Artykuł metodologiczny

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52782

⸱

3 maja 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Streszczenie

Komórki zwierząt, roślin i pojedynczych komórek są otoczone barierą zwaną błoną komórkową, która oddziela cytoplazmę od zewnątrz. Warstwy komórkowe, takie jak nabłonek, również tworzą barierę, która oddziela wnętrze od zewnątrz lub różne przedziały organizmów wielokomórkowych. Kluczową cechą tych barier jest zróżnicowany rozkład jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe. Dwie właściwości umożliwiają taki rozkład: 1) błony i nabłonek wykazują selektywną przepuszczalność dla określonych jonów; 2) Jony są transportowane przez pompy przez błony komórkowe i warstwy komórkowe. Właściwości te odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu fizjologii tkanek i działają jako sygnały sygnalizacyjne po uszkodzeniu, podczas naprawy lub w stanie patologicznym. Mikroelektroda samoreferencyjna jonoselektywna umożliwia pomiary określonych strumieni jonów, takich jak wapń, potas lub sód, na poziomie pojedynczych komórek i tkanek. Mikroelektroda zawiera koktajl jonoforowy, który jest selektywnie przepuszczalny dla określonego jonu. Wewnętrzny roztwór wypełniający zawiera ustalone stężenie jonu będącego przedmiotem zainteresowania. Potencjał elektryczny mikroelektrody zależy od zewnętrznego stężenia jonu. Wraz ze zmianą stężenia jonów potencjał mikroelektrody zmienia się w funkcji logarytmu aktywności jonów. Podczas przemieszczania się tam i z powrotem w pobliżu źródła lub ujścia jonu (tj. w gradiencie stężeń spowodowanym strumieniem jonów) potencjał mikroelektrody zmienia się z amplitudą proporcjonalną do strumienia/gradientu jonów. Wzmacniacz wzmacnia sygnał mikroelektrody, a wyjście jest rejestrowane w komputerze. Strumień jonów można następnie obliczyć za pomocą prawa dyfuzji Ficka przy użyciu fluktuacji potencjału elektrody, wychylenia mikroelektrody i innych parametrów, takich jak właściwa ruchliwość jonów. W artykule szczegółowo opisano metodologię pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą jonoselektywnej mikroelektrody samoreferencyjnej i przedstawiono reprezentatywne wyniki.

Wprowadzenie

Wszystkie komórki zwierzęce są otoczone dwuwarstwową błoną lipidową, która oddziela cytoplazmę od środowiska zewnętrznego. Komórka utrzymuje elektryczny potencjał błonowy, ujemny wewnątrz, poprzez aktywny transport jonów1. Potencjał błonowy jest zmagazynowanym źródłem energii, które komórka może wykorzystać do obsługi różnych urządzeń molekularnych w błonie2. Neurony i inne pobudliwe komórki mają duże potencjały błonowe. Szybkie otwarcie kanałów sodowych powoduje załamanie potencjału błonowego (depolaryzacja) i wytwarza potencjał czynnościowy, który jest transportowany wzdłuż neuronu2. Oprócz tych gwałtownych zmian elektrycznych, wiele tkanek i narządów generuje i utrzymuje znaczne długoterminowe potencjały elektryczne. Na przykład nabłonek skóry i rogówki generuje i utrzymuje potencjały transnabłonkowe i zewnątrzkomórkowe prądy elektryczne poprzez kierunkowe pompowanie jonów (głównie sodu i chlorków)3.

Podczas gdy pomiary endogennego zewnątrzkomórkowego prądu elektrycznego za pomocą sondy wibracyjnej4-6 oraz pomiary potencjałów błonowych lub trans-nabłonkowych za pomocą systemu mikroelektrod7-10 pozwalają na pomiar parametrów elektrycznych błon komórkowych i warstw komórek nabłonkowych, nie dają one żadnych wskazówek co do zaangażowanych form jonów.

Mikroelektrody z selektywnym jonoforem mogą mierzyć określone stężenie jonów w roztworze. Gradienty jonów lub strumień można mierzyć za pomocą dwóch lub więcej elektrod w różnych pozycjach. Jednak wewnętrzny dryft napięcia każdej sondy byłby inny, powodując niedokładne pomiary, a nawet wykrycie gradientu, którego nie było. Pojedyncza elektroda używana w trybie "samoreferencyjnym", w którym porusza się z niską częstotliwością między dwoma punktami, rozwiązuje ten problem. Teraz strumień jonów można zobaczyć na tle stosunkowo powolnego i stabilnego dryfu sygnału (patrz rysunek 3B).

Wrażliwy na jony system pomiarowy wykorzystuje jonoselektywne, samoreferencyjne mikroelektrody do wykrywania małych zewnątrzkomórkowych strumieni jonów w pobliżu tkanek lub pojedynczych komórek. Układ składa się ze wzmacniacza, który przetwarza sygnał z mikroelektrody oraz mikrosilnika krokowego i sterownika do sterowania ruchem mikroelektrody. Mikroelektroda jonoselektywna i elektroda odniesienia, które zamykają obwód, są połączone ze wzmacniaczem za pośrednictwem przedwzmacniacza stopnia czołowego (ilustracja 1A). Oprogramowanie komputerowe określa parametry ruchu mikroelektrody (częstotliwość, odległość), a także rejestruje wyjście wzmacniacza. Silnik krokowy steruje ruchem mikroelektrod za pomocą trójwymiarowego mikropozycjonera. Wibrująca mikroelektroda jonoselektywna o niskiej częstotliwości została po raz pierwszy opracowana w 1990 roku do pomiaru właściwego strumienia wapnia11. Oprócz wapnia dostępne są obecnie dostępne na rynku koktajle jonoforowe, które sprawiają, że mikroelektrody są wrażliwe na sód, chlorek, potas, wodór, magnez, azotany, amon, fluor, lit lub rtęć.

Zasadniczo, technika samoreferencyjnej jonoselektywnej mikroelektrody przekształca aktywność określonego jonu rozpuszczonego w roztworze na potencjał elektryczny, który może być mierzony przez woltomierz. Koktajl jonoforowy jest niemieszającą się fazą cieczową (organiczną, lipofilową) o właściwościach jonowymiennych. Jonofor selektywnie kompleksuje (wiąże) określone jony odwracalnie i przenosi je między roztworem wodnym zawartym w mikroelektrodzie (elektrolitem) a roztworem wodnym, w którym zanurzona jest mikroelektroda (ryc. 1D). Ten transfer jonów prowadzi do równowagi elektrochemicznej, a zmiana potencjału elektrycznego między mikroelektrodą a elektrodą odniesienia jest mierzona przez woltomierz. Napięcie jest proporcjonalne do logarytmu właściwej aktywności jonów zgodnie z równaniem Nernsta pozwalającym na obliczenie stężenia jonów (rys. 2A i B).

Obecnie kilka systemów pozwala na pomiar strumienia jonów przy użyciu podobnej koncepcji lub zasady. Na przykład technika skanowania elektrody jonoselektywnej (SIET)12,13 lub technika szacowania strumienia jonów mikroelektrod (MIFE) opracowana przez Newmana i Shabalę14-16 są komercyjnie dostępne i szeroko stosowane przez społeczność naukową w celu określenia określonych strumieni jonów występujących na błonie komórkowej i tkance w różnych modelach zwierzęcych, roślinnych i pojedynczych żywych komórek. Mikroelektrody jonoselektywne zostały użyte do pomiaru przepływu wodoru, potasu i wapnia przez korzenie roślin17, strumienia chlorków w tętnicach mózgowych szczurów18 i w łagiewkach pyłkowych19, strumienia wodoru w komórkach siatkówki łyżwy20, strumienia wapnia w kości myszy21, różnych strumieni jonów w strzępkach grzybów22 i w rogówce szczura23, a na koniec strumienia wapnia podczas gojenia się ran jednokomórkowych12,24. Patrz również poniższy przegląd, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych25.

Poniższy artykuł opisuje szczegółowo, jak przygotować i przeprowadzić pomiar endogennych strumieni jonów zewnątrzkomórkowych za pomocą techniki jonoselektywnej samoreferencyjnej mikroelektrody na poziomie pojedynczej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mikroelektrod z samoodniesieniem jonoselektywnym

  1. Przygotowanie mikroelektrody jonoselektywnej
    1. Cienkościenne kapilary borokrzemianowe bez filamentu (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm) za pomocą ściągacza do mikroelektrod.
      Uwaga: Daje to końcówki o średnicy 3-4 μm. Mniejsze końcówki mają wyższą rezystancję, co sprawia, że mikroelektrody są bardziej podatne na szum elektronowy, a także wiąże się z wolniejszą reakcją na zmianę stężenia jonów. Przydatne informacje można znaleźć w artykule opublikowanym przez Smith i wsp. Lokal mieszkalny 26.
    2. Silanizuj elektrody, aby wewnętrzna powierzchnia była hydrofobowa, aby pomóc w utrzymaniu lipofilowego koktajlu jonoforowego. Umieść mikroelektrody na metalowym ruszcie i podgrzej O/N w piekarniku w temperaturze >100 °C, aby je wysuszyć. Stojak to metalowa płyta z otworami o średnicy 2 mm, wywierconymi częściowo na wylot. Umieść elektrody w otworach czubkiem do góry, umieszczając nad nimi szklaną zlewkę o pojemności 250 ml.
    3. Rano wyłącz piekarnik i w ocieplanych rękawicach ostrożnie wyjmij metalowy ruszt z elektrodami i zlewką na miejscu. Zamknij drzwiczki piekarnika, aby zatrzymać ciepło.
    4. Nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura umieść kroplę roztworu silanizacyjnego I u podstawy każdej elektrody (trzymaj zlewkę na miejscu; użyj wargi do nalewania, aby uzyskać dostęp do pipety). Roztwór silanizacyjny jest odparowywany przez płytę grzejną i silanizuje wnętrze elektrod. Na tym etapie należy użyć wyciągu wyciągowego z chemikaliami. Umieść ruszt/zlewkę/elektrody z powrotem w gorącym piekarniku na kilka godzin, aby pozostały roztwór silanizacyjny odparował.
      Uwaga: Ze względów bezpieczeństwa nie włączaj ponownie piekarnika. Umieść na kuchence etykietę wskazującą, że nie wolno jej włączać, ponieważ może zawierać szkodliwe i łatwopalne opary.
    5. Po schłodzeniu przechowywać mikroelektrody w słoiku do przechowywania mikroelektrod w szklanym eksykatorze z 400 g środka osuszającego. W ten sposób mikroelektrody mogą być przechowywane przez wiele tygodni.
      Uwaga: Alternatywna metoda silanizacji została opisana w Smith i wsp.26
    6. Wypełnić mikroelektrodę 50 do 100 μl (o długości około 1 cm) roztworu zawierającego 100 mM mierzonego jonu (patrz Tabela 1 i Rysunek 1B). Użyj jednorazowej plastikowej pipety Pasteura, którą podciągnij w palniku Bunsena do drobnego filamentu. Następnie przepłukać pipetę w dH2O, aby zapobiec zablokowaniu.
      Uwaga: Alternatywnie, dostosować stężenie jonów w roztworze do wypełniania, aby dopasować je do stężenia jonów w roztworze zewnętrznym27.
    7. Obserwuj mikroelektrodę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
      1. Jeśli obecne są pęcherzyki, delikatnie postukaj w mikroelektrodę paznokciem, trzymając elektrodę pionowo (końcówką w dół) i/lub wypchnij pęcherzyki z końcówki, wywierając przeciwciśnienie za pomocą strzykawki zmodyfikowanej silikonową rurką zastępującą igłę.
    8. Napełnij końcówkę mikroelektrody 15 do 20 nl (długość 30-50 μm) specyficznego dla jonów koktajlu jonoforowego (patrz tabela 1). Umieść małą kropelkę koktajlu jonoforowego na krótkiej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Obserwuj końcówkę mikroelektrody pod mikroskopem preparacyjnym i przesuwaj ją w kierunku szkiełka mikroskopowego, aż końcówka mikroelektrody dotknie koktajlu jonoforowego tylko przez około pół sekundy. Wciągnij koktajl jonoforowy do mikroelektrody za pomocą ciśnienia kapilarnego.
      Uwaga: Unikaj długiej kolumny koktajlu jonoforowego, ponieważ zwiększa to opór elektryczny sondy, co może sprawić, że będzie ona podatna na zakłócenia elektroniczne (szumy), a także spowolni czas reakcji.
    9. Zamontuj mikroelektrodę w prostym uchwycie mikroelektrody ze złotym złączem męskim 1 mm i przewodem AgCl(Ag+) (Rysunek 1B).
    10. Przymocuj uchwyt mikroelektrody do stopnia głowicy zamontowanego na trójwymiarowym, sterowanym komputerowo elektronicznym mikropozycjonerze (Rysunek 1A).
    11. Umieść końcówkę mikroelektrody w roztworze pomiarowym odpowiednim dla mierzonej próbki (sól fizjologiczna, pożywka hodowlana itp.), aby umożliwić stabilizację mikroelektrody przez godzinę lub dwie, a nawet przez noc.
  2. Przygotowanie elektrody referencyjnej
    1. Elektrody referencyjne (rysunek 1C) to te same kapilary co powyżej. Przetnij kapilarnę ołówkiem diamentowym na odcinki o długości 5 cm i wypoleruj ogniowo na każdym końcu przez 1-2 sekundy w płomieniu Bunsena.
    2. Napełnij te elektrody ~200 μl 3 M roztworu NaCl, CH,3CO2K (octan potasu) lub KCl z 2% agarozą. Wybierz roztwór w zależności od mierzonego jonu (elektroda referencyjna nie powinna zawierać mierzonego jonu; patrz Tabela 1). Wymieszaj agarozę z roztworem i podgrzej do prawie wrzenia w kuchence mikrofalowej. Mieszaj, aby rozpuścić agarozę (roztwór staje się klarowny).
    3. Podłącz elektrodę referencyjną do plastikowej pipety Pasteura i wciągnij gorący roztwór do kapilary.
    4. Wrzuć elektrodę do zimnego roztworu 3 M NaCl, CH,3CO, 2K lub KCl i przechowuj w tym roztworze 3 M w szczelnie zamkniętych probówkach przed użyciem. Wyrzucić wszystkie elektrody referencyjne z pęcherzykami powietrza.
    5. Zamontuj elektrodę odniesienia w prostym uchwycie mikroelektrody (wstępnie wypełnionym roztworem 3 M) z osadem AgCl(Ag+) w środku i złotym złączem męskim 2 mm (Rysunek 1C), a następnie przymocuj elektrodę i uchwyt do ręcznego mikropozycjonera zamontowanego na stojaku magnetycznym.

2. Samoreferencyjny rezonans jonowy Kalibracja mikroelektrod

  1. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych zawierających jon będący przedmiotem zainteresowania, jak w roztworze odniesienia; patrz tabela 1. Umieścić w nawiasie stężenie zawarte w roztworze, w którym będzie znajdować się próbka (np. pożywka hodowlana, sól fizjologiczna). Oznacza to, że jeden roztwór kalibracyjny musi zawierać niższe stężenie jonów niż w roztworze pomiarowym, a jedno wyższe.
    1. Na przykład użyj soli fizjologicznej, która zawiera 1 mM K+. Aby określić to stężenie, rozpuść proszek KCl w wodzie dejonizowanej do stężenia 10, 1 i 0,1 mM w seryjnych rozcieńczeniach. Użyj tych roztworów kalibracyjnych. Alternatywnie możesz skorzystać z co najmniej dwóch z tych rozwiązań.
  2. Zanurz mikroelektrodę jonoselektywną i elektrodę odniesienia w każdym roztworze kalibracyjnym i pozwól, aby wartość napięcia ustabilizowała się przez 1 do 3 minut przed zarejestrowaniem odpowiedniego napięcia za pomocą dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela 1).
  3. Ponieważ oprogramowanie zapisuje dane (wyjście wzmacniacza) jako plik txt, skopiuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego. Wykreślić wartość wyjściową mikroelektrody (mV) w stosunku do logarytmu stężenia jonów molowych (rysunek 2A).
  4. Zastosuj regresję liniową i oblicz nachylenie Nernst, punkt przecięcia i wartość R2. Zaakceptuj mikroelektrodę, jeśli nachylenie Nernsta wynosi 58 ± 11 mV/dekadę dla jonów jednowartościowych i 29 ± 11 mV/dekadę dla jonów dwuwartościowych (dla kationów nachylenie Nernsta jest dodatnie, dla anionów jest ujemne). Dodatkowo dobre mikroelektrody powinny charakteryzować się silną korelacją liniową (R2 >0,9; Rysunek 2B).
    Uwaga: Zastosowane tutaj wyjście mV wzmacniacza daje odczyt mV z dziesięciokrotnym wzmocnieniem. Wartości muszą być podzielone przez współczynnik dziesięciokrotny.
  5. Użyj wzoru na regresję liniową, aby przeliczyć surową moc wyjściową mV mikroelektrody na rzeczywiste stężenie jonów (rysunek 2B).

3. Walidacja techniki mikroelektrod selektywnych jonowo

  1. Przygotowanie sztucznego źródła
    1. Kapilary ze sztucznym źródłem to te same naczynia włosowate co powyżej. Podgrzej kapilarę za pomocą ściągacza do mikroelektrod, jak w kroku 1.1.1.
    2. Wypełnić te kapilary 200 μl 1 M roztworu NaCl, KCl, CaCl22 H2O lub buforu o pH 4. Wybrać roztwór sztucznego źródła w zależności od mierzonego jonu (patrz Tabela 1).
      Uwaga: Alternatywnie, wyciągnij elektrody o większej średnicy końcówki (~20 μm) i wypełnij końcówkę tymi samymi roztworami, ale zawierającymi 0,5-1% agarozy (agaroza zapobiegnie jakiemukolwiek przepływowi roztworu).
    3. Zamontuj kapilarnę sztucznego źródła na mikromanipulatorze i zanurz ją w roztworze używanym do pomiaru strumienia jonów w próbkach. Pozostaw sztuczne źródło w roztworze na 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić stabilizację gradientu.
  2. Walidacja mikroelektrody jonoselektywnej
    1. Zanurz mikroelektrodę jonoselektywną w odległości około jednego centymetra od kapilary sztucznego źródła w roztworze używanym do pomiaru strumienia jonów na próbkach i zamknij obwód elektrodą referencyjną, jak poprzednio. Poczekaj, aż wartość napięcia ustabilizuje się przez 1 do 3 minut, a następnie zarejestrujesz odpowiednie napięcie za pomocą dedykowanego oprogramowania na 1 do 2 minut. Wartość ta odpowiada wartości buforowej (w literaturze nazywanej również wartością referencyjną, tła lub pustą).
    2. Przesuń mikroelektrodę jonoselektywną na około 5 μm od sztucznego źródła i pozwól, aby wartość napięcia ustabilizowała się przez 1 do 3 minut, zanim zarejestrujesz odpowiednie napięcie za pomocą oprogramowania na 1 do 2 minut.
    3. Powtórz powyższą procedurę, umieszczając mikroelektrodę jonoselektywną w odległości 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 i 1280 μm od kapilary sztucznego źródła.
    4. Wyodrębnij dane jako plik txt i skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego.
  3. Obliczyć stężenie jonów odpowiadające wartościom mV w taki sam sposób, jak w przypadku wartości kalibracyjnych. Wykreśl wartość.
    Uwaga: Jeśli obecny jest strumień jonów, mikroelektroda wykrywa różnicę w stężeniu jonów między dwoma położeniami (rysunek 3B). Jeżeli sztuczne źródło zawiera więcej mierzonych jonów niż roztwór, stężenie powinno być wyższe blisko źródła niż daleko, potwierdzając zdolność mikroelektrody jonoselektywnej do prawidłowego wykrywania kierunku strumienia jonów (w tym przypadku wypływu; dla sztucznego pochłaniacza, o niższym stężeniu jonów właściwych niż ośrodek pomiarowy, powinien to być napływ).
    1. Oblicz strumień jonów za pomocą prawa dyfuzji Ficka: J = c μ (dc/dx), gdzie c to stężenie jonów w roztworze (mol cm-3), μ to ruchliwość jonów (mol cm N-1 sec-1), a dc to różnica stężeń w zależności od odległości dx (cm) (rysunek 2C). Dane dotyczące strumienia jonów są zwykle prezentowane w pmol cm-2 s-1lub nmol cm-2 sec-1.
      Uwaga: Alternatywna metoda obliczania strumienia jonów opisana przez Smitha i wsp.26. Może być używany. Główne różnice obejmują zastosowanie współczynnika dyfuzji zamiast ruchliwości jonów oraz odjęcie strumienia jonów tła (również dryft napięcia lub współczynnik korekcyjny) obliczonego na podstawie pomiaru strumienia jonów w roztworze soli fizjologicznej bez próbki.
    2. Wykreślić średnią strumieni jonów każdego kroku w stosunku do odległości od źródła (rysunek 2D). Oddalając się od źródła, obserwuj wykładniczy spadek wartości strumienia, potwierdzający zdolność mikroelektrody jonoselektywnej do wykrywania różnych wielkości strumieni jonów.
    3. Przeprowadzić walidację sztucznego źródła raz dla każdego konkretnego jonu, który ma być zarejestrowany, w celu walidacji jego prawidłowych pomiarów kierunku i wielkości przy dużym stosunku sygnału do szumu.
      Uwaga: Pomiar strumienia jonów w buforze bez próbek wskazuje poziom tła lub szum. Zazwyczaj pomiar buforu nie wykazuje wyraźnych wahań stężenia jonów, co prowadzi do bardzo małego strumienia, który wykazuje zmienne kierunki.

4. Przygotowanie komory pomiarowej

Uwaga: Przed eksperymentami rozważ próbkę, która ma być mierzona, oraz sposób, w jaki próbka ma być zamontowana i unieruchomiona do pomiarów mikroelektrod.

  1. W celu pomiaru oocytów Xenopus laevis należy wyciąć 1 cm kwadrat nylonowej siatki o grubości 800 μm (siatka niteksowa) i przykleić ją do plastikowej szalki Petriego (ryc. 1E).

5. Pomiar strumienia jonów

  1. Zmierzyć stężenie jonów obecnych w buforze używanym do wykonywania pomiarów na próbce w taki sam sposób, jak w przypadku roztworu kalibracyjnego. Oocyty X. laevis wymagają zmodyfikowanego dzwonka Marka (MMR). Rozpuścić NaCl, KCl, CaCl, MgCl i HEPES w wodzie dejonizowanej, aby osiągnąć końcowe stężenie (mM): 100 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl i 5 HEPES. Dostosować pH buforu do 7,5 za pomocą NaOH.
  2. Umieścić próbkę w komorze pomiarowej i zbliżyć mikroelektrodę jonoselektywną do próbki (w odległości około 10 μm) za pomocą mikropozycjonera w celu określenia bliskiego położenia mikroelektrody (rysunek 3A).
  3. Rozpocznij odchylenie mikroelektrody o niskiej częstotliwości (0,3 Hz) (100 μm) między pozycją bliską a pozycją oddaloną od próbki (odległą) za pomocą dedykowanego oprogramowania. Upewnij się, że ruch mikroelektrody jest prostopadły do powierzchni próbki.
    Uwaga: Wychylenie mikroelektrody można ustawić w oprogramowaniu. Duży skok zwiększa odczyt gradientu, umożliwiając łatwiejsze wykrycie małych strumieni podczas pomiaru, jednocześnie wydłużając interwał próbkowania i zmniejszając rozdzielczość czasową. Zobacz rysunek 3A, aby zapoznać się z przykładem.
  4. Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania. Mikroelektroda zatrzymuje się w każdej pozycji, a potencjał elektryczny w mV jest rejestrowany w komputerze. Pomiary należy wykonywać przez co najmniej 2 minuty, co pozwala na stabilizację sygnału. W przypadku krótkich eksperymentów poklatkowych rejestruj potencjalne zmiany w pozycji zainteresowania przez cały przebieg czasu.
  5. Wyodrębnij dane jako plik txt i skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego.
  6. Obliczyć stężenie jonów odpowiadające wartościom mV w taki sam sposób, jak w przypadku wartości kalibracyjnych. Wykreśl wartość.
    Uwaga: Jeśli obecny jest strumień jonów, mikroelektroda wykrywa różnicę w stężeniu jonów między dwoma położeniami (rysunek 3B).
  7. Oblicz strumień jonów, korzystając z prawa dyfuzji Ficka, jak poprzednio (krok 3.3.1).
  8. Powtórzyć pomiar bufora przed pomiarem nowej próbki i powtórzyć procedurę pomiaru strumienia i obliczenia dla każdej nowej próbki.

6. Analiza statystyczna i prezentacja danych

  1. Zbadanie niezależnego wpływu położenia i/lub czasu na strumienie jonów w warunkach kontrolnych przy użyciu modelu ANCOVA z efektami mieszanymi28,
    Uwaga: Analiza kowariancji (ANCOVA) jest ogólnym modelem liniowym, który łączy regularną ANOVA i regresję, umożliwiając stosowanie zarówno miar kategorycznych, jak i ciągłych jako zmiennych niezależnych. Ponadto, w przypadku skorelowanych błędów wywołanych powtarzanymi pomiarami dla poszczególnych osób i ostatecznych efektów zagnieżdżonych, modele efektów mieszanych są wykorzystywane do modelowania dokładnych oszacowań zarówno efektów stałych, jak i losowych.
  2. Oblicz porównania parami za pomocą testu t-Studenta między poziomami grup z poprawką Bonferroniego dla testów wielokrotnych28.
  3. Generuj wykresy skrzynkowe, aby podsumować pomiary strumienia jonów według pozycji i czasu. Uwzględnij wartości p z opisanego powyżej wskaźnika Student t (rysunek 3D) i wskaż poziomy istotności wartości p w następujący sposób: *: p <0,05; **: p <0,01; : p <0,00129

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniej wykazaliśmy, że po uszkodzeniu pojedynczej komórki następuje napływ wapnia24. W związku z tym postanowiliśmy sprawdzić, czy po uszkodzeniu pojedynczej komórki występują inne przepływy jonowe. Wykorzystaliśmy oocyty X. laevis, które stanowią uznany model w badaniach nad gojeniem ran pojedynczych komórek30-34 oraz w rejestracjach elektrofizjologicznych24,35-39. Co ciekawe, jony potasu są bardziej skoncentrowane wewnątrz oocytów X. laevis (około 110 mM)40

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszymi etapami skutecznego pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów in vivo są: redukcja szumu, prawidłowe wykonanie mikroelektrod jonoselektywnych i elektrody referencyjnej oraz ustawienie próbki i obu elektrod.

W celu zminimalizowania hałasu, system nagrywania powinien znajdować się w uziemionej (uziemionej) klatce Faradaya, najlepiej ze stołem z metalowym blatem (izolacja drgań), który jest również uziemiony. Ponadto obudowa mikroskopu powinna być również uziemiona. Do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation MCB-0951199, a częściowo przez grant NIH EY01910, Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej granty RB1-01417 oraz przez Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzmacniacz jonowy   Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USAbrakwzmacniacza stworzonego przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAbrakoprogramowania stworzonego przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Przedwzmacniacz czołowy  Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USAINA116BSR Voltage Follower INA116, zaprojektowany przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)
Sterownik MicroStep  Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USAdopozycjonowania X, Y i Z nie są wymagane żadne trzy sterowniki MicroStep; stworzone przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z Odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)
Mikropozycjoner ręczny   Światowe instrumenty precyzyjne Model KITE-RPodobny system można kupić w Odpowiedniej elektronice(http://www.applicableelectronics.com/)
Podstawka magnetyczna     World Precision InstrumentsModel M10Podobny system można kupić w odpowiedniej elektronice(http://www.applicableelectronics.com/)
Tabela izolacji drgań   Newport Inc.         Model VW-3036-OPT-023040Podobny system można kupić w Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Część trójwymiarowego mikropozycjonera: kątownik, 90°, powierzchnie szczelinoweNewport Inc.         Model 360-90Montaż mikropozycjonera o trzech wymiarach wymaga również trzech elektrycznych silników obrotowych do sterowania X, Y, Z, ramienia montażowego MPH-1 ze słupkiem o regulowanym kącie MCA-2 oraz różnych złączy i Newport do przykręcenia do stołu wibracyjnego
Część mikropozycjonera trójwymiarowego: Etap na jaskółczy ogon do łączenia kołków 0,5 cala X TravelNewport Inc.         460PD-Xbrak
Część trójwymiarowego mikropozycjonera: Szybkomontowany stolik liniowy, 0,5 cala XY TravelNewport Inc.460A-XYbrak
Kwik-Fil cienkościenne kapilary ze szkła borokrzemianowego bez żarnika Światowe instrumenty precyzyjne TW150-4brak
Ściągacz elektrod Narishige  PC-10brak
Stojak metalowyWykonany we własnym zakresiebrakMetalowy uchwyt elektrody wykonany we własnym zakresie poprzez wiercenie otworów o szerokości 2 mm półcentymetrowych rozmieszczonych w prostokątnej podstawie ze stali o wymiarach 10 cm na 15 cm
PiekarnikQLModel 10 brak
Roztwór do silanizacji I Sigma-Aldrich85126Niebezpieczne, uchwyt zgodnie z zaleceniami dostawcy 
Szklana szalka Petriego; PyrexFisher Scientific316060brak
Słoik do przechowywania elektrod/mikropipetWorld Precision Instruments E215brak
Szklany eksykatorFisher Scientific08-595EZawiera środek osuszający Drierite (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Umieść wazelinę na uszczelce, aby była szczelna.
Plastikowa pipeta Pasteura Fisher Scientific11597722brak
Palnik BunsenaFisher ScientificS97329brak
Szkiełko mikroskopoweSigma-AldrichS8902brak
Prosty uchwyt na mikroelektrodyWarner InstrumentsQSW-A15Pze złotym złączem męskim 1 mm i drutem Ag/AgCl
Prosty uchwyt mikroelektrody World Precision InstrumentsMEH3Sz granulką AgCl(Ag+) wewnątrz i złotym złączem męskim 2 mm 
6 cm szalka PetriegoVWR60872-306brak
Siatka NitexDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750brak
Klej; Żywica epoksydowa LoctiteVWR500043-451Wymieszaj klej i utwardzacz w równych częściach w plastikowej łódce wagowej i dokładnie wymieszaj. Twardnieje szybko, ale pozostawia w RT na 24 godziny w celu pełnego utwardzenia
Woda dejonizowana Sigma-Aldrich99053brak
Chlorek soduSigma-AldrichS7653brak
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333brak
Chlorek wapniaSigma-AldrichC1016brak
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266brak
HepesSigma-AldrichH3375brak
Hydroksyd soduSigma-AldrichS8045brak
Octan potasuSigma-AldrichP1190brak
AgarozaSigma-AldrichA9539brak
laboratoryjny

Bibliografia

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411(2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar przep ywu jon w pozakom rkowychKalibracja przep ywu jon wDyfuzja zgodnie z prawem FickaZesp mikroelektrodKonwersja rejestracji napi ciaRoztw r koktajlu jonoforowegoPozycjonowanie pr bki biologicznejPrzep yw jon w potasuAnaliza gojenia ran

Powiązane artykuły