Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Summary

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Abstract

Pomimo dziesięcioleci wysiłków na rzecz wyeliminowania, malaria pozostaje globalnym obciążeniem. Niedawnemu wznowieniu zainteresowania regionalną eliminacją i globalną eradykacją towarzyszy zwiększona ilość informacji genomicznych na temat gatunków pasożytów Plasmodium odpowiedzialnych za malarię, w tym charakterystyka populacji geograficznych, a także różnice związane ze zmniejszoną podatnością na leki przeciwmalaryczne.

Jedna powszechna odmiana genetyczna, polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), oferuje atrakcyjne cele dla genotypowania pasożytów. Markery te są przydatne nie tylko do śledzenia markerów oporności na leki, ale także do śledzenia populacji pasożytów przy użyciu markerów, które nie są pod presją leków lub innych selektywnych nacisków.

Metody genotypowania SNP oferują możliwość śledzenia oporności na leki, jak również odcisków palców poszczególnych pasożytów w celu nadzoru populacji, szczególnie w odpowiedzi na wysiłki mające na celu kontrolę malarii w regionach zbliżających się do stanu eliminacji.

Chociaż zidentyfikowano informacyjne SNP, które są niezależne od konkretnych technologii genotypowania, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest szczególnie przydatna do badań terenowych. W porównaniu ze standardowymi metodami opartymi na sondzie fluorescencyjnej, które wymagają pojedynczych SNP w jednej znakowanej sondzie i oferują co najwyżej 10% czułość wykrywania SNP w próbkach zawierających wiele genomów (poligenomicznych), HRM oferuje czułość 2-5%. Modyfikacje HRM, takie jak zablokowane sondy i asymetryczne stężenia starterów, a także optymalizacja temperatur wyżarzania amplifikacji w celu odchylenia PCR w kierunku amplifikacji mniejszego allelu, dodatkowo zwiększają czułość HRM. Chociaż poprawa czułości zależy od konkretnego testu, zwiększyliśmy czułość wykrywania do mniej niż 1% allelu mniejszego.

W regionach zbliżających się do eliminacji malarii, wczesne wykrycie pojawiającej się lub importowanej oporności na leki jest niezbędne do szybkiej reakcji. Podobnie, zdolność do wykrywania infekcji poligenomicznych i odróżniania importowanych typów pasożytów od tajemniczych lokalnych rezerwuarów może informować programy kontrolne.

Ten manuskrypt opisuje modyfikacje technologii topnienia o wysokiej rozdzielczości, które jeszcze bardziej zwiększają jej czułość do identyfikacji infekcji poligenomicznych w próbkach pobranych od pacjentów.

Introduction

Pomimo ponownego zainteresowania kontrolą i zwalczaniem malarii, malaria pozostaje światowym obciążeniem, z prawie połową światowej populacji zagrożonej infekcją i ponad 550 000 zgonów rocznie, szczególnie dzieci w Afryce Subsaharyjskiej¹.

Te nowe programy kontroli i eliminacji były wspierane przez renesans genomu, z dużą liczbą pasożytów malarii zsekwencjonowanych i przeanalizowanych pod kątem mutacji związanych ze zmniejszoną wrażliwością na leki, zwiększoną zjadliwością i cechami populacji^2,3. Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) należą do najczęściej identyfikowanych wariantów genetycznych ^4-7.

Przenośne metody genotypowania SNP oferują nadzór i śledzenie populacji na miejscu i w czasie rzeczywistym⁸. Oprócz pobierania odcisków palców od poszczególnych pasożytów, "molekularny kod kreskowy" jest również wykorzystywany do wykrywania dramatycznych zmian czasowych w częstości występowania alleli, a także wariancji, efektywnej wielkości populacji i złożoności infekcji⁹.

Chociaż ten zestaw informacyjnych SNP można łatwo dostosować do wielu platform genotypowania, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest szczególnie dobrze dopasowana do badań terenowych, gdzie czuła i prosta obsługa oraz wykrywanie nowych mutacji przy niskich kosztach w porównaniu do sekwencjonowania i innych podejść jest atrakcyjna w warunkach ubogich w zasoby.

HRM zaczyna się od standardowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która zawiera barwnik fluorescencyjny. Analiza topnienia po PCR określa szczytową temperaturę topnienia amplikonu; pojedyncza różnica SNP w krótkim amplikonie może skutkować znacznymi różnicami szczytowej temperatury topnienia (Tm).

Kilka udoskonaleń tej metody oferuje lepszą rozdzielczość genotypowania, aby rozróżnić SNP, w tym SNP klasy IV (A-T), i wykryć mniejsze zmutowane allele w próbkach z obecnymi wieloma allelami (infekcje poligenomiczne). Po pierwsze, testy obejmują krótkie sondy wyśrodkowane w regionie SNP, a także startery do przodu i do tyłu, które są obecne w różnych stężeniach. Te zablokowane sondy nie są amplifikowane podczas PCR, ale wiążą się z nicią wytwarzaną w nadmiarze z powodu asymetrycznych stężeń starterów, które zwiększają produkcję produktu matrycy sondy. Te oddzielne dwuniciowe amplikony składające się z sondy związanej z nadmiarem nici matrycowej mają ~ 20-30 pz; ich znacznie zmniejszona długość w porównaniu z całym amplikonem (80-150 pz) prowadzi do znacznie większych różnic Tm związanych z niedopasowaniem pojedynczej lub wielokrotnej sondy bazowej do matrycy¹⁰.

Po drugie, błąd amplifikacji zmutowanego allelu (MAAB) obniża temperaturę wyżarzania reakcji, aby odchylić reakcję w kierunku zmutowanych alleli obecnych w niskich proporcjach w infekcjach poligenomicznych. Temperatura wyżarzania jest ustawiana między Tms idealnie dopasowanych (typu dzikiego) i niedopasowanych (zmutowanych) sond. W tej temperaturze wiązanie allelu typu dzikiego jest na tyle stabilne, że amplifikacja jest utrudniona w porównaniu z jego odpowiednikiem niedopasowania, co powoduje odchylenie amplifikacji w kierunku zmutowanego allelu, gdy oba są obecne w jednej próbce¹⁰.

Dzięki tym udoskonaleniom HRM, technologia ta umożliwiła śledzenie pochodzenia i tożsamości pasożytów związanych z infekcjami epidemicznymi w Ameryce Południowej¹¹ oraz wykrywanie nowych mutacji, różnicowanie wielu SNP znajdujących się bezpośrednio obok siebie w sekwencji, oraz mutacje obecne w mniej niż 1% alleli w próbkach poligenomicznych¹⁰.

Zwiększona czułość jest szczególnie ważna w regionach zbliżających się do stanu pre-eliminacji oraz w regionach zagrożonych pojawiającą się opornością na leki. Możliwość szybkiej i łatwej identyfikacji importowanych pasożytów i SNP związanych ze zmniejszoną czułością na miejscu informuje o wysiłkach nadzorczych i programach kontroli o skuteczności ich wdrożenia oraz identyfikuje punkty zapalne dla zwiększonych wysiłków na rzecz eradykacji i eliminacji malarii. Protokół ten opisuje metody oparte na sondach blokowanych i MAAB w celu zwiększenia czułości genotypowania HRM.

Protocol

Uwaga: Protokół ten obejmuje objętości i stężenia dla 96-dołkowych płytek, 8-probówek i systemów kapilarnych (objętość reakcji 10 μl); jednak HRM można również przeprowadzić w 384-dołkowych systemach opartych na płytkach z objętością reakcyjną 5 μl poprzez odpowiednie skalowanie wszystkich objętości. Zakres detekcji dla większości systemów wynosi od 10 pg do 10 ng matrycy DNA.

1. Przygotuj szablony

1. Próbki Plasmodium falciparum należy pobrać bezpośrednio z krwi pobranej od pacjentów biorących udział w badaniach terenowych i przechowywanej w postaci krwi pełnej, granulowanych krwinek czerwonych lub na bibule filtracyjnej><. Uwaga: Próbki mogą być również przystosowane do hodowli in vitro; niektóre standardowe szczepy laboratoryjne do analizy można zamówić w Centrum Badań nad Malarią i Referencyjnymi Odczynnikami (MR4, Próbki mogą być używane bezpośrednio z granulowanych czerwonych krwinek lub hodowli lub ekstrahowane z krwi pełnej, czerwonych krwinek lub bibuły filtracyjnej.
2. DNA wyekstrahowane z bibuły filtracyjnej lub szczepów dostosowanych do hodowli
   Uwaga: HRM jest wrażliwy na stężenie soli; Różnice stężeń wynikające ze zmiennych metod ekstrakcji mogą znacząco wpływać na temperatury topnienia. Chociaż specyficzne końcowe nie są istotnym czynnikiem sukcesu, należy użyć standardowego wspólnego buforu do elucji lub reprodukcji (tj. wody, 1x Te ['low Te' lub 'DNA suspension buffer': 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] lub 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) dla wszystkich próbek, aby uniknąć anomalnych lub niespójnych krzywych topnienia.
   1. Przygotować rozcieńczenia matrycy 10 pg –10 ng na μl w wzorcowym Te, TE lub wodzie na każde 10 μl reakcji.
3. Bezpośrednia amplifikacja z granulowanych krwinek czerwonych
   1. Określ pasożyt czerwonych krwinek za pomocą mikroskopii cienkorozmazowej
      Uwaga: Metody określania parazytemii zakażonych czerwonych krwinek są dostępne w Centrach Kontroli i Prewencji Chorób (CDC): http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html
   2. Rozcieńczyć pasożyty powyżej 0,5% w stosunku 1:400 w wodzie klasy PCR, TE lub Te. Stosować 3 μl na każde 5–10 μl reakcji.
4. Sterowanie
   Uwaga: HRM może być używany do skanowania genów w celu wykrycia wariantów sekwencji w populacji¹²; jednak dokładne genotypowanie wymaga standardowej weryfikacji sekwencji, aby zawierała badany SNP. Można stosować konstrukty plazmidowe lub izolaty malarii o znanych genotypach. W większości zastosowań 3D7 (MR4 MRA-151) jest używany jako kontrolka typu dzikiego. Ze względu na zmienność między seriami, zawsze uwzględniaj kontrole pozytywne i negatywne.
   1. Kontrole pozytywne: Przygotować 10 pg – 10 ng na 1 μl rozcieńczeń plazmidu lub wzorców o zweryfikowanych sekwencyjnie genotypach SNP.
   2. Kontrola ujemna: Użyj wody klasy PCR jako kontroli bez matrycy (NTC) w reakcjach amplifikacji.

2. Amplifikacja PCR

1. Przygotować mieszaninę reakcyjną
   1. (Opcjonalnie) Nakładka na olej mineralny. Uwaga: Niektóre systemy HRM są samodzielnymi platformami do topienia i nie mają podgrzewanej pokrywy, aby zapobiec kondensacji i parowaniu produktu podczas amplifikacji.
      1. Dodać 20 μl lekkiego oleju mineralnego do każdej płytki dołka przed załadowaniem mieszaniny reakcyjnej.
   2. Przygotuj 10 zapasów roboczych dla wszystkich testów
      1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z zalecanymi 10-krotnymi stężeniami zapasu roboczego, a także stężeniami końcowymi dla genotypowania HRM opartego na zablokowanej sondzie.
   3. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych
      1. Do każdej studzienki w płytce lub probówce dodaj 1 μl 10x starterów i sond do przodu i do tyłu materiału roboczego, 4,0 – 5,0 μl 2,5x lub 2,0x HRM master mix, 1 μl matrycy i wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 μl.
   4. Pokrywy lub rury
      1. Używaj uszczelek płytki optycznej do amplifikacji na płytce, nasadek optycznych do systemów opartych na rurkach paskowych i plastikowych nasadek do systemów opartych na kapilarach. Upewnij się, że pokrycie jest pełne, a płytki i nasadki są całkowicie uszczelnione i zabezpieczone, aby zapobiec parowaniu podczas amplifikacja.
   5. Wirowanie próbek
      1. Obracać płytki przez 3 minuty przy 1 800 x g w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i oddzielenia fazy olejowej i wodnej, jeśli używany jest olej mineralny.
2. Protokół amplifikacji
   1. Umieść płytki lub probówki reakcyjne w termocyklerze. Uruchom standardowe protokoły amplifikacji sondy blokowanej lub MAAB (odpowiednio tabele 2 i 3). Zwróć uwagę na różnicę w temperaturze wyżarzania między tymi metodami.

3. Analiza HRM

1. topnieć
   1. Po amplifikacji PCR przystąp do analizy topnienia. W przypadku samodzielnych systemów topienia, które nie mają wbudowanego amplifikacji (np. systemy BioFire Defense LightScanner), wyjmij amplifikowaną płytkę z termocyklera i umieść w przyrządzie HRM. Z poziomu interfejsu oprogramowania systemowego stopić płytkę w temperaturze od 40 do 80 °C, aby uzyskać piki topnienia zarówno sondy, jak i amplikonu.
      Uwaga: Aby zaoszczędzić czas topnienia i analizy, okno topnienia można skrócić, aby objąć zakresy temperatur tylko dla obszarów topnienia sondy lub amplikonu. Po stopieniu płytki i rurki można w razie potrzeby ponownie stopić i przechowywać w temperaturze -20 °C lub 4 °C. Szklane probówki należy przechowywać tylko w temperaturze 4 °C, aby zapobiec pękaniu probówek.
2. Analiza stopu
   1. Usuwanie próbek ujemnych
      1. W oprogramowaniu do analizy należy usunąć z dalszej analizy próbki, które nie uległy amplifikacji lub które mają postrzępione piki topnienia. Uwaga: Po wybraniu metody analizy dla pojedynczego pliku przebiegu, urządzenie automatycznie grupuje próbki dodatnie i ujemne. Przed genotypowaniem każdego podzbioru użytkownik może ręcznie zmienić wywołania.
         1. W widoku krzywej topnienia lub piku topnienia kliknij prawym przyciskiem myszy krzywe do usunięcia, aby je wybrać. Po wybraniu błędnie sklasyfikowanych próbek, przejdź do "Nowe połączenie", wybierz odpowiednią grupę i kliknij "Zastosuj zmianę".
   2. normalizować
      1. Z ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury (–dF/dT) ("Krzywe różnicowe") przesunąć paski normalizacyjne tak, aby otaczały obszar stopienia sondy.
         Uwaga: Obszar stopienia sondy to niższa temperatura dwóch obszarów topnienia. Paski normalizacji powinny znajdować się u podstawy szczytów topnienia.
   3. Obliczanie grup
      1. Po normalizacji wybierz opcję "Oblicz grupy", aby automatycznie przypisać próbki do grup.
         W razie potrzeby ręcznie ponownie przypisz próbki do określonych grup.
         Uwaga: Niektóre programy analityczne mają wysokie progi czułości, których nie można zmienić; W takich przypadkach oprogramowanie może przypisywać próbki do różnych grup, które wizualnie należą do innej grupy.
   4. Przypisywanie genotypów
      1. Przypisz genotypy do każdej grupy w oparciu o normy (kontrole pozytywne).
         1. Po potwierdzeniu przez użytkownika, że obliczone grupy są poprawne (jeśli nie, to czy zostały wprowadzone poprawne zmiany w zakładce Grupowanie, wybierając błędnie sklasyfikowane próbki i wybierając odpowiednią grupę z listy rozwijanej obok "Nowe połączenie"), wybierz opcję "Edytuj nazwy grup" w zakładce "Grupowanie".
         2. Wprowadź genotypy wzorców w odpowiednim kolorowym polu (na przykład, jeśli norma 3d7 ma znany genotyp A i znajduje się w grupie czerwonej, grupa czerwona ma genotyp A). Naciśnij "OK" i zapisz wyniki.
   5. Eksport wyników
      1. Eksportuj wywołania genotypów jako arkusz kalkulacyjny w celu dalszej analizy populacji próbki.

Results

Dane mogą być wizualizowane na kilka różnych sposobów, w zależności od oprogramowania i instrumentu do analizy. Zazwyczaj wykres ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury (–dF/dT) w stosunku do wyników temperatury jest najprostszy do wizualizacji pików topnienia i określenia genotypów.

Pełne okno topnienia (40°C–80°C) spowoduje topnienie zarówno amplikonu, jak i sondy. Rysunek 1 przedstawia przykład znormalizowanych szczytów topnienia dla obu regionów. Ustawienie okna analizy tylko na obszar sondy skutkuje wyraźnym rozróżnieniem pików odpowiadających konkretnym SNP (rysunek 2).

Analiza oparta na sondach wyraźnie pokazuje obecność obu alleli jako indywidualnych pików o temperaturach topnienia, które odpowiadają homozygotycznym pikom SNP (Rysunek 3).

Rysunek 4 pokazuje, że stopniowe zmniejszanie temperatury wyżarzania podczas amplifikacji (MAAB) powoduje odchylenie w kierunku zmutowanego allelu (pik po lewej stronie) (Rysunek 4A), co skutkuje zwiększoną wrażliwością na zmutowany allel w populacji alleli mieszanych (Rysunek 4B).

Rysunek 1. Obszary topnienia sondy i amplikonu. Wykreślenie ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury w szerokim oknie topnienia powoduje uzyskanie zarówno pików topnienia sondy (niższa temperatura), jak i amplikonów, które można analizować. (Na podstawie Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Piki topnienia sondy. Idealne dopasowania (zazwyczaj allele typu dzikiego) skutkują wyższymi pikami topnienia (kolor czerwony), podczas gdy niedopasowania SNP mają niższe temperatury topnienia (kolor szary). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Poligenomiczne piki topnienia. Gdy oba allele są obecne w próbce, analiza HRM oparta na sondzie przedstawia oba allele jako krzywe dwupikowe (pomarańczowe) z pikami pasującymi do próbek z pojedynczym allelem (czerwony i szary). (Na podstawie Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Błąd systematyczny amplifikacji zmutowanego allelu (MAAB). A. Stopniowe obniżanie temperatury wyżarzania amplifikacyjnego powoduje odchylenie reakcji piku topnienia w kierunku piku odpowiadającego zmutowanemu allelowi (o niższej temperaturze) w próbce poligenomicznej lub poliallelicznej. B. MAAB powoduje czułość HRM w wykrywaniu mniejszych alleli obecnych na poziomie mniejszym niż 1% w próbkach poligenomicznych lub poliallelicznych. (Część B zaadaptowana z Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Konfiguracja opartych na sondzie reakcji amplifikacji topnienia o wysokiej rozdzielczości.

składnik	Objętość na reakcję (płytka 96-dołkowa i rurka kapilarna)	Objętość na reakcję (płytka 384-dołkowa)	Końcowe stężenie
Mistrz HRM Mix	4–5 μl	2-2,5 μl	1 x
10 x Nadmiar podkładu	1 μl	0,5 μl	0,50 μM
10 x Inny podkład	1 μl	0,5 μl	0,1 μM
10x sonda	1 μl	0,5 μl	0,40 μM
Woda klasy PCR	1–2 μl	0,5-1 μl
Matrycowy DNA	1 μl	0,5 μl	0,01-10 ng/μl
	10 μl	5 μl

Tabela 2. Standardowe warunki amplifikacji topnienia o wysokiej rozdzielczości.

temperatura	Godzina
trzymać	95 °C	120 sekund
45 cykli	95 °C	30 sekund
	68 °C*	30 sekund
1 cykl	95 °C	30 sekund
	28 °C	30 sekund

* ta temperatura jest zależna od amplikonu

Tabela 3. Warunki amplifikacji dla błędu amplifikacji zmutowanego allelu.

się

temperatura	Godzina	Cykli	Szybkość narastania	Tryb akwizycji	Tryb analizy
Deturat	95 °C	30 sekund	1	20	żaden	żaden
Cykl	95 °C	2 sekundy	55	20	żaden	Kwantyfikacja
	56 °C*	15 sekund		20	pojedynczy
Rozpłynąć	40 °C	0 sekund		0.3	żaden	żaden
	45 °C*	0 sekund			ciągłość ciągła	Stopić
	90 °C*	0 sekund

* ta temperatura jest zależna od amplikonu i zostanie obniżona podczas wykonywania MAAB

Discussion

Ciągły HRM jest etapem analizy po PCR; w związku z tym konfiguracja próbki i testu jest podobna do standardowych protokołów PCR, z dodatkowym włączeniem fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego używanego do śledzenia przejścia od dwuniciowego do jednoniciowego DNA podczas etapu topnienia o wysokiej rozdzielczości. Najważniejszym czynnikiem wpływającym na udaną analizę HRM jest solidny produkt PCR. Projektowanie testów ma kluczowe znaczenie, a kilka narzędzi zoptymalizowanych pod kątem projektowania testów HRM jest dostępnych na rynku i w Internecie¹³. Długości amplikonów wynoszące 80-150 par zasad z towarzyszącymi ~ 20 zablokowanymi parami zasad sondami wyśrodkowanymi nad SNP lub SNP będącymi przedmiotem zainteresowania najlepiej sprawdzają się w różnicowaniu SNP, a także haplotypów wielu SNP w regionie sondy. Sondy mogą być blokowane za pomocą dystansu 3' C3 lub niedopasowania 2 par zasad na końcu 3', co zapobiega wysuwaniu się podczas amplifikacji. Sondy mogą być zaprojektowane tak, aby pasowały do pasma szablonu Watsona lub Cricka; Wybór zależy od testów empirycznych mających na celu określenie, która konstrukcja sondy wytwarza dopuszczalne piki topnienia. Nadmiar starterów do przodu lub do tyłu jest używany do wytwarzania jednoniciowego produktu amplifikacji, który wyżarza się do zablokowanych sond. Jeśli sonda zawiera sekwencję nici do przodu, wówczas w nadmiarze stosuje się starter odwrotny, zwykle w stosunku 1:5 i odwrotnie w przypadku sond pasujących do nici odwrotnej.

Podobnie, HRM działa najlepiej z wystarczającą ilością i solidnym produktem PCR. Optymalizacja reakcji PCR wymaga gradientowego PCR i żeli agarozowych lub analizy bioanalizatorem w celu określenia optymalnych temperatur wyżarzania. Stężenie matrycy można zwiększyć za pomocą metod takich jak amplifikacja wstępna, stronnicze multipleksowane amplifikacja wszystkich celów przy użyciu niskiego stężenia startera i liczby cykli w celu zwiększenia stężenia matrycy¹³.

Tylko kilka instrumentów jest kompatybilnych z MAAB. Właściwości termiczne szklanych kapilar stosowanych w tych systemach ułatwiają tę metodę. Mała średnica wewnętrzna kapilar oraz szybki transfer ciepła przez szkło zapewniają bardziej rygorystyczną kontrolę temperatury niż standardowe wyroby z tworzyw sztucznych PCR, które mają wolniejsze tempo przejścia między cyklami wyżarzania i denaturacji ze względu na właściwości termoizolacyjne tworzyw sztucznych. Dzięki tej metodzie czułość wykrywania może zostać zmniejszona z 2-5% do mniej niż 1% zmutowanego allelu w mieszaninie alleli typu dzikiego i zmutowanego¹⁰.

HRM jest łatwym, wydajnym i ekonomicznym narzędziem do genotypowania SNP w różnych ustawieniach i licznych zastosowaniach, od nadzoru nad chorobami zakaźnymi po skanowanie w poszukiwaniu wariantów genów raka. Kilka innych urządzeń, takich jak systemy Roche Nano i LightCycler (480 i 96), a także system Eco Real-time PCR, oferuje HRM oprócz standardowej funkcji wzmacniania, czasu rzeczywistego i kopiowania numerów. Korzystając z maszyn o wyższej przepustowości, kodowanie kreskowe HRM kosztuje mniej niż 0,50 USD za test w naszych rękach, w tym wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne.

W opisanym tu kontekście, aplikacje terenowe umożliwiają monitorowanie populacji w czasie rzeczywistym pod kątem zmian związanych z wysiłkami na rzecz zwalczania malarii, w tym zmniejszonej różnorodności populacji, wykrywania importowanych typów pasożytów oraz pojawiania się i rozprzestrzeniania SNP związanych ze zmniejszoną wrażliwością na leki. Udoskonalenia metody zapewniają dodatkową czułość przydatną w informowaniu o postępach na drodze do eliminacji i zwalczania malarii.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LightScanner Master Mix	BioFire Defense	HRLS-ASY-0003
Lekki olej mineralny	Sigma	M5904	do płytowych systemów HRM BioFire Defense
TE	Teknova	T0226
	Teknova	T0221	Bufor TE ze zredukowaną wodą o jakości EDTA
PCR	Teknova	W3330
Plasmodium Wzorce falciparum	MR4	MRA-151, 156, 205, 330 MR4.org	oferuje bezpłatne oprogramowanie do projektowania podkładów genomowego skanera światła DNA
	Komercyjne oprogramowanie BioFire Defense		do projektowania testów HRM
LightCycler 480 o wysokiej rozdzielczości Melting Master Mix	Roche	4909631001	Do stosowania w LightCycler-480, -96 i nano. 2x
stężenie Bioanalizator	Agilent	G2938A	Bioanalizator Agilent 2100
LightCycler 2.0	Roche	3531414001	System kapilarny do MAAB
LightCycler Nano	Roche	6407773001	Rurka paskowa HRM i amplifikacja
LightCycler 96	Roche	5815916001	Rurka paskowa i płytka HRM i amplifikacja
LightCycler 480	Roche	5015278001	HRM na płytce (96 i 384- płytki studzienne) i amplifikacja
LightScanner-96	BioFire Defense	LSCN-ASY-0011	HRM na bazie płytki (96-dołkowej)
LightScanner-384	BioFire Defense	LSCN-ASY-0001	płytki HRM (96-dołkowe)
Płytki 96-dołkowe	Roche	4729692001	96-dołkowe do HRM (płytki
384-dołkowe	LightCycler Roche	4729749001	Płytki 384-dołkowe do HRM (LightCycler)
Płytki 96-dołkowe	Bio-Rad	HSP-9665	Płytki 96-dołkowe do HRM (LightScanner)
Płytki 384-dołkowe	Bio-Rad	HSP-3865	Płytki 384-dołkowe do HRM (LightScanner)
Paski LightCycler 8 tubek (przezroczyste)	Probówki paskowe 6327672001 Roche		do HRM (Light Cycler 96 i Light Cycler Nano)
Kapilary LightCycler (20 μ l)	Kapilary 4929292001		Roche do HRM
Uszczelki optyczne płytek Roche		4729757001	innych marek również działają