Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół wzbogacania do izolacji bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Arthrobacter. Ten protokół wzbogacania daje szybkie i powtarzalne wyniki izolacji i amplifikacji fagów Arthrobacter z izolatów glebowych.

Streszczenie

Izolacja bakteriofagów z próbek środowiskowych jest przeprowadzana od dziesięcioleci przy użyciu zasad określonych przez pionierów mikrobiologii. Izolacja fagów infekujących gospodarzy Arthrobacter była ograniczona, być może ze względu na niski wskaźnik sukcesu wielu wcześniejszych technik izolacji, co spowodowało, że grupa fagów Arthrobacter jest niedostatecznie reprezentowana do badań. Opisana tutaj technika wzbogacania, w przeciwieństwie do wielu innych, wykorzystuje przefiltrowany ekstrakt wolny od bakterii zanieczyszczających jako bazę do wzrostu bakterii wskaźnikowych, Arthrobactersp. W szczególności KY3901. Usuwając najpierw bakterie glebowe, docelowe fagi nie są hamowane przez konkurencję z rodzimymi bakteriami glebowymi obecnymi w początkowych próbkach gleby. Ta metoda wzbogacania zaowocowała dziesiątkami unikalnych fagów z kilku różnych typów gleby, a nawet wyprodukowano różne typy fagów z tego samego wzbogaconego izolatu próbki gleby. Zastosowanie tej procedury można rozszerzyć na większość bogatych w składniki odżywcze pożywek tlenowych w celu izolacji fagów w ogromnej różnorodności interesujących bakterii gospodarza.

Wprowadzenie

Wszechobecność gatunków Arthrobacter w środowisku glebowym oferuje ogromną liczbę i różnorodność fagów, które mogą być izolowane z tego gatunku bakterii gospodarza. Bakterie z rodziny Acintobacteriaceae są najbardziej znane ze swoich katabolicznych szlaków rozkładu opornych związków, takich jak atrazyna i różne inne pestycydy i herbicydy^1,2,3. Chociaż większość badań przeprowadzono przy użyciu środowiskowych szczepów Arthrobacter, kliniczne izolaty tego rodzaju znajdują się we krwi, moczu, oczach i wielu innych źródłach ludzkich, z których wszystkie wykazują filogenetyczną heterogeniczność⁴.

Chociaż istnieje dość obszerny zbiór badań nad bakteriami Arthrobacter, tylko kilka badań donosi o fagach zdolnych do infekowania członków tego różnorodnego rodzaju. Co ciekawe, wcześniejsze prace nad fagami Arthrobacter dotykają kilku kluczowych, odrębnych tematów, takich jak typowanie gatunków Arthrobacter w glebie⁵, zastosowania przemysłowe mające na celu zmniejszenie szkodliwej piany w oczyszczalniach osadu czynnego ⁶ oraz prace skupiające się na genach rekombinacji i integracji^{specyficznych} dla danego miejsca 7.

Różne protokoły techniki wzbogacania zostały wykorzystane do generowania czystych izolatów fagów u gatunków Arthrobacter. Wczesne procedury obejmują inkubację gleby z dodatkiem czynników toksycznych, takich jak sole nikotyny, przez okres ponad jednego roku⁸ powodując powstawanie fagów zdolnych do infekowania tylko A. globiformis. Badania przeprowadzone przy użyciu gleby przesiąkniętej labilnymi substancjami organicznymi wydawały się wytwarzać wykrywalne fagi za pomocą technik oznaczania płytki nazębnej, z pominięciem długich okresów inkubacji⁸. Co ciekawe, w przeszłości stosowano technikę przypominającą bezpośrednie posiew, która doprowadziła do powstania kilku fagów, a jednocześnie miała wyjątkowo niski wskaźnik sukcesu przez badaczy⁵, powołując się na wcześniejsze badania o niskich wskaźnikach sukcesu⁸.

Ogólnie rzecz biorąc, techniki izolacji stosowane w przeszłości były godne uwagi ze względu na niewielką skuteczność w praktyce, mimo że rodzaj Arthrobacter reprezentuje najpowszechniejszy tlenowy izolat gleby w przyrodzie^4,9,,Van Twest i Kropinski¹⁰ prezentują metody wzbogacania do izolowania fagów z wody i gleby dostosowane do wcześniejszych technik stosowanych do wzbogacania środowiskowych izolatów bakteryjnych, ale te techniki wzbogacania okazały się nieskuteczne w izolowaniu Fagi Arthrobacter. Celem opisanej tutaj metody jest pokazanie "dowodu słuszności koncepcji", że metody wczesnego wzbogacania mogą być dostosowane do konsekwentnego i skutecznego izolowania fagów Arthrobacter, pokonując wcześniejsze wyzwania techniczne związane z izolacją fagów z tego rodzaju bakterii.

Protokół

1. Przygotowanie komórek Arthobacter do izolacji fagów

• Kultura Arthrobactersp. Kolonie KY3901 prążkowane na płytce agarowej Luria Bertaini (LB) inkubowane w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. Wybrać kolonię i za pomocą sterylnej pętli dodać ją do 250 ml bulionu LB w przegrodzie kolby hodowlanej i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min w temperaturze 30 °C.
• Odczekaj około 24 godzin wzrostu, aby uzyskać późne komórki fazy wykładniczej/wczesnej stacjonarnej do eksperymentów z infekcją fagową. Uważnie monitoruj stan wzrostu bakterii, aby zapobiec przechodzeniu komórek w środkowy lub późny stacjonarny stan wzrostu.
  UWAGA: Wzrost komórek powinien składać się z gęstości optycznej OD₆₀₀ między 0,5-0,7 dla procedur/etapów izolacji i oczyszczania fagów opisanych poniżej.

2. Pobieranie fagów z próbek gleby

1. Zbierz 200-400 g gleby z wybranego miejsca. Uwaga: Ponieważ bakterie z rodzaju Arthrobacter są powszechnymi bakteriami glebowymi, one i fagi, które je infekują, można znaleźć i są wszechobecne w większości rodzajów gleby.
2. Dodać co najmniej 400 ml buforu fagowego (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO,_4,10 mM Tris-CL (pH 7,5)] do gleby i wymieszać w wystarczająco dużej kolbie, aby co najmniej 200 ml PB znajdowało się w supernatancie i było możliwe do ekstrakcji.
3. Mieszaj, delikatnie mieszając lub mieszając, aż gleba zostanie zawieszona i pozwól osadowi glebowemu osiąść, zwykle 30 minut.
4. Przepuść "ekstrakt glebowy" przez bibułę filtracyjną przez filtrację grawitacyjną w celu usunięcia resztek osadu glebowego.
5. Dodaj proszek LB i wymieszaj, aby uzyskać 2% roztwór (4 g proszku LB w 200 ml ekstraktu glebowego).
6. Przepuścić roztwór przez filtr 0,22 μm przez filtrację próżniową w celu uzyskania sterylnego filtratu. Jeśli to możliwe, natychmiast przejdź do kroku 2.7. W razie potrzeby przefiltrowane próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia przed kontynuacją, jednak liczba żywotnych cząstek fagów zostanie zmniejszona.
7. Porcję wielokrotnych 50 ml wysterylizowanej przez filtr mieszaniny LB/ekstraktu glebowego rozmieścić w osobnych 250 ml wysterylizowanych, wytrząsanych, przegrodowanych kolbach hodowlanych z zachowaniem technik aseptycznych. Dodać sterylny roztwór 2,0 M CaCl₂ do końcowych pożądanych stężeń (0-50 mM), ponieważ różne fagi Arthrobacter rosną optymalnie w różnych warunkach CaCl₂.
   UWAGA: Stwierdzamy, że większość zidentyfikowanych przez nas fagów Arthrobacter mieści się w zakresie 1 mM-2,5 mM CaCl₂. Jednak kilka z wyizolowanych fagów wyhodowano przez nas wyłącznie przy 0 mM CaCl₂ lub przy bardzo wysokich stężeniach CaCl₂. Przejdź natychmiast do kroku 3.1.

3. Izolacja fagów

1. Dodać od 1 do 2,5 ml kultury bakterii w późnej fazie wykładniczej/wczesnej fazy stacjonarnej do każdej z kolb. W przypadku OD₆₀₀ od 0,5-0,7 użyj 1 ml komórek. W przypadku OD₆₀₀ wyższego niż OD 0,7 użyj 2,5 ml komórek.
   UWAGA: Komórki we wzroście fazy wykładniczej zazwyczaj dają więcej fagów i wyższe miana niż komórki we wzroście w fazie stacjonarnej.
2. Wytrząsać kolby z prędkością 250 obr./min w temperaturze 30 °C przez około 24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem.
3. Po 24-godzinnym okresie inkubacji wyjąć kolby wzbogacające z inkubatora do wytrząsania i rozcieńczyć próbki wzbogacające dziesięciokrotnie w buforze fagowym.
4. Ustawić probówki hodowlane z 0,5 ml kultury bakterii w późnej/wczesnej fazie stacjonarnej i dodać różne ilości kultury wzbogacającej (5 μl do 500 μl rozcieńczenia ^10-1 w PB) do probówek.
   UWAGA: Zaleca się badanie szerokiego zakresu stężeń, ponieważ każda próbka gleby generuje różne miana fagów po wzbogaceniu.
5. Dodać CaCl₂ do probówek hodowlanych, aby uzyskać końcowe stężenie równe stężeniu obecnemu w oryginalnej kolbie wzbogacającej. Użyj zakresu różnych stężeń CaCl₂, aby wybrać wiele fagów o różnych zależnościach CaCl₂.
   UWAGA: Większość fagów zostanie wyizolowana w zakresie CaCl₂ 1-2,5 mM, ale istnieją fagi izolowane najbardziej optymalnie w dowolnym miejscu od stężeń 0-50 mM CaCl₂. Z tego powodu najlepiej jest sprawdzić zakres stężeń CaCl₂, aby zmaksymalizować liczbę unikalnych izolowanych fagów Arthrobacter.
6. Wymieszaj 4,5 ml górnego agaru LB w probówce hodowlanej i wylej mieszaninę na płytkę agarową LB. Delikatnie zamieszać, aby równomiernie rozprowadzić na płytce i pozostawić górny agar do zestalenia się przez około 15 minut.
   UWAGA: Agar górny można przygotować w większych partiach (250 ml), a dodatkowy agar górny może być przechowywany w temperaturze pokojowej i ponownie wykorzystany do kolejnych eksperymentów przez co najmniej dwa tygodnie. Chociaż istnieją różne formuły stosowane do produkcji agaru górnego, agar górny wytwarzamy przy użyciu 7 g / l agaru zmieszanego z LB. Umieść górny agar w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C, aby zachować stan ciekły w trakcie eksperymentu.
7. Odwrócić płytkę i inkubować w żądanej temperaturze (temperatura do 30 °C) O/N do 48 godzin. Zmieniaj te warunki, aby zoptymalizować pod kątem obecnych fagów. Większość izolowanych fagów pochodzi z płytek inkubowanych w temperaturze 30 °C przy stężeniu 1-2,5 mM CaCl₂ po 24-godzinnym okresie inkubacji.

4. Oczyszczanie fagów

1. Po 24 godzinnej inkubacji sprawdź, czy na płytkach nie tworzy się płytka nazębna. Kontynuuj inkubację do 72 godzin, jeśli nie są widoczne żadne blaszki lub w celu ustalenia, czy pojawią się dodatkowe blaszki. W razie potrzeby należy przechowywać płytki z domniemanymi blaszkami przez okres do tygodnia w temperaturze 4 °C przed kontynuacją.
   UWAGA: Nierzadko zdarza się, że na jednej płytce znajduje się wiele różnych morfologii płytki. Znalezienie blaszek miażdżycowych po 3 dniach inkubacji jest możliwe, ale rzadkie.
2. Oczyść pożądane fagi z wyraźnie izolowanych blaszek za pomocą metody płytki smugowej. Dotknij płytki sterylnym drewnianym patyczkiem. Smugi na blaszce nazębnej, przesuwając drewniany patyczek przez płomień, pozwalając patyczkowi na chwilę ostygnąć, a następnie pocierając patyczek o płytkę agarową delikatnym ruchem, jak pokazano na rysunku 1. Powtórz to za pomocą czystego patyczka przy każdym przejściu.
3. Alternatywnie można użyć tradycyjnego testu miana płytki do wyizolowania pojedynczych blaszek fagowych. Test miana płytki miażdżycowej wymaga użycia większej liczby odczynników, takich jak agar LB i agar górny LB oraz materiałów, takich jak płytki Petriego do izolacji płytki fagowej. Odnieśliśmy duży sukces stosując metodę płytki smugowej, ale technicznie łatwiej jest wyizolować pojedyncze blaszki za pomocą testu miana płytki.
4. Gdy płytka agarowa LB zostanie pokryta co najmniej trzykrotnymi smugami, zaznacz obszar o najniższym stężeniu przypuszczalnych cząstek fagów i DELIKATNIE nałóż 0,5 ml Arthrobacter i 4,5 ml stopionego górnego agaru LB (zawierającego takie samo stężenie chlorku wapnia jak płytka macierzysta) i pozwól mu równomiernie rozprowadzić się po płytce.
5. Odwrócić i inkubować płytkę O/N. Powtórzyć technikę płytki smugowej przez co najmniej trzy iteracje, aby upewnić się, że wyizolowany jest czysty gatunek faga. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, w razie potrzeby między smugami, bez znaczącej utraty żywotności fagów.
6. Po wyhodowaniu i wyizolowaniu pożądanych blaszek na ostatniej płytce smugowej, dotknij jednej dobrze odizolowanej płytki nazębnej końcówką do mikropipet i ponownie zawieś w 100 μl PB. Roztwór 10:⁰ rozcieńczyć seryjnie do rozcieńczenia ^10-8, przepuszczając 20 μl próbki do 180 μl świeżego PB.
7. Dodać 10 μl każdego rozcieńczenia do 0,5 ml wyhodowanego Arthrobacter w probówce hodowlanej przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej i płytkę, mieszając zakażone bakterie z 4,5 ml stopionego górnego agaru LB zawierającego takie samo stężenie CaCl₂, jak użyto do wyizolowania faga z pierwotnej próbki gleby. Wszystkie rozcieńczenia sporządzone w temperaturze 4 °C należy zachować do następnego dnia.
8. Określ seryjne rozcieńczenie faga potrzebne do wytworzenia wzoru wstęgi za pomocą tradycyjnego testu miana płytki. Celem testu miana płytki miażdżycowej jest określenie miana faga potrzebnego do uzyskania płytki z wzorem wstęgi. Zidentyfikuj płytkę z wzorem wstęgi jako w większości pozbawioną bakterii, ale zawierającą pozostałości bakterii, które nie zostały jeszcze zlizowane przez fagi. Dodać 5 ml późno wykładniczej/wczesnej stacjonarnej kultury Arthrobacter do sterylnej kolby hodowlanej o pojemności 50 ml.
   1. Dodać 100 μl rozcieńczenia (które nadało wzór wstęgi kulturze Arthrobacter) do kolby hodowlanej i pozwolić fagom zainfekować komórki bakteryjne przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać ze stopionym agarem górnym LB zawierającym takie samo stężenie CaCl₂, jak użyte do wstępnej identyfikacji faga, i rozlać 5 ml tej mieszaniny na 10 świeżych płytek LB. Pozostawić do zestalenia i inkubacji odwróconych płytek w temperaturze 30 °C.
9. Następnego dnia należy zalać płytki wzoru wstęgi 5 ml PB i przechowywać O/N w temperaturze 4 °C lub 4 godziny w temperaturze pokojowej.
10. Przefiltrować lizat fagowy przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten końcowy zapas fagów należy wykorzystać do dodatkowych eksperymentów, takich jak obrazy cząstek fagów za pomocą mikroskopii elektronowej, izolacja genomowego DNA fagowego do analizy enzymów restrykcyjnych DNA oraz sekwencjonowanie genomu przy użyciu standardowych procedur. W celu długotrwałego przechowywania materiału fagowego należy dodać równą ilość lizatu fagowego do sterylnego glicerolu w małych fiolkach w celu archiwizacji zapasów w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Dla tych, którzy nie mają doświadczenia z tymi technikami fagowymi, doskonałym źródłem informacji jest dostępna online strona internetowa www.phagesdb.org.

Wyniki

Aby zademonstrować powtarzalność ulepszonej techniki wzbogacania fagów Arthrobacter, użyto 30 różnych próbek gleby w różnych momentach i miejscach wiosną i latem 2014 roku. Spośród tych 30 próbek gleby unikalne fagi Arthrobacter uzyskano z 22 próbek gleby pobranych przy użyciu tej procedury wzbogacania. Standardowa procedura wzbogacania pozwoliła uzyskać unikalne fagi z 3 takich samych próbek gleby. Próbki wzbogacające mogą mieć bardzo wysokie miano faga, wymagające wstępnego rozcieńczenia w celu wyizol...

Dyskusja

Pomimo wielu wcześniejszych prób wyizolowania fagów zdolnych do infekowania gospodarzy Arthrobacter , odnieśliśmy niewielki sukces przy użyciu standardowych procedur wzbogacania. Uogólniona metoda wzbogacania bakterii opracowana i zaadaptowana przez van Twesta i^{Kropińskiego10} w celu wzbogacenia fagów z próbek środowiskowych pozostaje podstawą większości procedur wzbogacania. Dowody z poprzednich badań sugerują, że metody bezpośredniego posiewu doprowadziły do powstania wykrywalnych blaszek na szczepac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion LB w proszku	Fisher	BP9722-2	Najlepiej zamawiać je hurtowo.
Agar granulowany	Fisher	BP1423-2	Najlepiej zamawiać je hurtowo.
Filtry strzykawkowe 0,22 um	Fisher	09-719A
0,22 um filtry buchnera	Fisher	430320	Ponad 50 ml płynu można uzyskać, ostrożnie wymieniając rurkę odbiorczą.
Eppendorf Probówki	Fisher	05-408-129
Pipety 5 ml indywidualne	Fisher	13-678-11D
Probówki stożkowe 50 ml	Fisher	76002844
15 ml rurki stożkowe	Fisher	76002845
10 ml pipety indywidualne	Fisher	13-676-10J
Pifle 25 ml indywidualne	Fisher	13-676-10K
Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman	Fisher	1001-824