Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

DOI:

10.3791/52802

⸱

20 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthodontics and Craniofacial Biology, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 2Department of Biological Structure, University of Washington School of Medicine, 3Department of Biochemistry, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwłóknienie i wadliwa regeneracja mięśni mogą utrudniać funkcjonalną regenerację mięśni podniebienia miękkiego po naprawie rozszczepu podniebienia. Powoduje to uporczywe problemy z mową, połykaniem i ssaniem. Systemy hodowli in vitro, które umożliwiają badanie komórek satelitarnych (miogennych komórek macierzystych) z mięśni głowy, mają kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii opartych na inżynierii tkankowej w celu promowania regeneracji mięśni po operacji. Systemy te stworzą nowe perspektywy leczenia pacjentów z rozszczepem podniebienia. Przedstawiono protokół izolacji, hodowli i różnicowania komórek satelitarnych z mięśni głowy. Izolacja opiera się na trawieniu enzymatycznym i rozcieraniu w celu uwolnienia komórek satelitarnych. Ponadto protokół ten obejmuje innowacyjną metodę wykorzystującą powłoki żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej o rozmiarach milimetrowych, która wymaga jedynie niewielkiej liczby komórek satelitarnych do testów różnicowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około 1:500 do 1:1,000 noworodków wykazuje rozszczep obejmujący wargę i/lub podniebienie (CLP); dlatego jest to najczęstsza wrodzona wada rozwojowa u ludzi1. Mięśnie podniebienia miękkiego mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania podniebienia miękkiego podczas mówienia, połykania i ssania. Jeśli występuje szczelina podniebienia miękkiego, mięśnie te są nieprawidłowo wstawione do tylnego końca kości podniebiennej.

Podniebienie miękkie porusza się w górę i w dół podczas mowy, zapobiegając ucieczce powietrza przez nos. Dzieci z rozszczepem podniebienia nie mają tej funkcji kontrolnej, co powoduje zjawisko znane jako dysfunkcja gardła2,3. Chociaż protokoły leczenia są różne, chirurgiczna naprawa podniebienia miękkiego ma miejsce we wczesnym dzieciństwie (w wieku 6-36 miesięcy)4. Nieprawidłowo zbudowane mięśnie podniebienia miękkiego można skorygować chirurgicznie5-7, jednak dysfunkcja wewnętrzno-gardłowa utrzymuje się u 7% do 30% pacjentów2,3,8-10.

Zdolność mięśni szkieletowych do regeneracji poprzez działanie komórek satelitarnych (SC) jest dobrze znana11,12. Po urazie mięśnia SC są aktywowane i migrują do miejsca urazu. Następnie rozmnażają się, różnicują i łączą się, tworząc nowe włókna mięśniowe lub naprawiając uszkodzone13. Spoczynkowe SC wyrażają czynnik transkrypcyjny Pax714,15, podczas gdy ich potomstwo, proliferujące mioblasty, dodatkowo wyrażają miogenny czynnik determinacyjny 1 (MyoD)16. Różnicujące się mioblasty zaczynają wyrażać miogeninę (MyoG)17. Końcowe różnicowanie mioblastów jest zaznaczone przez tworzenie włókien mięśniowych i ekspresję białek specyficznych dla mięśni, takich jak łańcuch ciężki miozyny (MyHC)16,18.

Ostatnio, w medycynie regeneracyjnej zastosowano kilka strategii mających na celu poprawę regeneracji mięśni kończyn19-23. Szczegółowe badania nad mięśniami skrzelowymi głowy są również ważne, ponieważ niedawno wykazano, że różnią się one od innych mięśni pod kilkoma względami24. W przeciwieństwie do mięśni kończyn sugeruje się, że mięśnie głowy skrobakowe zawierają mniej SC25, wolniej się regenerują, a po urazie powstaje więcej włóknistej tkanki łącznej26 Ponadto proliferujące SC z mięśni skrzelowych głowy wyrażają również inne czynniki transkrypcyjne. Na przykład Tcf21, czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za tworzenie mięśni twarzoczaszki, jest silnie wyrażany w regeneracji mięśni głowy, ale prawie nie w regenerujących się mięśniach kończyn25. Mięśnie podniebienia miękkiego pacjentów z CLP są zwykle mniejsze i gorzej zorganizowane w porównaniu z normalnymi mięśniami podniebienia27,28. Zarówno wolne, jak i szybkie włókna są obecne w mięśniach podniebienia miękkiego, ale wolne włókna są bardziej obfite. Natomiast mięśnie rozszczepowe zawierają większą ilość szybkich włókien, a także zmniejszone zaopatrzenie w naczynia włosowate w porównaniu z normalnymi mięśniami podniebienia miękkiego29-31. Szybkie włókna są bardziej podatne na urazy wywołane skurczem31-33. Towarzyszące temu słabe ukrwienie naczyń włosowatych może również sprzyjać zwłóknieniu34,35. Wszystkie te aspekty mogą przyczyniać się do słabej regeneracji mięśni podniebienia miękkiego po chirurgicznym zamknięciu rozszczepu36. W związku z tym kluczowe znaczenie ma protokół izolacji i charakterystyki SC mięśni głowy skrzelowych. Daje to możliwość badania biologii SC mięśni skrzelowych głowy. Ponadto można opracować nowe terapie oparte na inżynierii tkankowej w celu wspomagania regeneracji mięśni po operacji CLP i innych schorzeniach zagrażających okolicy twarzoczaszki.

Ogólnie, SC można uzyskać po dysocjacji tkanki mięśniowej14. Mielenie, trawienie enzymatyczne i rozcieranie są na ogół wymagane do uwolnienia SC z ich niszy. SC można oczyszczać przez wstępne powlekanie na niepowlekanych naczyniach14,37,38, frakcjonowanie na Percoll39,40 lub sortowanie fluorescencyjne lub magnetyczne41-43. Tutaj przedstawiamy nowy ekonomiczny i szybki protokół izolacji komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych młodych dorosłych szczurów. Protokół ten opiera się na poprzednim manuskrypcie14 i jest specjalnie dostosowany do małych próbek tkanek. Opisano izolację SC od reprezentatywnych mięśni pochodzących z 1, 2i 4 łukuskrzelowego. Po izolacji, niewielka liczba komórek satelitarnych jest hodowana na plamkach żelu macierzy zewnątrzkomórkowej o wielkości milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć wymogu rozbudowy i przechodzenia SC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez lokalną Radę ds. Doświadczeń na Zwierzętach z Uniwersytetu Radboud w Nijmegen zgodnie z holenderskimi przepisami ustawowymi i wykonawczymi (RU-DEC 2013-205).

1. Plamki żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Na dzień przed izolacją wykonaj następujące czynności:
    1. Rozmrozić podwielokrotny żel z matrycą zewnątrzkomórkową (100 μl) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w zmodyfikowanym podłożu Eagle's firmy Dulbecco; z 4 500 mg/l glukozy, 4 mM L-glutaminą i 110 mg/ml pirogronianu sodu (DMEM). Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej należy utrzymywać przez cały czas w temperaturze 4 °C. Uwaga: Nagłe zmiany temperatury spowodują nierównomierną powłokę i tworzenie się kryształów.
    2. Rozcieńczony roztwór żelu macierzy zewnątrzkomórkowej należy przechowywać na lodzie przez 15 minut.
    3. Schładzaj mikropipetę o pojemności 20 μl przez 10 minut.
    4. Umieścić szkiełka z 8-dołkową komorą w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przenieść naczynie na zimną powierzchnię (np. opakowanie do zamrażania) na 10 minut.
    5. Użyj wstępnie schłodzonej mikropipety, aby umieścić kroplę 10 μl żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w każdym dołku. Trzymaj szalkę Petriego na zimnej powierzchni przez co najmniej kolejne 7 minut (Rysunek 1A).
    6. Całkowicie usuń pozostały żel macierzy zewnątrzkomórkowej (ryc. 1B) i wysusz studzienki w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Rozwarstwienie mięśni głowy (żwacz, dwubrzuś i dźwigacz górski veli palatini)

  1. Przed rosekcją należy przygotować 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną (P/S). Trzymaj na lodzie.
  2. Po eutanazji jednego młodego dorosłego szczura (9 tygodni) z CO2/O2 należy odciąć głowę i usunąć skórę z głowy. Przenieś głowę do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 50 ml.
  3. Mięsień żwacz (wywodzący się z 1. łuku skrzelowego)
    1. Umieść głowę jedną stroną do góry na silikonowej podkładce i przymocuj za pomocą igieł podskórnych (Rysunek 2A).
    2. Zidentyfikuj śliniankę przyuszną i nerw twarzowy (ryc. 2A). Odsłoń głęboką powięź pokrywającą gruczoł. Przetnij powięź i usuń gruczoł za pomocą nożyczek preparacyjnych. Zidentyfikuj zewnętrzny przewód słuchowy. Prześledź nerw twarzowy z otworu rylcowo-sutkowego i ostrożnie usuń gałęzie skroniowe, jarzmowe i policzkowe za pomocą ostrza skalpela nr 15.
    3. Uwolnij powierzchowną głowę mięśnia żwacza, usuwając powięź. Zidentyfikuj zarówno powierzchowne, jak i głębokie głowy mięśnia żwacza. Śledź powierzchowną głowę, aż jej grube ścięgniste rozcięgno zostanie wstawione do wyrostka jarzmowego szczęki.
    4. Oddziel ścięgno od jego pochodzenia w wyrostku jarzmowym za pomocą prostych kleszczy. Przetnij go ostrzem skalpela nr 15 lub nożyczkami do preparowania i ostrożnie żyj (Rysunek 2B).
    5. Wyciąć powierzchowną głowę żwacza do momentu jej włożenia pod kątem i dolną połową bocznej powierzchni ramienia żuchwy za pomocą ostrza skalpela nr 15 (ryc. 2C). Teraz całkowicie usuń mięsień.
  4. Tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego (wywodzący się z 2. łuku skrzelowego)
    1. Umieść głowę w pozycji leżącej na podkładce silikonowej i przymocuj za pomocą igieł podskórnych (ryc. 3A).
    2. Usuń podskórną tkankę tłuszczową pokrywającą gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Następnie usuń powierzchowną powięź i gruczoły za pomocą nożyczek preparacyjnych. Odsłoń mięsień dwubrzuścowy (przedni i tylny brzuch).
    3. Przytrzymaj przednie ścięgno tylnego brzucha prostymi kleszczami, przetnij je i ostrożnie wypreparuj, aż pojawi się w pęcherzu bębenkowym (ryc. 3B). Zrób to samo po stronie przeciwnej.
  5. Mięsień dźwigacza veli palatini (wywodzący się z 4. łuku skrzelowego)
    1. Po rozwarstwieniu tylnej części brzucha mięśnia dwubrzuścowego zlokalizuj mięsień rylcowaty, pociągnij go na bok i ostrożnie usuń (ryc. 4A).
    2. Zlokalizuj ścięgno dźwigacza veli palatini, które przyczepia się do pęcherza bębenkowego (ryc. 4A). Dokładnie go rozetnij i pokrój po obu stronach.
    3. Poszukaj tchawicy i przełyku, który biegnie za nią. Podnieś przełyk i odsłoń gardło i krtań.
    4. Zlokalizuj i wypreparuj obszar górnego mięśnia zwężającego gardło. Zidentyfikuj dźwigacz veli palatini i odetnij go po obu stronach (ryc. 4B).
      Uwaga: Bezpośrednio po rozbiorze ostrożnie usuń ścięgno i tkankę łączną z każdego mięśnia pod mikroskopem stereoskopowym. Szybko zanurz wszystkie próbki w etanolu 70% i przenieś je do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 15 ml.

3. Izolacja komórek satelitarnych

  1. Wykonaj następujące kroki przygotowawcze do izolacji SC z 3 grup mięśni:
    1. Przygotować 7,5 ml 0,1% pronazy w DMEM. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm. Wstępnie ogrzać roztwór w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed izolacją.
    2. Przygotuj 35 ml DMEM uzupełnionego 10% surowicą końską (HS) i 1% P/S. Również wstępnie ogrzany w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    3. Przygotować 15 ml pożywki hodowlanej, która składa się z DMEM uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurczaka (CEE). Wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    4. Sześć plastikowych pipet (10 ml) pokryć HS i wysuszyć przez co najmniej 10 minut przed użyciem.
  2. W kapturze hodowlanym przenieś każdy mięsień do dołka na płytce 6-dołkowej. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij mięsień na małe kawałki o wielkości około 2 mm. Uważaj, aby nie rozdrabniać tkanki zbyt mocno.
  3. Ostrożnie dodać 2,5 ml 0,1% roztworu pronazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Delikatnie wstrząsnąć płytką po 20, 40 i 60 minutach. Uwaga: Dokładny czas trwania inkubacji zależy od takich czynników, jak wiek i wyrost zwierząt.
  4. Monitoruj pod mikroskopem. Sprawdź fragmenty mięśni i zatrzymaj trawienie enzymatyczne, gdy wiązki włókien staną się luźne (ryc. 5).
  5. Dodać 2,5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówki przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
  6. Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P / S. Pipetować roztwór w górę iw dół za pomocą 10 ml plastikowej pipety (rozcieranie) co najmniej 20 razy, aby homogenizować tkankę.
  7. Odwirować probówki o stężeniu 200 x g przez 4 minuty. Zebrać sklarowany osad i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
  8. Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Ponownie odpipetować plastikową pipetą o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki łatwo przejdą przez pipetę.
  9. Odwirować probówki o sile 200 x g przez 4 minuty i zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml.
  10. Umieścić sitko (40 μm) na probówce o pojemności 50 ml i przenieść supernatant zawierający zdysocjowane komórki na filtr. Przemyć 1 ml DMEM w celu maksymalnego odzyskania komórek.
  11. Odwirować probówki o masie 1 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  12. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej o objętości 300 μl i policzyć komórki w hemocytometrze.

4. Różnicowanie komórek satelitarnych na plamkach żelowych macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać 1,5 x 103 komórki w 10 μl pożywki hodowlanej.
  2. Pokrywy szkiełek komór zabezpiecz taśmą i zaznacz miejsca czarnym markerem na spodniej stronie szkła obiektu.
  3. Za pomocą mikropipety nanieś kroplę 10 μl zawiesiny komórek na miejsce żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropla zawiesiny komórek została prawidłowo umieszczona na miejscu. Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Ostrożnie dodać 400 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnione 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% CEE) i inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: W tym momencie świeżo wyizolowane SC są poddawane masywnemu urazowi (trawienie enzymatyczne i ostre roztarcie) i muszą dojść do siebie. Nie należy zakłócać pracy komórek przez pierwsze trzy dni 37. Następnie pożywkę hodowlaną można zmienić w zależności od rodzaju eksperymentu.
    Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej można wysiewać z dużą gęstością komórek (1,5-2,5 x 103/20 μl) w celu przeprowadzenia testu różnicowania. Pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełnioną 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurczaka) można wymieniać co trzeci dzień.
  5. Alternatywnie, jeśli pożądane jest rozwijanie i przekazywanie, wykonaj następujące kroki:
    1. Rozmrozić podwielokrotny żel z matrycą zewnątrzkomórkową (500 μl) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w DMEM i postępować zgodnie z zaleceniami określonymi w ppkt 1.1.1.
    2. Schładzać pipetę o pojemności 10 ml przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść trzy kolby T75 na zimną powierzchnię (np. opakowanie do zamrażania) na 10 minut.
    4. Za pomocą wstępnie schłodzonej pipety umieścić 1 ml żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej w każdej kolbie. Sprawdź, czy powierzchnia jest całkowicie pokryta. Trzymaj kolby na zimnej powierzchni przez co najmniej kolejne 7 minut (Rysunek 1A).
    5. Całkowicie usunąć pozostały żel do macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pipety o pojemności 10 ml i suszyć studzienki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    6. Po zliczeniu zawiesić świeżo wyizolowane SC w 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurzych) i nasiona w wstępnie powlekanych kolbach T75.
    7. Po trzech dniach zmieniaj podłoże (i co trzeci dzień), aż do osiągnięcia 80% zbiegu. W celu pasażowania należy umyć kolby T75 trzykrotnie PBS. Następnie dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 °C. Zawiesić ponownie w 9 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnionej 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurzych) i wirować przy 200 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Po zliczeniu ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 1 000 μl pożywki hodowlanej i zamrozić komórki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, mięsień żwacza (jedna strona) daje 0,8-1 x 106 komórek, mięsień dwubrzuścowy (tylny brzuch) daje 1,5-2 x 105 komórek, a mięsień dźwigacza wzgórza daje 1-1,5 x 105 komórek. Wydajność komórek zależy od rodzaju mięśni, szczepu i wieku zwierzęcia. Dla porównania między trzema grupami mięśniowymi, świeżo wyizolowane SC wysiewano o tej samej gęstości komórek (1,5 x 103/10 μl). Bezpośrednio po izolacji ponad 90% świeżo wyizolowanych komórek wyraża Pax7 (ryc. 6).

Hodowle dnia 4, 7 i 10 były barwione przeciwciałami przeciwko barwieniu immunologicznemu Pax7, MyoD, MyoG i MyHC. Pięć dowolnych pól zostało policzonych dla każdej kultury za pomocą celu 20X. W 4 dniu Pax 7 i Myo D ulega ekspresji we wszystkich grupach mięśniowych (ryc. 6 i 7 i 8), jednak potomstwo SatC z mięśni żwaczy i dwubrzuścowych zaczyna wyrażać miogeninę wcześniej niż mięsień dźwigacza wzgórza podniebiennego (ryc. 9). W dniu 10 ekspresja MyoG jest silnie zmniejszona we wszystkich grupach (ryc. 9). Kilka dni po wysianiu na plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej namnażające się komórki zaczynają się łączyć i tworzyć wielojądrowe miotuby, które wyrażają łańcuch ciężki miozyny. Małe miorurki są wyraźnie widoczne w 7 dniu (ryc. 10). W 10 dniu można zaobserwować drganie mięśniówek (Wideo 1).

figure-results-1
Rycina 1: Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w szkiełku komorowym. (A) W celu łatwej manipulacji należy umieścić szkiełko z 8-dołkową komorą w szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odpipetować 10 μl żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej komory i umieścić go na zimnej powierzchni (7 min). (B) Szkiełko komorowe po usunięciu nadmiaru żelu macierzy zewnątrzkomórkowej.

figure-results-2
Rycina 2: Rozwarstwienie mięśnia żwacza. A) Głowa zwierzęcia w widoku z boku. Ucho (E), przyusznik (P) i nerw twarzowy (VII). (B) Rozcięgno ścięgniste (Te) powierzchownej głowy mięśnia żwacza (Ms) i mięśnia skroniowego (T). Oddziel ścięgno od jego przyczepu za pomocą kleszczy. (C) Ostrożnie wypreparuj mięsień, aż do jego przyczepienia się do ramusa żuchwy. E: ucho, P: ślinianka przyuszna, VII: nerw twarzowy, T: mięsień skroniowy, Ms: powierzchowna głowa mięśnia żwacza, Te: ścięgno, Mp: głęboka głowa mięśnia żwacza.

figure-results-3
Rycina 3: Rozwarstwienie tylnego brzucha mięśnia dwubrzuścowego. A) Głowa zwierzęcia w pozycji leżącej. Zlokalizuj gruczoł podżuchwowy (Sg), mięsień żwaczy (M), nerw twarzowy (VII) i mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy (SCM). Usuń gruczoł podżuchwowy. (B) Zlokalizuj mięsień dwubrzuścowy przedni (AD) i tylny brzuch (PD). Za pomocą prostych kleszczy weź przednie ścięgno tylnego brzucha, przetnij je i ostrożnie wypreparuj, aż pojawi się w pęcherzu bębenkowym (ty). E: ucho, Sg: gruczoł podżuchwowy, VII: nerw twarzowy, M: mięsień żwawcy, SMC: mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, AD: mięsień dwubrzuścowy przedniego brzucha, PD: mięsień dwubrzuścowy tylnego brzucha, Ty: pęcherz bębenkowy.

figure-results-4
Rysunek 4: Rozwarstwienie mięśnia dźwigacza wzgórza podniebiennego. (A) Widok ogólny po rozwarstwieniu mięśnia dwubrzuścowego (tylny brzuch). Mięsień rylcowo-rylcowy (St) i ścięgno dźwigacza wzgórza podniebiennego mogą być zlokalizowane. Zwróć uwagę na tchawicę (T) i przełyk (Es) biegnące za nią. (B) Po podniesieniu tchawicy i przełyku gardło (P) jest odsłonięte. Widoczny jest teraz dźwigacz veli palatini, który biegnie bocznie w kierunku podniebienia miękkiego. Strzałka wskazuje wycięty górny mięsień zwężający gardło; Zwróć uwagę na mięśnie dźwigacza wzgórza podniebiennego po obu stronach. E: ucho, St: mięsień rylcowo-brzuchowy, VII: nerw twarzowy, M: mięsień żwawcy, AD: mięsień dwubrzuścowy przedniego brzucha, PD: mięsień dwubrzuścowy tylnego brzucha, T: tchawica, Es: przełyk, P: Gardło, *mięsień dźwigacza veli palatini.

figure-results-5
Rysunek 5: Pojawienie się tkanki mięśniowej (A) przed i (B) po trawieniu enzymatycznym z pronazą. Należy pamiętać, że wiązki mięśni wydają się być rozluźnione po trawieniu enzymatycznym.

figure-results-6
Rycina 6: Barwienie immunologiczne Pax 7. Świeżo wyizolowane SC, nakładane na żel macierzy zewnątrzkomórkowej pod koniec izolacji (około 6 godzin po początkowym trawieniu tkankowym). Pięć dowolnych pól policzono przy użyciu obiektywu 10X ze średnią 210 komórek na pole. Około 90% komórek jest dodatnich na poziomie Pax 7. DAPI: niebieski, Pax7: czerwony. Podziałka liniowa, 100 μm.

figure-results-7
Rycina 7: Pax 7, barwienie immunologiczne MyoD. Posiewy dnia 4, 7 i 10 barwiono przeciwciałami przeciwko Pax7 i barwieniem immunologicznym MyoD. (A–C) i (D–F) Reprezentatywne mikrofotografie posiewów z dnia 4 i 7 z mięśnia żwacza. (G i H) Liczba jąder Pax7+ i MyoD+ w polu mikroskopowym została policzona i wyrażona jako procent całkowitej liczby jąder (DAPI). DAPI: niebieski, Pax7: czerwony i MyoD: zielony. Pasek skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Rozmieszczenie Pax7±/MyoD± w hodowlach z komórek jednojądrowych w hodowlach z mięśnia żwaczowego, dwubrzuścowego i dźwigacza górnego podniebiennego. (A–C) Posiewy dnia 4, 7 i 10 barwiono przeciwciałami przeciwko Pax7 i barwieniem immunologicznym MyoD. Całkowita liczba komórek opiera się na całkowitej liczbie jąder (DAPI). (D) Kwantyfikacja danych komórek Pax7±/MyoD±. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Barwienie immunologiczne miogeniny. Kultury dnia 4, 7 i 10 były barwione przeciwciałami przeciwko miogeninie. (A–D) Reprezentatywne mikrofotografie kultur z dnia 4 i 7 z mięśnia dźwigacza veli podniebiennego. (E) Liczba jąder MyoG+ w polu mikroskopowym została policzona i wyrażona jako procent całkowitej liczby jąder (DAPI). (F) Kwantyfikacja danych komórek MyoG +. DAPI: niebieski, Myogenin: zielony. Pasek skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Barwienie immunologiczne ciężkiego łańcucha miozyny. Posiewy dnia 4, 7 i 10 barwiono przeciwciałami przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny (MyHC). Reprezentatywne mikrofotografie 4, 7 i 10 posiewów z mięśnia dwubrzuścowego (DIG). W 7 dniu obecne są małe miotuby, podczas gdy w 10 dniu widoczne są długie i dobrze zorganizowane miotuby. Pasek skali, 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Myotube drga. Przykłady dwóch reprezentatywnych pól z drgającymi miorurkami pokazano dla posiewów z dnia 10 z mięśnia dwubrzuścowego. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SC z różnych mięśni skrzelowych głowy wyizolowano od jednego 9-tygodniowego szczura rasy Wistar i hodowano bezpośrednio na plamkach żelu macierzy zewnątrzkomórkowej bez uprzedniego rozszerzania i pasażowania. Po izolacji komórki policzono i wysiewano w tym samym zagęszczeniu komórek. W przypadku równoległej izolacji trzech różnych mięśni ta metoda trwa około 4 godzin. Aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli, krytycznym krokiem jest szybkie mycie w alkoholu 70% po rozwarstwieniu mięśni.

Podczas izolacji SC ważne jest, aby pociąć tkankę mięśniową na małe kawałki (około 2 mm), ale unikaj zbyt dużego mielenia, ponieważ spowoduje to małą wydajność komórek z powodu uszkodzenia komórek. Należy również dokładnie sprawdzić czas trwania trawienia enzymatycznego pod mikroskopem, aby uniknąć dalszych uszkodzeń. Celem trawienia jest dysocjacja włókien mięśniowych. Ponieważ ponad 90% wyizolowanych komórek wykazuje ekspresję Pax7, dalsze oczyszczanie nie jest wymagane (ryc. 6-8). Pozwala to uniknąć dodatkowych etapów oczyszczania w innych metodach, takich jak wstępne powlekanie na niepowlekanych naczyniach14,37,38, frakcjonowanie na Percoll39,40 lub sortowanie fluorescencyjne lub magnetyczne komórek41,43. W celu roztarcia konieczne jest wywołanie ścinania między fragmentami tkanki a otwarciem końcówki pipety, ponieważ umożliwia to mechaniczne uwolnienie SC. Jeśli rozcieranie pipetą o pojemności 10 ml (końcówka o średnicy wewnętrznej: 1 mm) jest trudne, można najpierw użyć pipety o pojemności 5 ml (końcówka o średnicy wewnętrznej: 2 mm). Alternatywnie, szklane pipety Pasteura mogą być cięte na żądaną średnicę i mogą być używane. Metoda ta jest prosta, skuteczna i pozwala na jednoczesną izolację SC z różnych próbek mięśniowych.

Płytki hodowlane dla SC mogą być również pokryte żelatyną lub kolagenem, ale nasze poprzednie badania pokazują, że żel macierzy zewnątrzkomórkowej jest znacznie lepszy dla utrzymania potencjału miogennego niż kolagen38. Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej o wielkości milimetra (10 μl/Ø 2 mm lub 20 μl/Ø 4 mm) umożliwiają badanie proliferacji i różnicowania SC przy ograniczonej liczbie komórek. Do testu różnicowania potrzeba około 8 do 20 razy mniej komórek w porównaniu z płytką 24-dołkową (Ø 15,6 mm) i około 80 do 200 razy mniej w porównaniu z szalkami Petriego 35 mm (Ø 35 mm)14,38.

Ponieważ żel do macierzy zewnątrzkomórkowej jest drogi, ta metoda jest również bardziej opłacalna. Ponadto prowadnice studzienki można zastąpić szkiełkami nakrywkowymi z tworzywa sztucznego, aby jeszcze bardziej obniżyć koszty. Do przygotowania plamek żelowych macierzy zewnątrzkomórkowej niezbędne jest nocne suszenie szkiełek komorowych. Ponieważ plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej są przezroczyste, konieczne jest oznaczenie plam na dolnej stronie za pomocą podświetlenia. Szkiełka komór są zamocowane na szalce Petriego w celu łatwej manipulacji. Dalsza ekspansja hodowli komórkowych nie jest konieczna, co daje możliwość badania SC mniejszych mięśni lub małych próbek mięśni. Alternatywnie, np. w przypadku PCR lub konstruktów mięśniowych, jeśli potrzebnych jest więcej komórek, świeżo wyizolowane SC można najpierw namnażać w kolbach T75, jak wskazano powyżej.

SC wyizolowane przy użyciu tego protokołu nie nadają się do dalszego oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej bezpośrednio po izolacji. Trawienie z pronazą powoduje intensywne trawienie antygenów powierzchniowych14. Surowica końska i płodowa surowica bydlęca, które są używane do hodowli komórek, muszą być najpierw odpowiednio scharakteryzowane przed izolacją, ponieważ różne numery partii w różny sposób wpływają na proliferację i różnicowanie mioblastów.

W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie mięśniami wywodzącymi się z łuków skrzelowych i mezodermy głowy (np. mięśni zewnątrzgałkowych)24. Wykazano jednoznacznie, że mięśnie głowy i kończyn mają bardzo różne właściwości. Wydaje się, że mięśnie żwaczy u starych zwierząt zachowują swoje zdolności regeneracyjne w porównaniu z mięśniami kończyn25,26. SC z mięśni zewnątrzgałkowych posiadają solidną zdolność proliferacji i różnicowania porównywalną z SC z mięśni głowy i wykazują większy potencjał wszczepienia niż SC mięśni kończyn24.

Rozkład rodzaju włókien i skład miozyny różnią się w zależności od grupy mięśni, a także między gatunkami. Mięśnie wywodzące się z pierwszego łuku skrzelowego u ludzi zawierają zarówno wolne, jak i szybkie włókna (podtypy IIA i IIX), miozyny noworodkowe i miozyny typowe dla rozwoju mięśnia sercowego. U gryzoni mięśnie te zawierają około 95% włókien szybkich: miozyny IIA i IIb)44-46. Badania nad mięśniami ptaków pokazują, że SC z różnych typów włókien mięśniowych różnią się zdolnością różnicowania. SC z szybkich włókien różnicują się tylko w szybkie włókna mięśniowe, podczas gdy SC z wolnych włókien mogą różnicować się w oba typy włókien47. Ponadto odsetek SC w szybkich włóknach mięśniowych jest niższy niż w wolnych włóknach mięśniowych48,49. Wskazuje to, że rozkład rodzaju włókien musi być brany pod uwagę w badaniach nad mięśniami w okolicy twarzoczaszki. Podobnie jak mięśnie rozszczepu podniebienia, LVP u gryzoni zawiera prawie wyłącznie włókna szybkie50. Z tego powodu SC z LVP nadają się do badań przedklinicznych w dziedzinie rozszczepu podniebienia.

Protokół ten oferuje nowe możliwości badania SC pochodzących z mięśni skrzelowych głowy lub innych mniejszych mięśni lub próbek mniejszych mięśni. Ułatwi to opracowanie nowych terapii poprawiających regenerację mięśni w okolicy szczękowo-twarzowej w stanach takich jak rozszczep podniebienia, ale także w innych schorzeniach wpływających na mniejsze mięśnie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantu Mosaic (017.009.009) od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) oraz grantu Start (S-13-167C) dla młodych badaczy z Fundacji AO. Z.Y.R jest wspierany przez National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła podskórna 25  G 0,5  x  25  mBD Microlance300400
Nożyczki preparacyjneBraunBC154R
Mikrokleszcze prosteBraunBD330R
No  15Swann-Morton0205
Alkohol 70%Denteck2,010,005
Szkiełko Permanox, 8-komoroweThermo Scientific177445
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychGreiner bio-one657160
Naczynia do hodowli komórkowych (100 x 20 mm)Greiner bio-one664160
15 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowaBD Biosciences352097
50 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowaBD Biosciences352098
Sitko do komórek (40 μ m)Gibco431750
10 ml pipeta serologicznaGreiner bio-one607180
20  &mikro; l FT20Greiner bio-one774288
Matrigel, bez czerwieni fenolowejBD Biosciences35623710 ml
PronaseCalbiochem5370210  KU
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco14190-144500 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoka glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian Gibco10569-010500 ml
Surowica bydlęca dla płodu   Fisher Scientific3600511500 ml
Surowica dla koniGibco26050088500 ml
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140-122100 ml
Ekstrakt z zarodków kurczakaMP Biomedicals285014520 ml
Ostrze skalpela chirurgicznego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gritli-Linde, A. Molecular control of secondary palate development. Developmental Biology. 301, 309-326 (2007).
  2. Marrinan, E. M., LaBrie, R. A., Mulliken, J. B. Velopharyngeal function in nonsyndromic cleft palate: relevance of surgical technique, age at repair, and cleft type. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 35, 95-100 (1998).
  3. Morris, H. L. Velopharyngeal competence and primary cleft palate surgery, 1960-1971: a critical review. The Cleft Palate Journal. 10, 62-71 (1973).
  4. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  5. Boorman, J. G., Sommerlad, B. C. Musculus uvulae and levator palati: their anatomical and functional relationship in velopharyngeal closure. British Journal of Plastic Surgery. 38, 333-338 (1985).
  6. Bae, Y. C., Kim, J. H., Lee, J., Hwang, S. M., Kim, S. S. Comparative study of the extent of palatal lengthening by different methods. Annals of Plastic Surgery. 48, 359-362 (2002).
  7. Braithwaite, F., Maurice, D. G. The importance of the levator palati muscle in cleft palate closure. British Journal of Plastic Surgery. 21, 60-62 (1968).
  8. Inman, D. S., Thomas, P., Hodgkinson, P. D., Reid, C. A. Oro-nasal fistula development and velopharyngeal insufficiency following primary cleft palate surgery--an audit of 148 children born between 1985 and 1997. British Journal of Plastic Surgery. 58, 1051-1054 (2005).
  9. Phua, Y. S., de Chalain, T. Incidence of oronasal fistulae and velopharyngeal insufficiency after cleft palate repair: an audit of 211 children born between 1990 and 2004. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 172-178 (1990).
  10. Kirschner, R. E., et al. Cleft-palate repair by modified Furlow double-opposing Z-plasty: the Children's Hospital of Philadelphia experience. Plastic and Reconstructive Surgery. 104, 1998-2010 (1999).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  12. Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: still young and fascinating at 50. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59, 1041-1059 (2011).
  13. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, 7-16 (2010).
  14. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  15. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102, 777-786 (2000).
  16. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210, 440-455 (1999).
  17. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. The Journal of Histochemistry And Cytochemistry. 54, 1177-1191 (2006).
  18. Andres, V., Walsh, K. Myogenin expression, cell cycle withdrawal, and phenotypic differentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis. The Journal of Cell Biology. 132, 657-666 (1996).
  19. Fukushima, K., et al. The use of an antifibrosis agent to improve muscle recovery after laceration. The American Journal of Sports Medicine. 29, 394-402 (2001).
  20. Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Skeletal muscle fibrosis: the effect of stromal-derived factor-1α-loaded collagen scaffolds. Regenerative Medicine. 5, 737-747 (2010).
  21. Jackson, W. M., Nesti, L. J., Tuan, R. S. Potential therapeutic applications of muscle-derived mesenchymal stem and progenitor cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 505-517 (2010).
  22. Sato, K., et al. Improvement of muscle healing through enhancement of muscle regeneration and prevention of fibrosis. Muscle, & Nerve. 28, 365-372 (2003).
  23. Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J., Halevy, O., Allen, R. E. HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells. Developmental Biology. 194, 114-128 (1998).
  24. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental biology. , (2014).
  25. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Developmental Biology. 337, 29-41 (2010).
  26. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212, 495-508 (1998).
  27. Koo, S. H., Cunningham, M. C., Arabshahi, B., Gruss, J. S., Grant, J. H. 3rd The transforming growth factor-beta 3 knock-out mouse: an animal model for cleft palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 108, 938-948 (2001).
  28. Fara, M., Brousilova, M. Experiences with early closure of velum and later closure of hard palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 44, 134-141 (1969).
  29. Lindman, R., Paulin, G., Stal, P. S. Morphological characterization of the levator veli palatini muscle in children born with cleft palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 38, 438-448 (2001).
  30. Hanes, M. C., et al. Contractile properties of single permeabilized muscle fibers from congenital cleft palates and normal palates of Spanish goats. Plastic and Reconstructive Surgery. 119, 1685-1694 (2007).
  31. Rader, E. P., et al. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from normal and congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 44, 216-222 (2007).
  32. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 113-120 (2008).
  33. Macpherson, P. C., Dennis, R. G., Faulkner, J. A. Sarcomere dynamics and contraction-induced injury to maximally activated single muscle fibres from soleus muscles of rats. The Journal of Physiology. 500 (Pt 2), 523-533 (1997).
  34. Koch, K. H., Grzonka, M. A., Koch, J. The pathology of the velopharyngeal musculature in cleft palates). Annals of Anatomy. 181, 123-126 (1999).
  35. Fara, M., Dvorak, J. Abnormal anatomy of the muscles of palatopharyngeal closure in cleft palates: anatomical and surgical considerations based on the autopsies of 18 unoperated cleft palates. Plastic and Reconstructive Surgery. 46, 488-497 (1970).
  36. Carvajal Monroy, P. L., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A., Von den Hoff, J. W. Strategies to Improve Regeneration of the Soft Palate Muscles After Cleft Palate Repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. , (2012).
  37. Grefte, S., Kuijpers, M. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Myogenic capacity of muscle progenitor cells from head and limb muscles. European Journal of Oral Sciences. 120, 38-45 (2012).
  38. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7, 055004(2012).
  39. Kastner, S., Elias, M. C., Rivera, A. J., Yablonka-Reuveni, Z. Gene expression patterns of the fibroblast growth factors and their receptors during myogenesis of rat satellite cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 1079-1096 (2000).
  40. Yablonka-Reuveni, Z., Quinn, L. S., Nameroff, M. Isolation and clonal analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle. Developmental Biology. 119, 252-259 (1987).
  41. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
  42. Gilbert, P. M., et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science. 329, 1078-1081 (2010).
  43. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  44. Sciote, J. J., Horton, M. J., Rowlerson, A. M., Link, J. Specialized cranial muscles: how different are they from limb and abdominal muscles. Cells, Tissues, Organs. 174, 73-86 (2003).
  45. Rowlerson, A., Mascarello, F., Veggetti, A., Carpene, E. The fibre-type composition of the first branchial arch muscles in Carnivora and Primates. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 4, 443-472 (1983).
  46. Muller, J., et al. Comparative evolution of muscular dystrophy in diaphragm, gastrocnemius and masseter muscles from old male mdx mice. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 22, 133-139 (2001).
  47. Feldman, J. L., Stockdale, F. E. Skeletal muscle satellite cell diversity: satellite cells form fibers of different types in cell culture. Developmental Biology. 143, 320-334 (1991).
  48. Schmalbruch, H., Hellhammer, U. The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cells. The Anatomical Record. 189, 169-175 (1977).
  49. Gibson, M. C., Schultz, E. The distribution of satellite cells and their relationship to specific fiber types in soleus and extensor digitorum longus muscles. The Anatomical Record. 202, 329-337 (1982).
  50. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PloS One. 8, e59193(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Tagi

Muscle IsolationEnzymatic DigestionExtracellular Matrix GelCell CultureMyogenic DifferentiationMuscle MarkersHead MusclesRat DissectionCell Counting

Powiązane artykuły