Przedstawiamy protokół wzbogacania do izolacji bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Arthrobacter. Ten protokół wzbogacania daje szybkie i powtarzalne wyniki izolacji i amplifikacji fagów Arthrobacter z izolatów glebowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolacja bakteriofagów z próbek środowiskowych jest przeprowadzana od dziesięcioleci przy użyciu zasad określonych przez pionierów mikrobiologii. Izolacja fagów infekujących gospodarzy Arthrobacter była ograniczona, być może ze względu na niski wskaźnik sukcesu wielu wcześniejszych technik izolacji, co spowodowało, że grupa fagów Arthrobacter jest niedostatecznie reprezentowana do badań. Opisana tutaj technika wzbogacania, w przeciwieństwie do wielu innych, wykorzystuje przefiltrowany ekstrakt wolny od bakterii zanieczyszczających jako bazę do wzrostu bakterii wskaźnikowych, Arthrobactersp. W szczególności KY3901. Usuwając najpierw bakterie glebowe, docelowe fagi nie są hamowane przez konkurencję z rodzimymi bakteriami glebowymi obecnymi w początkowych próbkach gleby. Ta metoda wzbogacania zaowocowała dziesiątkami unikalnych fagów z kilku różnych typów gleby, a nawet wyprodukowano różne typy fagów z tego samego wzbogaconego izolatu próbki gleby. Zastosowanie tej procedury można rozszerzyć na większość bogatych w składniki odżywcze pożywek tlenowych w celu izolacji fagów w ogromnej różnorodności interesujących bakterii gospodarza.
Wprowadzenie
Wszechobecność gatunków Arthrobacter w środowisku glebowym oferuje ogromną liczbę i różnorodność fagów, które mogą być izolowane z tego gatunku bakterii gospodarza. Bakterie z rodziny Acintobacteriaceae są najbardziej znane ze swoich katabolicznych szlaków rozkładu opornych związków, takich jak atrazyna i różne inne pestycydy i herbicydy1,2,3. Chociaż większość badań przeprowadzono przy użyciu środowiskowych szczepów Arthrobacter, kliniczne izolaty tego rodzaju znajdują się we krwi, moczu, oczach i wielu innych źródłach ludzkich, z których wszystkie wykazują filogenetyczną heterogeniczność4.
....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek Arthobacter do izolacji fagów
- Kultura Arthrobactersp. Kolonie KY3901 prążkowane na płytce agarowej Luria Bertaini (LB) inkubowane w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. Wybrać kolonię i za pomocą sterylnej pętli dodać ją do 250 ml bulionu LB w przegrodzie kolby hodowlanej i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min w temperaturze 30 °C.
- Odczekaj około 24 godzin wzrostu, aby uzyskać późne komórki fazy wykładniczej/wczesnej stacjonarnej do eksperymentów z infekcją fagową. Uważnie monitoruj stan wzrostu bakterii, aby zapobiec przechodzeniu komórek w środkowy lub późny stacjonarny stan w....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wykazać powtarzalność ulepszonej techniki namnażania fagów Arthrobacter, wykorzystano 30 różnych próbek gleby pobranych w różnym czasie i miejscach podczas wiosny i lata 2014 roku. Z tych 30 próbek gleby, stosując tę procedurę namnażania, uzyskano unikalne fagi Arthrobacter z 22 zebranych próbek. Standardowa procedura namnażania pozwoliła na uzyskanie unikalnych fagów z 3 z tych samych próbek gleby. Próbki po namnażaniu mogą charakteryzować się bardzo wysokim mianem fagów, co wymaga wstępnego rozcie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo wielu wcześniejszych prób wyizolowania fagów zdolnych do infekowania gospodarzy Arthrobacter , odnieśliśmy niewielki sukces przy użyciu standardowych procedur wzbogacania. Uogólniona metoda wzbogacania bakterii opracowana i zaadaptowana przez van Twesta iKropińskiego10 w celu wzbogacenia fagów z próbek środowiskowych pozostaje podstawą większości procedur wzbogacania. Dowody z poprzednich badań sugerują, że metody bezpośredniego posiewu doprowadziły do powstania wykrywalnych blaszek na szczepac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Fundusze na rozwój tego protokołu zostały zapewnione przez Konsorcjum Południowo-Wschodniej Pensylwanii dla Szkolnictwa Wyższego oraz Departament Nauki Cabrini College. Dodatkowe fundusze i wsparcie pochodziły z Uniwersytetu Arcadia i Uniwersytetu Immaculata. Szczególnie dziękujemy dr Karen Snetselaar z Uniwersytetu św. Józefa za uprzejme wykonanie zdjęć mikroskopowych naszych izolowanych fagów. Dodatkowego wsparcia udzielił program Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-PHAGES).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bulion LB w proszku | Fisher | BP9722-2 | Najlepiej zamawiać je hurtowo. |
| Agar granulowany | Fisher | BP1423-2 | Najlepiej zamawiać je hurtowo. |
| Filtry strzykawkowe 0,22 um | Fisher | 09-719A | |
| 0,22 um filtry buchnera | Fisher | 430320 | Ponad 50 ml płynu można uzyskać, ostrożnie wymieniając rurkę odbiorczą. |
| Eppendorf Probówki | Fisher | 05-408-129 | |
| Pipety 5 ml indywidualne | Fisher | 13-678-11D | |
| Probówki stożkowe 50 ml | Fisher | 76002844 | |
| 15 ml rurki stożkowe | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml pipety indywidualne | Fisher | 13-676-10J | |
| Pifle 25 ml indywidualne | Fisher | 13-676-10K | |
| Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman | Fisher | 1001-824 |
Bibliografia
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
