Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

33.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52793

⸱

15 maja 2015

 ,  ,  , 
1Sargent College, Boston University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Streszczenie

Ocena histologiczna biopsji mięśni posłużyła jako niezbędne narzędzie w zrozumieniu rozwoju i postępu patologii zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Jednak w tym celu należy zachować odpowiednią ostrożność podczas wycinania i konserwowania tkanek, aby uzyskać optymalne barwienie. Jedna z metod konserwacji tkanek polega na utrwaleniu tkanek w formaldehydzie, a następnie zatopieniu ich w wosku parafinowym. Ta metoda dobrze zachowuje morfologię i pozwala na długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej, ale jest kłopotliwa i wymaga obchodzenia się z toksycznymi chemikaliami. Co więcej, wiązanie formaldehydu powoduje sieciowanie antygenu, co wymaga protokołów pobierania antygenu w celu skutecznego barwienia immunologicznego. Wręcz przeciwnie, zamrożone cięcie nie wymaga utrwalenia, a tym samym zachowuje biologiczną konformację antygenu. Metoda ta zapewnia również wyraźną przewagę w krótkim czasie realizacji, co czyni ją szczególnie przydatną w sytuacjach wymagających szybkiej oceny histologicznej, takich jak śródoperacyjne biopsje chirurgiczne. Tutaj opisujemy najskuteczniejszą metodę przygotowania biopsji mięśni do wizualizacji z różnymi barwnikami histologicznymi i immunologicznymi.

Wprowadzenie

Badanie histologii mięśni odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu różnych typów zaburzeń nerwowo-mięśniowych1-4. W połączeniu z innymi technikami pozwala badaczom lepiej zrozumieć manifestację i postęp patologii, a także może być niezbędna do oceny skuteczności interwencji terapeutycznej5-10. Jednak, aby być dokładnym, tkanki muszą być zachowane w odpowiedni sposób, aby zachować stan fizjologiczny bezpośrednio przed wycięciem. Wymaga to dużej ostrożności podczas usuwania, konserwowania, krojenia i barwienia.

Tkanki mogą być przygotowane na dwa różne sposoby do mikroskopowego badania światłem. Pierwsza metoda, skrawki zatopione w parafinie (FFPE), wymaga utrwalenia tkanek w 10% naturalnym buforowanym formaldehydzie przed zatopieniem ich woskiem parafinowym11,12. Etap fiksacji pomaga lepiej zachować morfologię, ale także sieciuje białka endogenne, co wymaga skomplikowanych procedur pobierania antygenu w celu barwienia immunologicznego i eliminuje możliwość barwienia enzymatycznego na takich odcinkach12. Z drugiej strony zamrożone sekcje nie muszą być wstępnie mocowane ani przetwarzane; Dlatego białka są w stanie zachować natywne konformacje biologiczne13,14. Co więcej, zamrożone skrawki pozwalają również na szybki czas realizacji, co czasami jest konieczne, na przykład w śródoperacyjnej diagnostyce mięsaków i innych biopsjach chirurgicznych15. Jeśli jednak metoda ta nie zostanie wykonana prawidłowo, jest podatna na uszkodzenia spowodowane zamarzaniem, co wprowadza zmiany w architekturze mięśni, przez co skrawki nie nadają się do badania histologicznego. W tym artykule przedstawiono najskuteczniejszą metodę przygotowania biopsji mięśni w celu uzyskania optymalnego barwienia dla prawidłowego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie tkanek i zamrażanie tkanek mięśniowych

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu (2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan). Wykonaj ten krok w dygestoriach i użyj wtórnej metody zabezpieczania, takiej jak eksykator lub słoik dzwonowy zawierający bawełniany wacik nasączony izofluranem.
  2. Potwierdź śmierć, mocno ściskając podnóżek. Zastosuj wtórną metodę eutanazji, taką jak zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Zwilż sierść 70% alkoholem, aby zmniejszyć sklejanie się luźnych pasm włosów na mięśniach. Zdejmij skórę z kończyny za pomocą cienkich kleszczy, takich jak #5.
  4. Ostrożnie oddziel mięsień będący przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku piszczel przedni (TA)) od kości pod spodem, zaczynając od ścięgna i usuń.
  5. Wytnij mięsień, przykryj go związkiem OCT (Optimum Cutting Temperature) i połóż płasko na oznakowanej jednorazowej formie do zamrażania. Upewnij się, że mięsień jest w normalnej orientacji fizjologicznej (od głowy do ogona) bez rozciągania. Alternatywnie, zamroź mięsień na małych styropianowych kwadratach i przypnij go za pomocą szpilek przeciw owadom, aby zapewnić odpowiednią długość mięśni.
  6. Schłodzić 2-metylobutan (izopentan) w stalowej zlewce przy użyciu ciekłego azotu. Trwa to średnio 3 - 5 min. Mieszaj z przerwami, aż na dnie i ściankach zlewki zaczną tworzyć się białe osady.
    UWAGA: W takim przypadku izopentan osiągnął optymalną temperaturę zamarzania (-150 °C)
  7. Zanurz formy zawierające mięśnie w schłodzonym 2-metylobutanie. Zamroź małe mięśnie, takie jak przepona i prostownik palca długiego (EDL) na 6 - 12 sekund, a większe mięśnie, takie jak mięśnie brzuchaty łydki (GS) i triceps na 15 - 20 sekund. Nie zamrażaj mięśni zbyt długo, ponieważ może to prowadzić do pękania.
  8. Przenieś zamrożone tkanki na suchy lód i pozwól izopentanowi odparować (należy pamiętać, że proces ten trwa średnio około 15 - 20 minut). Zawiń chusteczki w folię aluminiową i przechowuj je w bardzo niskiej temperaturze (od -70 °C do -80 °C) do momentu pokrojenia.

2. Osadzanie tkanek w OCT w celu przygotowania bloku tkanek

  1. Transportuj tkanki na suchym lodzie do cyrostatu, aby zapobiec rozmrożeniu. Przenieść tkankę do komory kriostatu (ustawionej na temperaturę od -20 do -24 °C, aby uniknąć całkowitego rozmrożenia tkanek) i pozostawić je do równowagi przez 30 minut.
  2. Włącz chłodzenie wnęki Peltiera. Jeśli kriostat nie ma tego chłodzenia, użyj sprayu chłodzącego w aerozolu, aby szybko zamrozić OCT. Nie pozwól, aby mięsień rozmroził się w żadnym momencie podczas osadzania, ponieważ może to spowodować uszkodzenia spowodowane zamarzaniem.
  3. Nałóż jednolitą cienką warstwę OCT na krążek próbki i pozwól jej ostygnąć. Gdy większość OCT zostanie zamrożona na dnie, podczas gdy płyn jest nadal płynny na górze, wprowadź tkankę we właściwej orientacji (prostopadle do OCT dla odcinków poprzecznych i równolegle do OCT dla odcinków podłużnych). Użyj sprayu chłodzącego w aerozolu, aby szybko zamrozić OCT. Dotknij nieosadzonej części tkanki ekstraktorem ciepła i odczekaj 45 sekund.
  4. Dodaj kolejną cienką warstwę OCT wokół mięśnia, spryskaj sprayem chłodzącym w aerozolu i odprowadź ciepło, tak jak w poprzednim kroku.
  5. Dodawaj OCT małymi krokami i szybko zamroź OCT za pomocą kombinacji aerozolu chłodzącego w sprayu i ekstraktora ciepła, aż cały mięsień zostanie pokryty.
  6. Umieść ekstraktor ciepła na górze bloku tkanek i odczekaj 5 minut.

3. Przygotowanie sekcji i identyfikacja sekcji od środkowej części brzucha mięśni

  1. Zamontuj próbkę na głowicy próbki. Dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć dysk. Upewnij się, że krążek próbki ma dobry kontakt z głowicą próbki.
  2. Ustaw temperaturę komory w zakresie od -21 do -24 °C i poczekaj, aż zostanie osiągnięta ustawiona temperatura.
  3. Dostosuj ustawienia grubości (7 μm); przytnij blok, przesuwając lub cofając blok za pomocą ustawień zgrubnych i precyzyjnych.
  4. Zbierz skrawki na wstępnie podgrzanych dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych, dociskając górną część szkiełka do sekcji, wykorzystując przyciąganie między przeciwnymi ładunkami, aby ułatwić przyleganie wyciętych odcinków do szkiełka.
  5. Zidentyfikuj sekcje środkowego brzucha, mierząc pole przekroju poprzecznego (CSA) sekcji. Zrób to za pomocą oprogramowania do obrazowania na komputerze podłączonym do mikroskopu.
    UWAGA: Wykonywane są obrazy kontrastu fazowego, a obwód całego mięśnia jest mierzony za pomocą funkcji śledzenia w oprogramowaniu. Da to zarówno pomiary CSA, jak i minimalną średnicę fretki (miara wielkości przekroju poprzecznego włókna, która jest wyrażona jako najmniejsza odległość między dwiema równoległymi stycznymi po przeciwnych stronach cząstki). Uwaga: Kiedy pomiary CSA i minimalnej średnicy fretki zaczynają się stabilizować, osiągnięto środek brzucha.
  6. Zinwentaryzuj i zarchiwizuj szkiełka w temperaturze -80 °C do przyszłego barwienia.
    UWAGA: OCT nie musi być usuwany przed procedurami barwienia. Po nałożeniu szkiełek nakrywkowych są one natychmiast gotowe do barwienia.

4. Barwienie

UWAGA: Chociaż szczegółowe procedury krok po kroku można znaleźć w karcie produktu i należy ich przestrzegać w przypadku procedur barwienia, może być wymagana osobista optymalizacja, aby uzyskać optymalne barwienie.

  1. Ponieważ media montażowe (patrz tabela) nie mieszają się z wodą, szkiełka odwadniane przepuszczają przez coraz większe ilości alkoholu (po 2 minuty w 70%, 95% i 100% etanolu) i oczyszczają je ksylenem (100% przez 5 minut), aby zapewnić, że szkiełka nie staną się z czasem nieprzezroczyste.
  2. Szkiełko nakrywkowe i pozostaw do wyschnięcia. Obraz za pomocą mikroskopu wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Układ do pobierania i mrożenia tkanek przedstawiono na Rysunku 1. Wycięte tkanki należy przechowywać na gazie nasączonej PBS, aby zapobiec ich wysychaniu (Rysunek 1A). Po wybraniu tkanek do analizy histologicznej, należy zanurzyć je w OCT i ułożyć w formie do mrożenia w odpowiedniej orientacji oraz w stopniu jak najbliższym długości fizjologicznej, aby zapewnić dokładną morfologię (Rysunek 1B). Zawiesinę izopentanu odpowiednią do mrożenia tkanek uzyskuje się poprzez schł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Histologia i immunohistochemia zostały wykorzystane jako kluczowe narzędzia w zrozumieniu manifestacji i progresji patologii w różnych zaburzeniach nerwowo-mięśniowych. Klasycznie biopsje mięśni były najpierw utrwalane w formaldehydzie, a następnie zatapiane woskiem parafinowym. Podczas gdy wiązanie formaldehydu zachowuje architekturę tkankową i umożliwia przechowywanie i transport tkanek w temperaturze pokojowej, dezaktywuje również enzymy i białka sieciujące, co wymaga dalszych kroków w celu uzyskania dokładnego barwie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Alexowi Millerowi za poprawki w rękopisie. Praca ta została wsparta grantami badawczymi przyznanymi M.G. przez Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) i Muscular Dystrophy Association (218938).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KriostatLeica CM 1850Leica Microsystems Inc.Buffalo Grove, IL 60089 USA, telefon biurowy 1-800-248-0123
Alternatywa: Richard Allen Scientific
MikroskopNikon Eclipse 50iNikon Instruments Inc.1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500
Alternatywa: Olympus
Oprogramowanie do analizy obrazuNikon Imaging Software Badania podstawoweNikon Instruments Inc.1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500
Alternatywy: Image J, Metamorph
Izofluran14043-220-05JD Medical Dist. Co., Inc.1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 Stany Zjednoczone
PAŹ4583Sakura Inc.Torrence, CA 90501 U.S.A.
Alternatywne źródło: Leica Microsystem
Freeze It23-022524Thermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
Jednorazowa forma do tkanek22-363-554Thermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: Prowadnice VWR
Scientific Colorfrost plus9991001Thermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
Acetone650501-4LSigma-Aldrich3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR
Scientific Alkohol etylowyHC-1300-1GLThermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
2-metylobutanM 32631-SLSigma-Aldrich3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
XyleneHC-7001GAThermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
Cytoseal 2808311-4Thermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3CS402-1DThermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR
Scientific Eosin6766007Thermofisher790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.
Alternatywne źródło: VWR Scientific
Ameryki

Bibliografia

  1. Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
  2. Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
  3. Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
  4. Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
  5. Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
  6. Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
  7. Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
  8. Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
  9. Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
  10. Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
  11. Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
  12. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
  13. Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
  14. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
  15. Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriosekcja mi nimro enie sekcjizatapianie tkanekmedium OCTsekcjonowanie w kriosztaciebarwienie immunofluorescencyjnekonserwacja tkanekbiopsja mi niamontowanie preparat w na szkie kach
Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.