Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków

Podsumowanie

Opisano metodę fluorescencyjnego barwienia utrwalonego materiału biologicznego za pomocą specyficznej etykiety DNA o nazwie metylowej. Zieleń metylowa jest stosowana w rozcieńczonym roztworze wodnym i jest bardzo odporna na fotowybielanie. Jego daloka-czerwona emisja pozwala na głębokie obrazowanie próbek, dzięki czemu jest szczególnie odpowiedni dla całych zarodków.

Streszczenie

Zieleń metylowa od dawna znana jest jako barwnik histologiczny o specyficznym powinowactwie do DNA, chociaż jego właściwości fluorescencyjne do niedawna pozostawały niezbadane. W tym artykule ilustrujemy metodę przygotowania wodnego roztworu podstawowego zieleni metylowej, który po rozcieńczeniu może być stosowany jako bardzo wygodny fluorescencyjny znacznik jądrowy dla utrwalonych komórek i tkanek. Szczegółowo opisano proste procedury znakowania całych zarodków danio pręgowanego i piskląt, a także przedstawiono przykłady uzyskanych obrazów. Zieleń metylowa jest maksymalnie wzbudzana przez światło czerwone, przy 633 nm, i emituje stosunkowo ostre widmo, które osiąga szczyt przy 677 nm. Jest bardzo tani, nietoksyczny, wysoce stabilny w roztworze i bardzo odporny na fotowybielanie po związaniu z DNA. Jego czerwona emisja pozwala na niezmienione skaningowe obrazowanie konfokalne jąder w grubych próbkach w wysokiej rozdzielczości. Wreszcie, ten protokół barwienia zielenią metylową jest kompatybilny z innymi procedurami barwienia komórek, takimi jak znakowanie przeciwciał lub znakowanie filamentów aktynowych falloidyną sprzężoną z fluoroforem.

Wprowadzenie

Barwienie fluorescencyjne DNA jest szeroko i rutynowo stosowane zarówno w badaniach biologicznych, jak i w diagnostyce klinicznej, zarówno do szczegółowego badania struktury jądrowej i chromosomalnej, do przeciwbarwienia tkanek i komórek, jak i do badania parametrów cyklu komórkowego¹. Chociaż dostępnych jest kilka barwników DNA, najczęściej stosowane są te wzbudzone światłem UV i emitujące na niebiesko, które pasują do zwykłych systemów trzech filtrów stosowanych w większości konwencjonalnych mikroskopów epifluorescencyjnych w połączeniu z fluoroforami emitującymi zielone i pomarańczowo-czerwone, takie jak białka fluorescencyjne lub małe cząsteczki przyłączone do przeciwciał. Wśród tych emitujących niebieski barwnik DNA najczęstsze są DAPI i Hoechst mniejsze środki wiążące rowki^2,3. Niemniej jednak, włączenie szerokiej gamy laserowych linii emisyjnych i detekcji spektralnej do laserowych mikroskopów skaningowych pozwoliło naukowcom zdecydować się na zastosowanie barwników jądrowych emitujących daleko czerwoną czerwień, takich jak jodek propidyny (PI) lub TO-PRO 3⁴. Zaletą tych barwników jest to, że rozwiązują one problem autofluorescencji występujący w wielu komórkach i tkankach, szczególnie w zarodkach⁵, ale wiele z nich ma różne problemy, takie jak szerokie profile emisji lub duża wrażliwość na fotowybielanie⁶.

Szwajcarski badacz Friedrich Miescher odkrył DNA w 1869 roku, ekstrahując je z jąder białych krwinek znajdujących się w ropie. Nazwał ją nukleiną i wykazał kilka lat później, że tworzy ona osady ze stosunkowo nowym barwnikiem zieleni metylowej. Zieleń metylowa składa się z trzech pierścieni anilinowych o różnym stopniu metylacji i ma dwa dodatnie ładunki, które pozwalają jej silnie wiązać się z głównym rowkiem DNA^7,8. Barwienie DNA za pomocą zieleni metylowej bardzo wcześnie okazało się specyficzne, co doprowadziło do opracowania przez Unnę i Pappenheima połączonego barwienia z pyroniną, która specyficznie znakuje RNA. Od tego czasu zieleń metylowa pyronina jest szeroko stosowana w rutynowych technikach histologicznych⁹.

Do niedawna bardzo mało było wiadomo o właściwościach fluorescencyjnych zieleni metylowej. Nasze wcześniejsze prace ujawniły jednak niektóre z zalet spektralnych zieleni metylowej6, takie jak jej wzbudzenie przy 633 nm, wygodne przesunięcie Stokesa, jej emisja w bliskiej podczerwieni widma elektromagnetycznego, wyższa fotostabilność niż komercyjnie dostępne barwienia DNA o podobnych właściwościach spektralnych i przy bardzo niskich kosztach. Dlatego zdecydowaliśmy się przetestować go pod kątem stosowania jako bardzo wysokiego powinowactwa i specyficznego znacznika fluorescencyjnego dla DNA na tkankach embrionalnych i w całych zarodkach. Co więcej, do tej pory barwienie jądrowe zielenią metylową wykonywano przy niskim pH, co utrudniało łączenie z barwieniem przeciwciałami. Celem opisanej tutaj metody jest posiadanie protokołu barwienia fluorescencyjnego jądrowego DNA, który przezwycięża wyżej wymienione niedogodności poprzez przeprowadzenie procedury barwienia przy fizjologicznym pH, dzięki czemu jest odpowiednim barwnikiem przeciwstawnym do znakowania immunologicznego na skrawkach i całych tkankach.

Protokół

1. Oczyszczanie barwnika

1. Przygotować 4% wodny roztwór zieleni metylowej, rozpuszczając 0,4 g bejcy w proszku w 10 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.
2. Pod wyciągiem wymieszaj go z co najmniej 2 częściami chloroformu. Ważne jest, aby wcześniej sprawdzić, czy rurki są odporne na chloroform.
3. Dokładnie wymieszać i odwirowywać przez 1 minutę przy 2 000 x g, aby przyspieszyć separację faz.
4. Po odwirowaniu otrzymuje się górną fazę wodną z zielenią metylową i dolną fazę organiczną z chloroformem i zwykłym zanieczyszczeniem fioletowym kryształowym.
5. Odzyskaj górną fazę i powtarzaj ten krok, aż dolna faza pojawi się całkowicie pozbawiona fioletu krystalicznego.
6. Na koniec górna faza jest odzyskiwana i rozcieńczana w wodzie do końcowego stężenia 2% zieleni metylowej. Ten podstawowy roztwór jest stabilny na stole warsztatowym przez wiele miesięcy i nie trzeba go chronić przed światłem.

2. Fluorescencyjne barwienie jądrowe całych zarodków danio pręgowanego za pomocą zieleni metylowej

1. Utrwal zarodki na noc w 4% formaldehydzie (z paraformaldehydu) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
   UWAGA: Może to potrwać od kilku godzin do nocy, w zależności od grubości zarodków. W tym przykładzie naprawiliśmy zarodki danio pręgowanego po 48 godzinach po zapłodnieniu (hpf) w ciągu nocy.
2. Umyj zarodki trzy razy w PBS-T (1% Triton X-100 w PBS) przez 5 minut. Podwyższone stężenie detergentu przenika przez naskórek.
3. Przygotować roztwór zieleni metylowej w proporcjach 1:5 000-1:10 000 (z 2% roztworu podstawowego) w PBS-T. Obecność detergentu podczas inkubacji jest przydatna w przypadku grubych okazów, takich jak zarodki i larwy danio pręgowanego.
4. Inkubować zarodki w roztworze przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Ponownie, grubość zarodka jest parametrem kalibrującym długość inkubacji.
5. Umyj zarodki 3 razy PBS przez 30 minut, aby usunąć nadmiar detergentu. Fluorescencja zieleni metylowej jest widoczna tylko wtedy, gdy jest związana z DNA, stąd tło z niezwiązanej cząsteczki jest znikome.
6. Zamontować na wykopanej zjeżdżalni lub domowej komorze z roztworem montażowym (75% glicerol, 0,1 M Tris·HCl pH 8).
   UWAGA: Jeśli barwienie jądrowe ma być wykonane po znakowaniu immunologicznym, zieleń metylowa może być włączona do roztworu montażowego w stężeniu roboczym, bez konieczności jej zmywania.
7. Przechowywać w lodówce lub natychmiast rozpocząć obrazowanie. Obrazowanie należy wykonać za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (lub innego mikroskopu fluorescencyjnego) ze wzbudzeniem przy długości fali 633 nm i filtrami emisyjnymi ustawionymi na rejestrację przy długości fali 650–750 nm, biorąc pod uwagę, że emisja zieleni metylowej osiąga maksimum przy długości fali 677 nm.
   UWAGA: Jako materiał uzupełniający udostępniamy zmierzone dane profilu emisji zieleni metylowej, które należy załadować do oprogramowania do akwizycji.

3. Fluorescencyjne barwienie jądrowe całych zarodków piskląt za pomocą zieleni metylowej

1. Wysiaduj zapłodnione jaja kurze do etapu zainteresowania. Utrwalić zarodki na noc w 4% formaldehydzie (z paraformaldehydu) w PBS w temperaturze 4 °C. Umyć zarodki 3 razy w PBS-T przez 2 godziny.
2. Przygotować roztwór zieleni metylowej w proporcjach 1:5 000-1:10 000 (z 2% roztworu podstawowego) w PBS-T. Inkubować zarodki w roztworze barwiącym przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć zarodki 3 razy w PBS po 1 godzinę każdy. Zamontuj w komorze z 75% glicerolem, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych jąder w całych zarodkach

1. Przygotuj komorę obrazowania, przyklejając kilka warstw taśmy izolacyjnej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie wytnij w niej otwór skalpelem, aby umieścić w niej zarodki. Zapobiegnie to zgniecaniu zarodków podczas obrazowania.
2. Ostrożnie przenieś zarodki do komory obrazowania i napełnij komorę do góry 75% glicerolem, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
3. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym #0, unikając lub eliminując przepełnienie medium. Uszczelnij go lakierem do paznokci.
4. Uzyskaj obrazy próbki na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr wzbudzający 633 lub linię laserową.
   UWAGA: Filtry emisyjne powinny pokrywać maksimum emisji zieleni metylowej 677.

Wyniki

Barwienie jądrowe grubych próbek. Opisany tu protokół pozwala na uzyskanie jednorodnego barwienia głębokich struktur w całych zarodkach. Rozwijające się jądra soczewek z 48 zarodków zebry zebry hpf są jednorodnie znakowane (ryc. 1).

Barwienie DNA zielenią metylową pozwala na rozróżnianie różnic morfologicznych zależnych od cyklu komórkowego, takich jak identyfikacja figur mitotycznych lub jąder apoptotycznych (Rysunek 2A). Struktury subjądrowe w wysokiej rozdz...

Dyskusja

Postępujący rozwój technik mikroskopowych w ostatnich dziesięcioleciach, ze szczególnym naciskiem na odmiany mikroskopii fluorescencyjnej, doprowadził do możliwości zbadania dynamiki i struktury nienaruszonych próbek tkanek, w tym całych zarodków^10,11. Jednym z głównych ograniczeń jest jednak dostępność dobrej jakości fluoroforów, które można wykorzystać do bezpośredniego i szybkiego barwienia struktur subkomórkowych.

Najczęściej stosowane fluorescencyjne barwienia DNA, takie jak D...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Zieleń metylowa	Dr. G. Grü Bler		Testowany również Sigma-Aldrich 323829, który jest wolny od fioletu krystalicznego
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin– Izotiocyjanian tetrametylorodaminy B	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Wirówka 5810 R	eppendorf	5811 000.010
Szkiełka mikroskopowe	Deltalab	D100004
szkiełka nakrywkowe	Optyka Esco	R525025