętość krwi, która zostanie pobrana. Odłączyć strzykawkę i napełnić ją powietrzem.
- Ponownie podłączyć strzykawkę do cewnika i użyć powietrza do usunięcia nadmiaru roztworu heparyny; upewnić się, że w rurce, igle i strzykawce pozostały tylko śladowe ilości.
- Umieścić sterylny cewnik z nadal podłączoną strzykawką na sterylnej powierzchni.
- Szybko zabezpiecz szczura czystą szmatką, upewniając się, że przednie i tylne łapy są w wygodnej pozycji, a oddech jest nieograniczony.
- Zabezpiecz owijkę taśmą rzepową; upewnij się, że zewnętrzne narządy płciowe nie są zwężone.
- Poproś asystenta, aby delikatnie i stanowczo przytrzymał szczura (brzuch i podstawę ogona) na solidnej powierzchni roboczej z ogonem zwisającym z krawędzi blatu.
2. Pobieranie próbek krwi
- Zanurz ogon w wodzie o temperaturze 42 °C na 40-50 sekund, aby rozszerzyć naczynia krwionośne i osusz ogon ręcznikiem papierowym. Zlokalizuj żyłę ogonową, która ma zostać odpowietrzona (obróć całe ciało ogonem, aby zapobiec skręceniu ogona).
Uwaga: Wystarczające ocieplenie ogona ma kluczowe znaczenie dla szybkiego pobrania próbki krwi. Jeśli naczynia krwionośne są zwężone, prawidłowe umieszczenie cewnika jest trudne, a przepływ krwi jest znacznie zmniejszony. Poduszka grzewcza może być używana jako alternatywa dla zanurzenia w wodzie. - Zidentyfikuj punkt pobierania próbek.
Uwaga: Tętnica leży wzdłuż środkowej części grzbietowej ogona; Nie należy używać tego do pobierania próbek.- Celuj w lewą i prawą żyłę ogonową, które leżą bocznie do tętnicy. Pigmentacja ogona, która zmienia się w zależności od rodzaju i zwiększa się wraz z wiekiem, może zasłaniać część układu naczyniowego. Celuj w część żyły w dolnej części ogona.
- Przetrzyj obszar docelowy 2% roztworem antyseptycznym chlorheksydyny.
- Wytworzyć podciśnienie w strzykawce i cewniku, wycofując tłok od zera do około 50 μl.
- Trzymaj ogon delikatnie i mocno w pobliżu końcówki, aby utrzymać ogon prosto przez cały czas pobierania próbki. Upewnij się, że przepływ krwi nie jest zablokowany przez zbyt ciasny uchwyt.
- Powoli wprowadzić cewnik do żyły pod płytkim kątem około 5 cm od końca ogona. Po przebiciu żyły krew wpłynie do cewnika. Powoli wyjmować tłok strzykawki, aby zebrać żądaną objętość ze stałą szybkością (~20 μl na sekundę).
- Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym, aby uzyskać informacje na temat maksymalnej objętości krwi, którą można pobrać. Maksymalna ilość krwi, którą należy pobrać, zależy od wagi i stanu zdrowia szczura. Nie należy pobierać więcej niż 15% całkowitej objętości krwi w ciągu 14 dni.
Uwaga: Krew jest znacznie trudniejsza do pobrania od zwierząt, które były silnie zestresowane w ciągu kilku minut przed pobraniem próbki, ponieważ hormony stresu zwężają naczynia krwionośne. Na przykład przeniesienie domowej klatki szczura do nowego pokoju, poświęcenie kilku minut na owinięcie zwierzęcia lub wielokrotne wprowadzanie cewnika do żyły może wywołać ostrą reakcję stresową. - Ułatwiają przepływ krwi poprzez "dojenie" żyły. Przesuń palcem wzdłuż żyły, od podstawy w kierunku czubka ogona, ale pozostań w odległości większej niż 2 cm od końcówki wprowadzonej igły, w przeciwnym razie cewnik może zostać usunięty z żyły.
- Jeśli nie można pomyślnie pobrać krwi z początkowego miejsca penetracji cewnika, należy ponownie wprowadzić igłę w górę żyły. Jeśli krew została pobrana w miejscu początkowym, należy ponownie zwiększyć ciśnienie w igle, odłączając, a następnie ponownie podłączając cewnik i strzykawkę przed ponownym wprowadzeniem do żyły. Ogólnie rzecz biorąc, należy unikać dodatkowych penetracji.
- Ponieważ wielokrotne penetracje mogą spowodować zapadnięcie się żyły ogonowej, w której dopływ krwi do ogona zostaje odcięty, a miękka tkanka ogona ulega martwicy, należy poddać szczura eutanazji, jeśli dochodzi do zapadnięcia się żyły ogonowej.
- Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym, aby uzyskać informacje na temat maksymalnej objętości krwi, którą można pobrać. Maksymalna ilość krwi, którą należy pobrać, zależy od wagi i stanu zdrowia szczura. Nie należy pobierać więcej niż 15% całkowitej objętości krwi w ciągu 14 dni.
- Po zebraniu odpowiedniej objętości próbki zwolnić ciśnienie w strzykawce, odłączając i ponownie podłączając cewnik. Lekko zassać za pomocą tłoka strzykawki (~50 μl) i wyjąć igłę z żyły.
Uwaga: Jeśli igła zostanie wyjęta bez uprzedniego zwolnienia ciśnienia w strzykawce, krew będzie kapać z igły. - Krótko przyłożyć nacisk do miejsca wkłucia, aby zatrzymać krwawienie, i przetrzeć obszar roztworem antyseptycznym. Przywróć szczura do jego domowej klatki.
3. Przetwarzanie próbki krwi
- Zassać powietrze, aby upewnić się, że krew nie pozostała wewnątrz igły cewnika, i użyj nożyczek, aby przeciąć rurkę cewnika tuż nad igłą. Wydalić krew do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
Uwaga: Jeśli krew zostanie przepchnięta przez igłę, siła ścinająca może spowodować pęknięcie czerwonych krwinek, co może zakłócać wiele dalszych testów. Usuń igłę, aby uniknąć hemolizy.- Aby pobrać osocze krwi, użyj probówek zawierających EDTA jako antykoagulant (tutaj użyj 10 μl 0,1 M EDTA na 200-400 μl krwi; upewnij się, że stężenie użytego EDTA nie zakłóca dalszego testu) i umieść na lodzie.
- Próbki krwi pełnej należy obracać w temperaturze 2 100 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C) przez 10 minut w ciągu 10 minut od pobrania. Eluować osocze, unikając naruszania czerwonych i białych krwinek.
- Aby pobrać surowicę krwi, umieść próbki (bez antykoagulantu) w temperaturze pokojowej na okres do 30 minut, aby umożliwić krzepnięcie. Odwirować probówki zbiorcze w wirówce z chłodzeniem (4 °C) o temperaturze 2 000 x g. Surowica może być następnie eluowana.
- Aby pobrać osocze krwi, użyj probówek zawierających EDTA jako antykoagulant (tutaj użyj 10 μl 0,1 M EDTA na 200-400 μl krwi; upewnij się, że stężenie użytego EDTA nie zakłóca dalszego testu) i umieść na lodzie.
- Próbki należy zużywać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
Wyniki
Osocze krwi pobrane z bocznej żyły ogonowej zgodnie z opisem w protokole stanowi próbkę osocza, która jest półprzezroczysta i ma bladożółty kolor. Jak pokazano na Rysunku 1, hemoliza w próbce nadaje osoczu czerwony odcień. Ostra odpowiedź stresowa może szybko zmienić skład krwi. Na przykład stężenie krążącego kortykosteronu może znacznie wzrosnąć w ciągu 10 min od narażenia na stresor, co przedstawiono na Rysunku 2. Niskie podstawowe poziomy kortykosteronu uzyskane tą metodą przed narażeniem na stresor wskazują, że sama procedura pobierania próbek nie stanowi istotnego źródła stresu.
Rycina 1: Wygląd próbek. (A) Przedstawiono próbkę z hemolizą. Po wirowaniu warstwa osocza lub surowicy (powierzchnia wskazana czarną strzałką) wydaje się zabarwiona na różowo lub czerwono. Ciemniejsze odcienie wskazują na większy stopień hemolizy. (B) Po wirowaniu prawidłowo pobrana próbka będzie miała przejrzysty, żółtawy wygląd górnego pasma (powierzchnia wskazana czarną strzałką), które odpowiada niehemolizowanemu osoczu lub surowicy. Podczas usuwania tej warstwy ważne jest, aby nie naruszyć znajdującej się poniżej krwi pełnej, zarówno poprzez wciśnięcie końcówki pipety w warstwę krwi pełnej, jak i poprzez zasysanie części krwi pełnej do końcówki. Każdą próbkę osocza lub surowicy zanieczyszczoną krwią pełną należy odrzucić.
Rycina 2: Szybki wzrost poziomu kortykosteronu w osoczu po stresującym doświadczeniu. Krew pobrano z bocznej żyły ogonowej dorosłych samic szczurów Long-Evans przed oraz 10 min po ekspozycji na 4 sygnały dźwiękowe (10 s, 2 kHz, 85 dB) kończące się równocześnie z wstrząsami elektrycznymi stóp (1 s, 350 µA). Stężenie kortykosteronu w osoczu krwi w punkcie wyjściowym (290.4 ± 138.8 pg / ml) było istotnie niższe niż poziomy obserwowane 10 min po zastosowaniu stresu w postaci wstrząsów elektrycznych (2204.8 ± 454.5 pg / ml, p = 0.02, n = 4), co określono za pomocą testu t dla prób zależnych. *, p <0.05
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy szybką i prostą procedurę pobierania próbki krwi od szczura, która oferuje znaczące zalety w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami. Po pierwsze, nie wymaga znieczulenia, w przeciwieństwie do pobierania próbek z żyły szyjnej lub zatoki zaoczodołowej. Podczas pobierania próbek krwi w związku z procedurami behawioralnymi, podawanie środków znieczulających jest niepożądane, ponieważ może zakłócać uczenie się i pamięć4,5. Po drugie, oferuje możliwość pobierania większych objętości krwi niż inne techniki nakłuwania żył, takie jak pobieranie z żył odpiszczelowych lub grzbietowych pedałów. Stosując opisaną tutaj technikę, można pobrać od szczura do 1,5 ml krwi w jednym punkcie czasowym, co pozwala na równoległe przeprowadzenie wielu testów. Wreszcie, procedura ta minimalizuje ryzyko uszkodzenia tkanek w porównaniu z amputacją końcówki ogona lub krwawieniem zaoczodołowym. Stosowanie tej procedury ułatwia przestrzeganie ustawy o dobrostanie zwierząt oraz Przewodnika opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, które wymagają zminimalizowania bólu i stresu wynikającego z procedur laboratoryjnych wykonywanych na zwierzętach.
Zaleca się, aby badacze, którzy nie mają doświadczenia w tej metodzie, ćwiczyli techniki krępowania i krwawienia z ogona w celu zminimalizowania czasu, w którym zwierzęta doświadczalne są skrępowane. Krew pobrana w czasie krótszym niż 3 minuty od rozpoczęcia krępowania zapewnia optymalne wyniki.
Opisany tutaj protokół może być stosowany do pobierania próbek od 1 do 4 razy w tygodniu, ale nie częściej niż dwa razy dziennie. Chociaż można przeprowadzać wielokrotne pobieranie krwi, należy wykorzystać różne miejsca pobierania próbek przesuwające się w górę od podstawy ogona, a żyły lewej i prawej żyły ogonowej powinny być naprzemiennie traktowane jako miejsca pobierania próbek. Całkowita objętość krwi gryzoni wynosi 6-7% ich masy ciała, a w ciągu 2 tygodni należy pobrać nie więcej niż 15% całkowitej objętości krwi. Surowica lub osocze stanowi około 40-60% objętości pobranej próbki.
Pobieranie krwi przez boczne żyły ogonowe można również przeprowadzić u myszy, jak opisano tutaj, z kilkoma niewielkimi modyfikacjami. Po pierwsze, można używać tylko cewników o małej średnicy (27 G). Po drugie, zaleca się użycie rurki przytrzymującej, a nie owijki, aby unieruchomić myszy. Objętość krwi, którą można pobrać od myszy za pomocą nakłucia żyły pęczka naczyniowego podżuchwowego (200-500 μl), jest większa niż ta, którą można bezpiecznie pobrać z żyły ogonowej (maksymalnie 200 μl). Ponieważ pobieranie próbek krwi z pęczka naczyniowego podżuchwowego wymaga minimalnych ograniczeń i może dać więcej krwi, jest to preferowana metoda pobierania próbek u myszy.
Szybkość, z jaką można wykonać tę procedurę, wraz z jej minimalnie inwazyjnym charakterem, minimalizuje również potencjalne zakłócenia pomiarów krwi przez ostrą reakcję na stres6. Ostra reakcja na stres może zmienić krążący poziom wielu cząsteczek, w tym interleukiny i innych czynników immunologicznie czynnych7, hormonów osi podwzgórze-przysadka-nadnercza8, hormonów we współczulnym układzie nerwowym9, greliny10, endogennych opioidów11, dopaminy i serotoniny12. Jeśli pożądane są spoczynkowe pomiary krążenia tych cząsteczek lub innych regulowanych przez te cząsteczki, ważne jest, aby zminimalizować reakcję na stres, która jest wyzwalana w ciągu zaledwie minuty od rozpoczęcia ekspozycji na stresor.
Reakcje na stres nie tylko zmieniają skład krwi, ale także stanowią techniczną przeszkodę w pobieraniu próbek krwi ze względu na zwężenie naczyń krwionośnych poprzez zwiększony napęd ze współczulnego układu nerwowego. Coraz trudniej jest uzyskać stały przepływ krwi od szczura, który narasta w ostrej reakcji na stres. W związku z tym stres zwierzęcia musi być zminimalizowany, aby szybko uzyskać próbki, które odzwierciedlają stan fizjologiczny będący przedmiotem zainteresowania.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Virginii Doherty i Junmei Yao za pomoc techniczną. Badania te zostały sfinansowane przez NIMH (R01 MH084966) oraz U.S. Army Research Office i Defense Advanced Research Projects Agency (grant W911NF-10-1-0059) dla KAG.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Heparyna sodowa (1,000 jednostek USP / ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor płukanka z chlorheksadyną | Butler Schein | 6356 | Miejscowy roztwór antyseptyczny, 2% glukonian chlorheksydyny |
| SURFLO Zestawy do infuzji skrzydeł, Terumo, cewniki motylkowe | VWR Scientific | ||
| Strzykawki BD Tuberculin 1 cm³ | Probówki | BD309659 | |
| 1,5 ml | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μ l Probówki do mikrowirówek | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Nożyczki, stal nierdzewna, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| Plastikowa zlewka 500 ml | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Czysta owijka szmatką | Butler Schein | 2993 | |
| Taśma rzepowa o szerokości 0,75 cala | Monoprice | B004AF9II6 | Taśma |
| na rzepPrzekaźnik czasowy | VWR Scientific | 62344-641 |
Bibliografia
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431(2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
Przedruki i uprawnienia
