Method Article

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

DOI:

10.3791/52840

⸱

August 16th, 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę pozwalającą na śledzenie komórek przez cały cykl komórkowy bez konieczności synchronizacji komórek. Osiągnięcie synchronizacji komórek może być trudne dla wielu systemów komórkowych. Standardową praktyką jest blokowanie progresji cyklu komórkowego na określonym etapie, a następnie uwalnianie nagromadzonych komórek, wytwarzając falę komórek przechodzących przez cykl zgodnie z nimi. Jednak niektóre typy komórek uważają ten blok za toksyczny, co skutkuje nieprawidłowym cyklem komórkowym, a nawet masową śmiercią. Wychwyt bromodeoksyurydyny (BrdU) może być wykorzystany do śledzenia etapu cyklu komórkowego poszczególnych komórek. Komórki zawierają ten syntetyczny analog tymidyny, jednocześnie syntetyzując nowe DNA podczas fazy S. Dostarczając BrdU przez krótki czas, możliwe jest oznaczenie puli komórek, które były w fazie S, gdy BrdU był obecny. Komórki te mogą być następnie śledzone przez pozostałą część cyklu komórkowego i do następnej rundy replikacji, co pozwala na określenie czasu trwania faz cyklu komórkowego bez konieczności wywoływania potencjalnie toksycznego bloku cyklu komórkowego. Możliwe jest również określenie i skorelowanie ekspresji białek zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych podczas kolejnych etapów cyklu komórkowego. Można je wykorzystać do dalszego uściślenia przypisywania etapów cyklu komórkowego lub oceny wpływu na inne funkcje komórkowe, takie jak aktywacja punktu kontrolnego lub śmierć komórki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena cech cyklu komórkowego i zmian, które zachodzą w komórkach podczas progresji cyklu komórkowego, jest fundamentalna dla zrozumienia wielu aspektów biologii, szczególnie biologii raka. Wiele opracowywanych środków do leczenia nowotworów złośliwych ma głęboki wpływ na progresję cyklu komórkowego lub indukuje śmierć komórki poprzez mechanizmy zależne od cyklu komórkowego. Aby zbadać dynamikę cyklu komórkowego lub komórki w określonej fazie cyklu komórkowego, zwykle synchronizuje się komórki. Jednak metody synchronizacji mogą mieć szkodliwy wpływ na badane komórki, potencjalnie zakłócając uzyskane wyniki. 1 Ostatnio zastosowanie fluorescencyjnie znakowanyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową ostrej białaczki limfoblastycznej NALM6, ale może być stosowany do innych typów komórek.

1. Roztwory i odczynniki

  1. Kompletny RPMI
    1. Dodaj 56 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 5,5 ml 200 mM L-glutaminy do 500 ml butelki pożywki RPMI-1640.
  2. Roztwór podstawowy BrdU
    1. Przygotować 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  3. BrdU Kompletny RPMI
    1. Dodać 6,2 μl roztworu podstawowego BrdU do 10 ml Complete RPMI.
  4. Rozwiązanie DN....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metodologia może być użyta do uzyskania szeregu informacji. W tym miejscu przedstawiono kilka zastosowań.

Ocena czasu trwania cyklu komórkowego

Aby określić czas potrzebny komórkom na przejście przez cykl komórkowy, komórki są zbierane w różnych punktach czasowych po impulsie BrdU. Interwały między ocenami mogą być dostosowane do poszczególnych analizowanych komórek. Linie komórek krwiotwórczych oceniano co godzinę przez okres 24 godzin przy braku jakiegokolwiek .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość analizy cyklu komórkowego jest ważna dla zrozumienia biologii nowotworów i mechanizmu działania zarówno leków, jak i genów, które wpływają na proliferację i wzrost komórek. Chociaż istnieje wiele testów, które podobno mierzą proliferację komórek, większość z nich zapewnia tylko miarę, która wskazuje liczbę obecnych komórek. Należą do nich testy, które mierzą liczbę komórek poprzez bezpośrednią wizualizację i zliczanie, aktywność metaboliczną lub stężenie ATP. Główną zaletą wielu z tych metod jest to, że są one .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została sfinansowana przez Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), grant Cancer Council NSW (13-02), NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) oraz grant projektowy (1041614).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw przepływowy APC BrdUBD Biosciences552598Zawiera przeciwciało BrdU, 7-AAD i bufor BD Cytofix/Cytoperm
(określany jako bufor utrwalający)
Bufor permeabilacyjny BD Cytoperm PlusBD Biosciences561651określany jako bufor permeabilizacji
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences554723określany jako bufor płuczący
DNaseSigmaD-4513
BD Falcon 12 x 75  mm Probówki FACSBD Biosciences352008
BD Pharmingen Barin BufferBD Biosciences554656
BD LSR FORTESSA cytometr przepływowyBD BiosciencesFORTESSA
PipetmanGilsonP2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 bez L-Gln 500 mlLonza12-167F
DPBSLonza17-512F
Płodowa surowica bydlęcaFisherBiotecFBS-7100113
L-GlutaminaSigmaG7513-100ML
5-Bromo-2′-deoksyurydynaSigmaB5002-1G
Falcon TC 150  cm2 kolby wentylowaneBD Biosciences355001
Pipety 25  mlGreiner760180
Pipety Aersol 200  &mikro; lPipety Interpath24700
Aersol 1  mlInterpath24800
WirówkaSpintronGT-175R
Inkubator CO2BinderC 150
AF488 anty-histon H3 Fospho (Ser10) Sygnalizacjakomórkowaprzeciwciała 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Sygnalizacja komórkowa mAb królika2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Sygnalizacja komórkowa mAb królika2348S
NALM6 DSMZACC-128

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
  2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle ProgressionFlow CytometryBrdU UptakeS Phase TrackingCell Cycle AnalysisDNA SynthesisCell SynchronizationProtein ExpressionCheckpoint ActivationCell Death

Related Articles