In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Podsumowanie

Tutaj opisano metodę lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą znakowanych DIG sond DNA 16S ukierunkowanych na rRNA. Protokół ten można zastosować do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

Streszczenie

Obecność bakterii w nabłonku kieszonkowym i leżącej pod nim tkance łącznej w biopsjach dziąseł od pacjentów z zapaleniem przyzębia została zgłoszona przy użyciu różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej, immunohistochemii lub immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla bakterii oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej. Niemniej jednak metody te nie są powszechnie stosowane ze względu na ograniczenia techniczne lub trudności. W tym miejscu wprowadzono metodę lokalizacji bakterii w tkankach osadzonych w parafinie za pomocą sond DNA znakowanych DIG. Tkanki zatopione w parafinie są najczęstszą formą tkanek biopsyjnych dostępnych w bankach patologii. Bakterie można wykrywać zarówno w sposób specyficzny dla gatunku, jak i uniwersalny. Sygnały bakteryjne są wykrywane jako dyskretne formy (ziarniak, pręcik, wrzecionowaty i owłosiony) bakterii lub formy rozproszone. Technika ta pozwala na uzyskanie innych informacji histologicznych: dobrze wyróżnia się nabłonek, tkankę łączną, nacieki zapalne i naczynia krwionośne. Metoda ta może być wykorzystana do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

Wprowadzenie

Bakterie odgrywają rolę w etiologii różnych chorób jamy ustnej, takich jak zapalenie przyzębia, zapalenie miazgi miazgowej, zapalenie okołokoronowe, zapalenie tkanki łącznej i zapalenie kości i szpiku. Aby zrozumieć rolę bakterii w patogenezie choroby i monitorować efekt leczenia, ważna jest lokalizacja bakterii w tkance. Obecność bakterii w tkance dziąsła od pacjentów z zapaleniem przyzębia wykazano przy użyciu różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej^1,2, immunohistochemii i immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla bakterii^3-7 oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)⁸ przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej ukierunkowanej na 16S rRNA. Niemniej jednak metody te nie są powszechnie stosowane ze względu na ograniczenia techniczne lub trudności. W porównaniu z przeciwciałami, sondy ukierunkowane na 16S rRNA są łatwe do wyprodukowania i osiągają swoistość gatunkową. FISH okazał się doskonałym narzędziem do wizualizacji bakterii w ich naturalnym środowisku, takim jak biofilm płytki nazębnej. Jednak zastosowanie FISH do próbek tkanek jest ograniczone ze względu na autofluorescencję różnych składników tkankowych. Na przykład silna autofluorescencja czerwonych krwinek często utrudnia zastosowanie technologii fluorescencji do tkanek objętych stanem zapalnym, gdy wiąże się to z krwawieniem⁹.

W celu zlokalizowania bakterii w tkankach dziąseł objętych stanem zapalnym, opracowano metodę hybrydyzacji in situ z użyciem sondy DNA znakowanej digoksygeniną (DIG) i z powodzeniem zastosowano^10,11. W tym artykule opisano szczegółowy protokół lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą specyficznych dla P. gingivalis i uniwersalnych sond eubakteryjnych. Szczególny nacisk kładziony jest na standaryzację metody, tak aby podobne wyniki można było odtworzyć w innych laboratoriach. Protokół ten pozwala na lokalizację bakterii w ich kontekście histologicznym, a wyniki są wysoce powtarzalne. Opisany protokół może być stosowany do lokalizacji bakterii w sposób specyficzny dla gatunku lub uniwersalny w różnych tkankach. Uniwersalna sonda jest szczególnie przydatna do wykrywania bakterii w chorobach wielodrobnoustrojowych oraz do badania potencjalnej roli bakterii w chorobach, w których rola konkretnych bakterii nie jest znana.

Protokół

1. Przygotowanie sondy

1. Amplifikacja PCR sondy
   1. W przypadku sondy specyficznej dla P. gingivalis amplifikować fragment DNA 343-pz 16S rRNA P. gingivalis metodą PCR, używając genomowego DNA P. gingivalis i następujących starterów: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' i 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'¹⁰. Wykonać amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę 20 sekund, a następnie przedłużenie o 5 minut w temperaturze^{72 °C 10,11}.
   2. Amplifikować sondę eubakteryjną za pomocą fragmentu DNA o długości 70 pz (5'-CAGGTGCTGCATGGCTCTCGTCAGCTCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3') syntetyzowany jako oligonukleotyd i następujące startery: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' i 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'¹¹. Wykonaj amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 40 cykli w temperaturze 9 4 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę 20 s, a następnie przedłużenie o 5 minut w temperaturze^{72 °C 11,12}.
   3. Produkty PCR należy wytrącić (≥500 μl), dodając 3 M octan sodu (pH 5,2) i 100% etanolu (w stosunku 10:1:2) i inkubując w temperaturze -20 °C przez 2 godziny.
   4. Odwirować mieszaninę przy 14 000 x g przez 15 minut, ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu TE i zmierzyć stężenie DNA za pomocą gęstości optycznej przy 260 nm.
2. Znakowanie DIG za pomocą zestawu do znakowania i wykrywania DNA DIG
   1. Zmieszać 3 μg sondy z wodą do końcowej objętości 15 μl.
   2. Denaturować DNA w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schłodzić na lodzie.
   3. Dodaj 2 μl 10x mieszanki heksanukleotydów, 2 μl mieszanki znakującej dNTP i 1 μl enzymu Klenowa do 15 μl zdenaturowanego DNA.
   4. Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny do 48 godzin, a następnie zatrzymać reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C.
3. Sprawdź czułość sondy znakowanej DIG za pomocą zestawu do znakowania i wykrywania DNA DIG
   1. Ręcznie załadować 1 μl seryjnych rozcieńczeń sondy kontroli dodatniej dostarczonej w zestawie i 1 ng sondy z oznaczeniem DIG na membranę nylonową i suszyć przez 5 minut w temperaturze suchej.
   2. Krótko zanurzyć błonę w 2x buforze SSC (0,3 M NaCl, 30 mM cytrynian sodu, pH 7,0) i inkubować błonę w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w celu unieruchomienia DNA.
   3. Krótko zanurzyć błonę w buforze kwasu maleinowego (MAB, 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl, pH 7,5) i inkubować z przeciwciałem sprzężonym z fosfatazą alkaliczną anty-DIG (AP) rozcieńczonym (1:5 000) w 6 ml roztworu blokującego dostarczonego w zestawie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   4. Przemyć membranę MABT (MAB zawierający 1% Tween 20) i nałożyć 40 μl roztworu NBT/BCIP zmieszanego z 2 ml buforu detekcyjnego (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl₂, pH 9,5) na membranę przez 1 min. Jeśli czułość znakowanej sondy nie jest zadowalająca, powtórz kroki od 1.1.3 do 1.3.4.
   5. Zmierz stężenie DNA znakowanej sondy (OD260) i dostosuj stężenie do 100 ng ^μl-1.
4. Sprawdź specyfikę sondy z oznaczeniem DIG
   1. Denaturacja próbek genomowego DNA (25 ng 3 ^μl-1 na każdą próbkę) różnych gatunków bakterii, w tym bakterii, której celem jest specjalna sonda, w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schładzać na lodzie.
   2. Ręcznie załaduj zdenaturowane DNA na nylonową membranę i susz przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Krótko zanurzyć błonę w buforze 2x SSC i inkubować błonę w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w celu unieruchomienia DNA.
   4. Zablokuj membranę roztworem blokującym w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
   5. Rozcieńczyć sondę przy 1 ng ^μl-1 w buforze hybrydyzacyjnym, zdenaturować rozcieńczone sondy i nałożyć na membranę.
   6. Inkubować błonę w temperaturze 45 °C przez 1 godzinę.
   7. Przemyć membranę trzykrotnie buforem 2x SSC.
   8. Krótko namocz membranę w MAB.
   9. Inkubować z przeciwciałem sprzężonym z anty-DIG AP rozcieńczonym (1:2 000) w 6 ml roztworu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   10. Przemyć membranę MABT i nałożyć 40 μl roztworu NBT/BCIP zmieszanego z 2 ml buforu detekcyjnego.
   11. Gdy sonda nie osiąga oczekiwanej swoistości, należy zwiększać temperaturę hybrydyzacji, aż do zaobserwowania swoistości.

2. Hybrydyzacja in situ

Uwaga: Aby uniknąć wysuszenia próbek i odczynników, wszystkie inkubacje wykonuj w wilgotnej komorze wyłożonej mokrymi ręcznikami papierowymi.

1. Deparafinizacja i rehydratacja skrawków tkanek
   1. Przygotować skrawki tkanek o grubości 4 μm z bloków zatopionych w parafinie. Formalina, paraformaldehyd i utrwalacz na bazie są zgodne z tym protokołem.
   2. Przygotuj wszystkie odczynniki, używając wody uzdatnionej przez DEPC.
   3. Podgrzewać szkiełka w suchym piecu w temperaturze 60 °C przez 30 minut i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   4. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie na 5 minut trzy razy; za każdym razem używaj świeżego ksylenu.
      Uwaga: Wykonaj tę procedurę usuwania wosku w dygestoriach chemicznych.
   5. Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 5 minut dwukrotnie, za każdym razem używając świeżego etanolu, a następnie ponownie uwodnij próbki w seryjnych roztworach etanolu 90%, 80% i 70% na 5 minut każdy.
   6. Zanurz szkiełka w wodzie uzdatnionej DEPC na 1 minutę i umyj szkiełka w PBS poddanym DEPC (pH 7,4) przez 6 minut.
2. Wstępne zabiegi skrawków tkanek
   1. Zanurz szkiełka w 0,1 N kwasie solnym na 20 minut i umyj szkiełka w wodzie uzdatnionej przez DEPC przez 30 sekund.
   2. Narysuj hydrofobową barierę otaczającą próbki za pomocą pisaka woskowego.
      Uwaga: Wielkość bariery hydrofobowej zależy od wielkości próbek. W związku z tym objętości odczynników stosowanych w kolejnych etapach różnią się w zależności od wielkości próbek, ale muszą wypełniać barierę hydrofobową (50 μl dla małych próbek i 400 μl dla dużych próbek).
   3. Próbki należy traktować 50 do 400 μl proteinazy K (1 do 10 μg ^ml-1 w PBS poddanym działaniu DEPC) w suchym piecu w temperaturze 37 °C przez 30 minut i myć szkiełka w 1x PBS poddanych działaniu DEPC przez 1 min.
   4. Namocz szkiełka w 4% paraformaldehydzie w PBS poddanym działaniu DEPC przez 10 minut, a następnie umyj szkiełka w PBS poddanym działaniu DEPC przez 1 minutę.
   5. Moczyć szkiełka w 0,1 M trietanoloamino-HCl (pH 8,0) zawierającym 0,5% bezwodnika octowego przez 20 minut i myć szkiełka w wodzie uzdatnionej przez DEPC przez 30 sekund.
3. Hybrydyzacja z sondą i myciem
   1. Zanurz slajdy w buforze 2x SSC na 20 minut.
   2. Rozcieńczyć sondę przy 1 ng ^μl-1 w buforze hybrydyzacyjnym (4x SSC, 50% [vol/vol] formamid, 1x roztwór Denhardta, 10% [wt/vol] siarczan dekstranu, 0,1% [wt/vol] dodecylosiarczan, 0,4 mg ^ml-1 DNA plemników łososia). W przypadku kontroli ujemnych należy zmieszać oznakowaną sondę z 10-krotnym nadmiarem nieznakowanej sondy.
   3. Rozcieńczone sondy poddać denaturacji i nałożyć od 50 do 400 μl na skrawki tkanki. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i uszczelnij lakierem do paznokci.
   4. Podgrzewać szkiełka w maszynie do PCR w temperaturze 90 °C przez 10 minut i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze O/N w temperaturze 45 °C lub optymalnej temperaturze określonej w kroku 1.4.11.
   5. Schłodzić szkiełka w temperaturze 4 °C przez 30 minut, usunąć szkiełka nakrywkowe i zanurzyć je w szeregowym buforze SSC w następujący sposób: 4x SSC przez 10 min, wstępnie podgrzane (45 °C) 2x SSC przez 20 min, 2x SSC przez 10 min i 0,2x SSC przez 10 min.
4. Wykrywanie za pomocą przeciwciała sprzężonego z anty-DIG AP
   1. Myj szkiełka w MABT przez 5 minut.
   2. Blokuj od 50 do 400 μl roztworu blokującego z 1% Tween 20 przez 20 minut.
   3. Dodać 50 do 400 μl przeciwciała anty-DIG-AP rozcieńczonego w roztworze blokującym (1:1 000) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
   4. Myć szkiełka w MABT przez 10 min.
   5. Zanurz slajdy w buforze detekcji zawierającym 1% Tween 20 na 5 minut.
   6. Traktować od 50 do 400 μ 1 mM lewamizolu (w buforze wykrywającym zawierającym 1% Tween 20) przez 5 minut, aby dezaktywować endogenną fosfatazę alkaliczną.
   7. Rozprowadzić 50 do 400 μl wstępnie zmieszanego roztworu NBT/BCIP (rozcieńczonego w buforze detencyjnym w stosunku 1:100) na każdą próbkę i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 do 3 godzin, aż do uzyskania uzyskanego sygnału.
   8. Spłucz szkiełka wodą dejonizowaną, aby zatrzymać wizualizację i nałóż od 50 do 400 μl 0,05% [wt/vol] zieleni metylowej jako przeciwbarwnika w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   9. Opłucz szkiełka wodą dejonizowaną, odwodnij w 100% etanolu i zanurz w ksylenie.
   10. Nałożyć 80 μl roztworu montażowego na każde szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkami nakrywkowymi.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje kropkowanie sond oznaczonych DIG w porównaniu z sondą kontroli pozytywnej dołączoną do zestawu, aby określić ich czułość. Sonda specyficzna dla P. gingivalis o ciśnieniu 343 pz jest 25 razy bardziej czuła niż sonda eubakteryjna o pz. Rycina 2 przedstawia hybrydyzację in situ tkanek dziąseł uzyskanych od pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia w celu wykrycia P. gingivalis i eubacteria. Sygnały bakteryjne, zaznaczone na fioletowo, wykryto...

Dyskusja

W tym artykule opisano protokół lokalizacji bakterii w tkankach osadzonych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej DIG. Sonda celuje w cząsteczki DNA lub RNA bakteryjnego genu 16S rRNA, a sondy ukierunkowane na 16S rRNA mogą być zaprojektowane jako specyficzne dla gatunku lub uniwersalne. Specyficzna hybrydyzacja sondy specyficznej dla P. gingivalis z P. gingivalis, ale nie z innymi bakteriami jamy ustnej, została wcześniej wykazana¹⁰. W przeciwieństwie do tego, sonda eubakteryjna zhybrydy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezwodnik octowy	Sigma	6404
50% roztwór siarczanu dekstranu	Millipore	S4030
50X Denhardt' s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG Zestaw do znakowania i wykrywania DNA	Roche	11 093 657 910
Formamid	Sigma	F9037
ImmEdge™ Długopis	Dako	H-400
Lewamizol	Vector	SP-5000
Chlorek magnezu	Sigma	246964
Kwas maleinowy	Sigma	M0375
Zieleń metylowa	Sigma	M6776
Paraformaldehyd	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Roztwór DNA plemników łososia	Invitrogen	#15632-011
Chlorek sodu	Sigma	S9625
Cytrynian sodu	Duksan	D1420
Dodecylosiarczan sodu	Amresco	227
Trietanoloamina-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Badania organiczne	3098T