Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Summary

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Abstract

Malaria powoduje znaczną globalną zachorowalność i śmiertelność. Obecnie nie jest dostępna żadna rutynowa szczepionka. Jedną z głównych przyczyn braku szczepionki jest wyzwanie związane z identyfikacją odpowiednich kandydatów na szczepionki. Białka malarialne ulegające ekspresji za pomocą systemów ekspresji opartych na komórkach prokariotycznych i eukariotycznych są słabo glikozylowane, na ogół nierozpuszczalne i ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu, co prowadzi do zmniejszenia immunogenności. Kiełki pszenicy, lizat retikulocytów królika i systemy ekspresji wolne od komórek lizatu coli Escherichia są obecnie wykorzystywane do ekspresji białek malarii. Jednak długość czasu odciągania i niewłaściwa glikozylacja białek nadal pozostają wyzwaniem. Demonstrujemy ekspresję białek Plasmodium in vitro przy użyciu systemów ekspresji bezkomórkowej opartych na HeLa, określanych jako "systemy ekspresji wolnej od komórek ludzkich in vitro". 2 systemy ekspresji bezkomórkowej oparte na HeLa transkrybują mRNA w 75 minut, a 3 μl transkrybowanego mRNA wystarczają do translacji białek w 90 minut. 1-etapowy system ekspresji to system ekspresji sprzężony z transkrypcją i translacją; Transkrypcja i wspólne tłumaczenie odbywa się w ciągu 3 godzin. Proces można również przedłużyć o 6 godzin, dostarczając dodatkową energię. W 2-etapowym systemie ekspresji mRNA jest najpierw transkrybowane, a następnie dodawane do mieszanki translacyjnej w celu ekspresji białka. Opisujemy, jak wyrażać białka malarii; hydrofobowe białko transbłonowe PF3D7_0114100 Maür's Cleft – 2 (PfMC-2TM), hydrofilowe białko PF3D7_0925900 i powtórzenia pancernika zawierające PF3D7_1361800 białkowe, przy użyciu systemu ekspresji wolnej od komórek opartego na HeLa. Białka ulegają ekspresji w mikroobjętościach przy użyciu 2-etapowych i 1-etapowych strategii ekspresji. Opisano również metodę oczyszczania z powinowactwem w celu oczyszczenia 25 μl białek ulegających ekspresji za pomocą systemu wolnej ekspresji komórek ludzkich in vitro. Wydajność białka określa się za pomocą testu Bradforda, a ekspresję i oczyszczone białka można potwierdzić za pomocą analizy western blot. Ekspresja białek rekombinowanych może być stosowana do immunizacji, testów immunologicznych i sekwencjonowania białek.

Introduction

W badaniach nad malarią, ekspresja białek immunogennych za pomocą systemów opartych na komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych pozostaje wyzwaniem. Bogactwo A-T genomu Plasmodium i nieznane mechanizmy potranslacyjne^14,7 przyczyniają się do trudności związanych z uzyskaniem prawidłowo sfałdowanych i immunogennych białek do produkcji przeciwciał i badań nad szczepionkami. Systemy prokariotyczne, takie jak Escherichia coli, były wykorzystywane do ekspresji białek rekombinowanych. Systemy prokariotyczne są tanie, skuteczne, dają wysokie plony rekombinowanego białka i mają wiele wektorów klonowania. Komórki gospodarza E. coli są łatwe do przekształcenia, a komórki szybko rosną. Jednak systemy prokariotyczne mają ograniczenia, takie jak brak substytucji aminokwasów, modyfikacja potranslacyjna, ryzyko zanieczyszczenia, produkty heterogeniczne i akumulacja rekombinowanych białek w ciałach inkluzyjnych²⁴.

W badaniu przeprowadzonym przez Mehlina i in. (2006) wyrażono 1000 otwartych ramek odczytu (ORF). Około 7% eksprymowanych białek było rozpuszczalnych¹⁴. Zaobserwowana nierozpuszczalność wynika z tendencyjnego charakteru genów i wysokiej częstotliwości kodonów, które są idealnie wykorzystywane przez genom bogaty w Plasmodium A-T¹⁴. Opracowano alternatywną strategię przezwyciężenia tego problemu przy użyciu plazmidów lub komórek gospodarza zawierających tRNA, które rozpoznają rzadkie kodony lub kodony pasujące do częstotliwości³. Nawet po przeprowadzeniu tych optymalizacji, bardzo małe porcje białek są wyrażane jako rozpuszczalne, aktywne i immunogenne¹⁴. Bezkomórkowe systemy ekspresyjne zawierają wszystkie składniki niezbędne do transkrypcji i translacji, takie jak rybosomy, czynniki inicjacji, czynniki elongacji (czynniki translacyjne), syntetazy tRNA i aminoacylo-tRNA. Zarówno reakcje transkrypcji, jak i translacji są sprzężone w jednoetapowej procedurze^11,29. Reakcję transkrypcji przeprowadza się w probówce przed inkubacją odpowiedniej ilości mRNA za pomocą maszynerii translacyjnej w innej probówce^11,29. Chociaż metody te są skuteczne w ekspresji białka Plasmodium sp., główną wadą jest czas ekspresji białka, który wynosi około 22 godzin²⁹. Ponadto wysokie koszty dostaw w celu włączenia do protokołów²⁹, pracochłonne przygotowanie lizatu komórkowego i niespójności w przygotowaniach składników sprawiają, że systemy te są nieosiągalne. Główny cel, na którym skupiają się naukowcy w celu opracowania systemu ekspresji bezkomórkowej, zależy od takich czynników, jak szybka modyfikacja genetyczna, szybkie plony przy wysokich stężeniach i proste preparaty lizatu¹.

Systemy eukariotyczne, takie jak drożdże, linie komórkowe ssaków, system ekspresji, w którym pośredniczy bakulowirus, termofilia Tetrahymena, Dictyostelium discoideum i pasożytnicze systemy ekspresji, takie jak Leishmania, zostały wykorzystane do rekombinowanej ekspresji białek⁷. Systemy eukariotyczne mają wspólne pokrewieństwo filogenetyczne, a zatem mają również wspólne cechy, takie jak glikozylacja, acylacja, tworzenie wiązań dwusiarczkowych, interakcja chaperonowa, proteoliza i subkomórkowa podział na przedziały. Zdarzenia wydzielania białek u eukariontów zapobiegają akumulacji i zmniejszają toksyczność dla systemów ekspresyjnych¹³. Preferowane jest stosowanie systemów drożdżowych, ponieważ nadają się one do ekspresji białka na dużą skalę i do uzyskiwania wysokich plonów⁴. Dwa białka P. falciparum PfCP-29 i Pvs25 wyprodukowano przy użyciu systemu drożdżowego⁴. Jednak główną wadą w syntezie większości białek były nieregularne wzorce N i O-glikozylacji, niewłaściwe fałdowanie i obcinanie białek z ich natywnej formy⁴.

Wykorzystanie komórek ssaków do syntezy białek rekombinowanych jest pracochłonne, a utrzymanie stabilnych linii komórek rekombinowanych jest kosztowne⁴. W związku z tym komórki ssaków zostały ograniczone do analizy sygnalizacji białkowej, interakcji białkowych i interakcji pasożyt-gospodarz, a także do testowania szczepionek DNA⁴. Opisany tutaj ludzki system ekspresji białek in vitro in vitro jest systemem opartym na komórkach HeLa opartym na ssakach, który ulega ekspresji białek w ciągu 3 godzin. Białka eksprymowane za pomocą wektora ekspresyjnego pT7CFE1-cHis mają znacznik C-końcowy ułatwiający identyfikację i oczyszczanie. System oparty na HeLa jest uzupełniony o czynniki inicjujące tłumaczenie i regulator translacji, zwiększając w ten sposób wydajność systemu tłumaczeniowego. Białka mogą być szybko translowane, przesiewane, weryfikowane i przetwarzane w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach immunologicznych i strukturalnych¹⁵.

Systemy ekspresji bezkomórkowej eukariotycznej, takie jak kiełki pszenicy i retikulocyty królika, są obecnie używane do ekspresji różnych białek eukariotycznych, w tym białek Plasmodium ^11,29. Ponadto systemy bezkomórkowe oparte na E. coli są również wykorzystywane do ekspresji białek eukariotycznych¹¹. Tabela 1 podsumowuje różne systemy ekspresji bezkomórkowej, porównując cechy systemów, a także łatwość wykorzystania systemów do ekspresji białek. System bezkomórkowy dla człowieka w porównaniu z innymi ma zdolność do wykonywania modyfikacji post- i kotranslacyjnych i jest tańszy. Optymalizacja kodonów jest możliwa, a wszystkie reakcje można przeprowadzić w ciągu 3 godzin. System HeLa jest idealnym systemem translacyjnym do syntezy białek w warunkach laboratoryjnych.

Główną zaletą systemów ekspresji bez komórek ludzkich nad innymi systemami bezkomórkowymi jest dostępność kilku różnych linii komórkowych pochodzących z różnych organów i tkanek. W zależności od linii komórkowej można zaprojektować kilka odmian systemów bezkomórkowych. Ekstrakty pochodzące z komórek ssaków mają wyższą wydajność syntezy dużych białek niż jakiekolwiek inne systemy ekspresji bezkomórkowej. Te bezkomórkowe systemy ekspresji mogą być również wykorzystywane w zastosowaniach diagnostycznych i charakteryzacji białek, takich jak mikromacierze³⁰. Popularne linie komórkowe HeLa są najczęściej wykorzystywane do przeprowadzania ekspresji białek³³. Retikulum endoplazmatyczne w liniach komórkowych HeLa jest słabo rozwinięte, co prowadzi do braku potranslacyjnej modyfikacji glikozylacji³³. Uważa się jednak, że system ten jest korzystny dla syntezy białek Plasmodium, ponieważ Plasmodium nie ma również glikozylacji po modyfikacji translacyjnej²⁹. Protokół transkrypcji i translacji bez komórek HeLa jest łatwy do wykonania, niedrogi, a białka mogą być wyrażane w ciągu 90 minut, gotowe do oczyszczania i dalszych zastosowań.

Protocol

1. Przygotowanie kultur komórek pasożytów, zbieranie osadów pasożytów

1. Przygotować pożywkę RPMI-1640-HEPES, dodając 10 g proszku RPMI-1640, 66 mg siarczanu gentamycyny, 2 g wodorowęglanu sodu, 5,9 g buforu HEPES, 50 mg hipoksantyny i 3,8 g dekstrozy w 1 l sterylnego dH₂O. Mieszać za pomocą stołowego mieszadła magnetycznego, aż cały proszek rozpuści się w 1 l wody destylowanej. Wykonaj mikrofiltrację mediów za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać pożywkę w sterylnych butelkach.
2. Umyj niezakażone (świeże) erytrocyty typu A+ za pomocą RPMI. Przygotuj 5% hematokrytu erytrocytów (0,5 ml umytych świeżych erytrocytów w 9,5 ml 10% RPMI + surowica ludzka).
3. Zrób 15% ludzkiej surowicy + RPMI (15 ml ludzkiej surowicy i 85 ml RPMI), aby rozpocząć hodowlę pasożytów. Wykonaj 10% ludzkiej surowicy i RPMI (10 ml ludzkiej surowicy i 90 ml RPMI), aby kontynuować hodowlę pasożytów w czerwonych krwinkach.
4. Hodowla P. falciparum (szczepy 3D7 i FCR-3) w ludzkich erytrocytach typu A+ przy 5% hematokrycie i 20% parazytemii na szalce Petriego lub w kolbie hodowlanej o średnicy 75^cm3. Utrzymuj kulturę in vitro zgodnie z metodą słoika na świecę Tragera i Jensena²⁶. Alternatywnie, hodowle podtrzymujące są w inkubatorze w temperaturze 37 °C, utrzymując 9,5% CO₂ i 3,4% N₂ gazu. Hodowla P. falciparum w pożywce RPMI 1640-HEPES uzupełniona 10% surowicą ludzką.
5. Zsynchronizuj kulturę P. falciparum, dodając 65% percollu (65 ml percollu + 35 ml RPMI-1640 bez ludzkiej surowicy) do koncentratu hodowlanego²⁷.
6. Odwirować koncentrat kulturowy z perkolem o sile 2500 x g przez 5 minut, co daje 3 warstwy. Ostrożnie, za pomocą pipety transferowej, odizolować schizonty od środkowej warstwy, przenieść do oddzielnej probówki w warunkach aseptycznych²⁷.
7. Przemyć izolowane kultury 10% surowicą ludzką + RPMI-1640 dwukrotnie, aby usunąć nadmiar perkolu przez odwirowanie przy 7500 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant za każdym razem w warunkach aseptycznych²⁷.
8. Kontynuuj hodowlę zsynchronizowanych schizontów P. falciparum w 10% ludzkiej surowicy + RPMI-1640²⁷.
9. Zebrać schizonty, traktując erytrocyty zakażone Plasmodium 10 mM Tris pH 8,8 i wirując przy 15000 x g przez 15 minut²³. Granulki pasożytów należy przechowywać w temperaturze -70 °C po dodaniu do nich 5 μl inhibitora proteazy (aprotyniny). Użyj granulek pasożytów do ekstrakcji białek, izolacji genomowego DNA i izolacji RNA.

2. Przygotowanie wektora plazmidu

1. Wyizolować genomowe DNA z granulek schizontu P. falciparum przygotowanych z kultur około 20% parazytemii.
2. Dodać 600 μl 10mM Tris-HCl o pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS i 1 mg/ml proteinazy K do granulek w probówce do mikrowirówki, homogenizować osad za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły 26 G. Naprzemiennie napełniać strzykawkę mieszanką granulek i opróżniać ją do probówki mikrowirówkowej 20 razy. Probówkę do inkubacji zawierającą homogenat O/N w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
3. Przeprowadzić ekstrakcję fenol – chloroform (P+C) przez dodanie 600 μl P+C (300 μl fenolu i 300 μl chloroformu) do homogenizowanego osadu. Szczelnie zakręć probówkę i energicznie potrząśnij mieszaniną, odwracając rurkę od końca do końca. Odwirować probówkę o pojemności 14 000 x g przez 2 minuty i zebrać górny roztwór wodny za pomocą mikropipety do nowej probówki do mikrowirówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.
4. Dodać 600 μl chloroformu do warstwy wodnej w nowej probówce z kroku 2.1.2. Wirować probówkę przez 10 sekund i odwirowywać przy 14 000 x g przez 2 minuty. Zmierz górną warstwę wodną za pomocą mikropipety i przenieś ją do nowej probówki do mikrowirówki.
5. Dodać 0,1 obj. 5 M octanu sodu o pH 5,5 i 1 obj. izopropanolu (jeżeli warstwa wodna wynosi 300 μl, dodać 30 μl 5 M octanu sodu o pH 5,5 + 330 μl izopropanolu) do warstwy wodnej z etapu 2.1.3. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
6. Odwirować probówkę o sile 14 000 x g przez 10 minut, aby wytrącić osad DNA. Odrzucić supernatant i przepłukać osad 100 μl 70% etanolu (70 μl etanolu i 30 μl_dH2O) w celu usunięcia nadmiaru soli z DNA. Przechowywać DNA w 50 μl dH₂O w temperaturze -20 °C.
7. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu za pomocą oprogramowania lub ręcznie do amplifikacji genów P. falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 i PF3D7_0114100 wcześniej zidentyfikowanych w badaniach proteomu^16,18 z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi, aby umożliwić klonowanie sekwencji genów do wielu miejsc klonowania plazmidu ekspresyjnego pT7CFE1-CHis, jak pokazano w tabeli 2.
8. Sporządzić 50 μl mieszaniny reakcyjnej przez dodanie 5 μl wyizolowanego genomowego DNA P. falciparum, 5 μl 10x buforu, 5 μl MgCl₂, 1,5 μl startera do przodu, 1,5 μl startera odwrotnego, 0,5 μl polimerazy DNA T7 i 31,5 μl_dH2Oi przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w temperaturze 94 °C przez 8 minut w celu denaturacji, 50 °C przez 1 minutę 30 sekund w celu wydłużenia i 72 °C przez 9 minut w celu wyżarzania i renaturyzacji w celu amplifikacji genów przedstawionych w tabeli 1.
9. Rozdziel produkty PCR na 1% żelu agarozowym (1 g agarozy i 100 ml buforu EDTA (TAE) z octanu trisu)³².
10. Z żelu agarozowego odciąć pasma DNA amplifikowane metodą PCR, umieścić plastry żelu zawierające DNA w kolumnie wirowej do ekstrakcji żelu DNA i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 5 minut. Dodać 100 μl izopropanolu do zamrożonych plastrów żelu i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut.
11. Zmierzyć przepływ wodny przefiltrowany w probówce zbiorczej z kroku 2.5 za pomocą mikropipety i przenieść do nowej probówki. Dodać 0,1 obj. 5 M octanu sodu i odwirować przy 14 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i dodać 10 μl dH₂O do osadu DNA.
12. Trawić wektor ekspresyjny pT7CFE1-CHis i oczyszczone fragmenty DNA (z 2,6) w dwóch oddzielnych probówkach, dodając 3 μl plazmidu i 5 μl produktów genu PCR do każdej probówki. Do każdej probówki dodać 1 μl specyficznych enzymów restrykcyjnych, 2 μl buforu reakcyjnego i 14 μl dH₂O.
13. Dodać 3 μl strawionego plazmidu, 5 μl strawionych fragmentów DNA, 2 μl 10x buforu ligazy, 1 μl ligazy i 9 μl_dH2O do probówki do mikrowirówki. Inkubować w temperaturze 12 °C O/N.
14. Dodać 0,1 obj. 3 M octanu sodu o pH 5,5 i 2 objętości etanolu (jeśli objętość probówek do podwiązywania wynosi 20 μl, dodać 2 μl 3 M octanu sodu + 44 μl etanolu) do probówki z kroku 2.14. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez 15 minut.
15. Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, nie naruszając osadu.
16. Dodaj 100 μl 70% etanolu do granulki z kroku 2.10. Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Do osadu DNA dodać 10 μl wody wolnej od nukleaz.

3. Ekspresja białek za pomocą systemu ekspresji in vitro na komórkach ludzkich

1. Przygotować 20 μl mieszaniny transkrypcyjnej, mierząc 2 μl rekombinowanego plazmidowego DNA pT7CFE1-CHis, 4 μl 5-krotnego buforu transkrypcyjnego, 4 μl mieszaniny NTP, 2 μl polimerazy RNA T7 i 8 μl wody wolnej od nukleaz do 2-etapowej ekspresji białek ludzkich in vitro przy użyciu matryc DNA. Wymieszać składniki w probówce do mikrowirówek i inkubować przez 75 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej.
2. Pobrać 2 μl mieszaniny transkrypcyjnej i dodać ją do 23 μl mieszaniny translacyjnej zawierającej 12,5 μl lizatu komórek HeLa, 2,5 μl białek dodatkowych, 1 μl roztworu soli A, 0,5 μl aminokwasów –Met, 0,5 μl aminokwasów –Leu, 1 μl inhibitora RNAzy, 1,25 μl miksu energetycznego i 3,75 μl wody wolnej od nukleaz.
3. Mieszaninę translacyjną inkubować z kroku 3.2 w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Przechowywać przetłumaczone produkty w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować 25 μl mieszaniny transkrypcyjnej i translacyjnej, dodając 3 μl rekombinowanego plazmidowego DNA pT7CFE1-CHis, 2 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl mieszaniny reakcyjnej, 12,5 μl lizatu HeLa i 2,5 μl białek pomocniczych do 1-etapowej ekspresji białka IVT sprzężonego przez człowieka dla matryc DNA.
5. Mieszaninę reakcyjną inkubować z etapu 3.4 przez 90 minut do 6 godzin w temperaturze 30 °C. Przechowywać produkty translacji w temperaturze -20 °C.

4. Oczyszczanie ekspresji białek rekombinowanych

1. Dodać 75 μl 1x buforu oczyszczającego do 25 μl produktu translacyjnego, aby uzyskać 100 μl mieszaniny oczyszczającej.
2. Dodać 100 μl żywicy chelatującej nikiel do 100 μl mieszaniny oczyszczającej. Przepłukać żywicę niklową dwukrotnie, dodając 300 μl_dH2O i 300 μl buforu wiążącego. Ponownie zawiesić żywicę i odwirować przy 14 000 x g na 1 minutę, aby usunąć nadmiar etanolu.
3. Dodać 100 μl mieszaniny oczyszczającej z etapu 4.2 do 100 μl żywicy chelatującej nikiel i inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
4. Odwirować mieszaninę przy 14 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant do świeżej probówki oznaczonej jako "przepływowy".
5. Przepłukać żywicę 100 μl 1x buforu do przemywania (20 mM imidazolu, 250 mM NaH₂PO₄ przy pH 8, 2,5 M NaCl i dH₂O). Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant w świeżej probówce z napisem "wash". Powtórz krok 4.5 dwa razy.
6. Dodać 100 μl 1x buforu elucyjnego (100 mM Imidazolu, 250 mM Na₂PO₄ przy pH 8,0, 2,5M NaCl i_dH2O) do żywicy i inkubować przez 15 min. Wirować przy 14 000 x g przez 1 min. Wykonaj etap elucji dwukrotnie. Za każdym razem zebrać sklarowany osad do świeżych probówek do mikrowirówek i oznaczyć jako "eluat".
7. Po elucji umyj żywicę dwukrotnie, jak opisano w kroku 4.5. Przechowywać przepływowe próbki, przemywania i elucję w temperaturze -20 °C lub niższej. Żywica musi być przechowywana w temperaturze 4 °C. Użyć 30 μl każdej próbki do SDS-PAGE i analizy immunoblottingowej.

5. Test białka Coomassie (Bradford) ³⁴

1. Przygotować wzorcowe roztwory albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 20 μg/ml (zmieszać 10 μl BSA (2 mg/ml) i 90 μl_dH2O), 40 μg/ml (zmieszać 20 μl BSA (2 mg/ml) i 80 μl_dH2O), 60 μg/ml (zmieszać 30 μl BSA (2 mg/ml) i 70 μl_dH2O), 80 μg/ml (zmieszać 40 μl BSA (2 mg/ml) i 60 μl dH₂O), 100 μg/ml (zmieszać 50 μl BSA (2 mg/ml) i 50 μl dH₂O), 160 μg/ml (zmieszać 80 μl BSA (2 mg/ml) i 20 μl dH₂O) i 200 μg/ml (100 μl BSA (2 mg/ ml).
2. Zmierzyć 5 μl przepływu, przepłukać i wypłukać próbki z kroku 4.7. Dodać 95 μl dH₂O.
3. Dodać 5 ml odczynnika Coomassie blue do mieszanin z kroków 5.1 i 5.2. Przykryj probówki parafilmem i wiruj przez 10 sekund, a następnie inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną (OD) o długości fali 650 nm dla probówek białkowych z kroku 5.3. Wykreśl stężenie w funkcji odczytu OD w celu określenia stężeń białka³⁴.

6. Western Blotting

1. Do oddzielnych probówek dodać 5 μl ekstraktów schizontu z P. falciparum, 2 μl rekombinowanych białek Rhop-3 eksprymowanych przez Escherichia coli,³¹, 5 μl rekombinowanych białek eksprymowanych przy użyciu 2-etapowych i 1-etapowych systemów ekspresji u ludzi in vitro oraz 10 μl produktów białkowych oczyszczonych metodą powinowactwa.
2. Dodać bufor do próbki elektroforezy zawierający merkaptoetanol do każdej probówki w celu uzyskania końcowej objętości 20 μl, aby uzyskać rozpuszczone próbki białka. Gotuj probówki przez 2 minuty.
3. Załaduj rozpuszczone próbki białek na 10% żele SDS-PAGE, aby oddzielić białka.
4. Przenieść oddzielone białka z żeli SDS-PAGE na bibułę nitrocelulozową (NCP) przez elektroforesowanie prądem 35 mA na żel w półsuchej komorze western blotting przez 2 godziny.
5. Zablokować KPK po przeniesieniu za pomocą 2% mleka beztłuszczowego.
6. Inkubować zablokowane NCP z następującymi przeciwciałami poliklonalnymi rozcieńczonymi w stosunku 1:100 w 2% mleku, aby wykonać western blot; przeciwciało królika #676²¹ specyficzne dla rhoptri merozoitowych P. falciparum, przeciwciała mysie²⁰ specyficzne dla rutrii merozoitowych P. yoelii i P. berghei, surowice odpornościowe # 685 specyficzne dla białka wakuoli parazytoforycznej P. falciparum, SUROWICA (antygen bogaty w serynę)²² i przeciwciała specyficzne dla białka rozszczepu Maurera PfMC-2TM²⁸.
7. Inkubować NCP również w rozcieńczonej w stosunku 1:100 normalnej surowicy myszy i królika oraz supernatance z hodowli (SCS) z komórek szpiczaka SP2 jako kontroli negatywnej.
8. Inkubować KPK z przeciwciałami i kontrolami w temperaturze 4 ºC O/N.
9. Przemyć NCP 4x buforem Blot i inkubować NCP z gatunkowo specyficznymi dla gatunku przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonymi w stosunku 1:1000 w 2% mleku.
10. Przemyć NCP 4x buforem Blot. Inkubować przemyte KPK z roztworem do tworzenia barwy A + B (roztwór A: dodać 50 ml 1x Bufor do Blot i 30 μl H_2O2; Roztwór B: dodać 10 ml metanolu i 30 mg 3-chloro-naftolu) przez 30 minut w ciemności. Analizuj wyniki western blot kolorymetrycznie.

Results

Walidacja wyrażonych białek rekombinowanych poprzez reaktywność z określonymi przeciwciałami jest ważnym pierwszym krokiem w potwierdzeniu prawidłowego fałdowania wyrażonych białek. Rekombinowane białka malarii poddano ekspresji przy użyciu jednoetapowych i dwuetapowych systemów ekspresji in vitro bez komórek ludzkich. Rekombinowane białka są oczyszczane metodą powinowactwa do chelatowania Ni. Następnie użyliśmy surowic odpornościowych przeciwko całym rhoptriom merozoitowym w western blot rekombinowanych białek oddzielon...

Discussion

Ważnymi krokami do pomyślnej ekspresji białek przy użyciu dwuetapowego systemu wolnej ekspresji i oczyszczania komórek ludzkich in vitro są: 1) udana amplifikacja i klonowanie genów do wektora plazmidowego pT7CFE-CHis; 2) transkrypcja RNA w temperaturze 30^oC; 3) translacja białka w temperaturze 30 °C w obecności inhibitora RNAzy; 4) opracowanie protokołu oczyszczania opartego na powinowactwie przy użyciu kulek żywicznych pokrytych Ni oraz 5) analiza wyników na Western Blot przy użyciu przeciwciał poliklonalnyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-etapowy system ekspresji bez komórek ludzkich in vitro	Thermo Fisher	88856	Wycofany. Zawsze przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Nie rozmrażać w ciepłej wodzie
1-etapowy system translacyjny sprzężony in vitro	Thermo fischer	88860	Zawsze przechowywać w temperaturze -80 stopni C. Nie rozmrażać w ciepłej wodzie
System oczyszczania ProBond	Invitrogen	K850-01	Przechowywać w RT
Probond Żywica chelatująca nikiel	Invitrogen	R801-01	Przechowywać w temperaturze 4oC.
A+	Międzystanowy bank		Sklep w 4 & st. C.