Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Summary

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Abstract

Ten protokół opisuje metodę pozwalającą na śledzenie komórek przez cały cykl komórkowy bez konieczności synchronizacji komórek. Osiągnięcie synchronizacji komórek może być trudne dla wielu systemów komórkowych. Standardową praktyką jest blokowanie progresji cyklu komórkowego na określonym etapie, a następnie uwalnianie nagromadzonych komórek, wytwarzając falę komórek przechodzących przez cykl zgodnie z nimi. Jednak niektóre typy komórek uważają ten blok za toksyczny, co skutkuje nieprawidłowym cyklem komórkowym, a nawet masową śmiercią. Wychwyt bromodeoksyurydyny (BrdU) może być wykorzystany do śledzenia etapu cyklu komórkowego poszczególnych komórek. Komórki zawierają ten syntetyczny analog tymidyny, jednocześnie syntetyzując nowe DNA podczas fazy S. Dostarczając BrdU przez krótki czas, możliwe jest oznaczenie puli komórek, które były w fazie S, gdy BrdU był obecny. Komórki te mogą być następnie śledzone przez pozostałą część cyklu komórkowego i do następnej rundy replikacji, co pozwala na określenie czasu trwania faz cyklu komórkowego bez konieczności wywoływania potencjalnie toksycznego bloku cyklu komórkowego. Możliwe jest również określenie i skorelowanie ekspresji białek zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych podczas kolejnych etapów cyklu komórkowego. Można je wykorzystać do dalszego uściślenia przypisywania etapów cyklu komórkowego lub oceny wpływu na inne funkcje komórkowe, takie jak aktywacja punktu kontrolnego lub śmierć komórki.

Introduction

Ocena cech cyklu komórkowego i zmian, które zachodzą w komórkach podczas progresji cyklu komórkowego, jest fundamentalna dla zrozumienia wielu aspektów biologii, szczególnie biologii raka. Wiele opracowywanych środków do leczenia nowotworów złośliwych ma głęboki wpływ na progresję cyklu komórkowego lub indukuje śmierć komórki poprzez mechanizmy zależne od cyklu komórkowego. Aby zbadać dynamikę cyklu komórkowego lub komórki w określonej fazie cyklu komórkowego, zwykle synchronizuje się komórki. Jednak metody synchronizacji mogą mieć szkodliwy wpływ na badane komórki, potencjalnie zakłócając uzyskane wyniki. ¹ Ostatnio zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych białek, które są obecne tylko w określonych fazach cyklu komórkowego, umożliwiło analizę progresji cyklu komórkowego w pojedynczych komórkach w czasie², jednak komórki, które mają być badane, muszą być genetycznie manipulowane w celu ekspresji tych znakowanych białek, ograniczając ich użycie do systemów, w których można to łatwo osiągnąć.

Cykl komórkowy składa się z dwóch aktywnych faz: fazy syntezy (S), w której DNA jest replikowane i mitozy (M), w której następuje podział komórki. Fazy te są oddzielone trzema fazami przerwy: G₀, G₁ i G₂. G₀ lub spoczynek to faza spoczynku, w której komórka opuściła cykl, G₁ to miejsce, w którym komórki zwiększają swój rozmiar przed replikacją DNA, a G₂, w którym wzrost komórki trwa między zakończeniem replikacji DNA, ale przed podziałem komórki. Postęp w cyklu komórkowym jest kontrolowany przez szereg punktów kontrolnych. Punkt kontrolny G₁ jest aktywowany, gdy warunki środowiskowe nie sprzyjają syntezie DNA i uniemożliwiają wejście w fazę S. Punkt kontrolny lub opóźnienie fazy intra-S może być wywołane przez uszkodzenie DNA, które może skutkować zatrzymaniem widełek replikacyjnych. Podczas_G2 potwierdza się wierność zreplikowanego DNA, a jeśli zostanie wykryte uszkodzenie, aktywowany jest punkt kontrolny_G2, co umożliwia naprawę DNA przed podziałem komórki. Ostatni punkt kontrolny podczas mitozy zapewnia, że chromatydy zostały prawidłowo ustawione na płytce mitotycznej, aby podział komórek mógł zostać pomyślnie zakończony. ³ Aktywacja tych punktów kontrolnych jest powszechnie stosowana do synchronizacji populacji komórek. Punkty kontrolne cyklu komórkowego mogą być aktywowane przez wiele czynników, ale w biologii nowotworów najczęstszym jest wykrycie uszkodzenia DNA. Odpowiedź na uszkodzenie DNA jest inicjowana przez kinazy podobne do kinazy PI3, ataksja, teleangiektazja i związane z Rad3 (ATR) oraz zmutowane ataksje teleangiektazyjne (ATM), które aktywują odpowiednio kinazy efektorowe Chk1 i Chk2. ³ Szereg zdarzeń aktywuje Chk1, w tym zablokowane widełki replikacyjne, wiązania krzyżowe DNA i uszkodzenia spowodowane promieniowaniem ultrafioletowym, podczas gdy Chk2 jest aktywowany głównie przez pęknięcia podwójnej nici.

Zwykłą metodą badania wpływu zmienionych warunków na długość cyklu komórkowego jest synchronizacja komórek w określonej fazie cyklu komórkowego. ¹ Można to osiągnąć na kilka sposobów. Komórki można fizycznie rozdzielić na podstawie rozmiaru, gęstości, rozrzutu bocznego (ziarnistości) i markerów ekspresji powierzchni komórki. Bardziej praktycznie, komórki mogą być synchronizowane za pomocą środków chemicznych. Kilka środków, takich jak tymidyna, hydroksymocznik i arabinozyd cytozyny, może być stosowanych do hamowania syntezy DNA w fazie S cyklu komórkowego, co powoduje akumulację komórek w fazie S, które kontynuują cykl po usunięciu środków. Komórki traktowane nokodazolem, który zapobiega tworzeniu się wrzeciona mitotycznego, zatrzymują się przy zawartości DNA w fazie_G2 lub M. Eliminacja surowicy z pożywki hodowlanej powoduje akumulację komórek w fazie G₀. Ponowne dodanie składników odżywczych w surowicy hodowlanej ponownie rozpoczyna normalny cykl komórek. Jednak wszystkie te metody synchronizacji zakłócają normalny cykl i wzrost komórek i mogą spowodować znaczną śmierć komórki.

Synchronizacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej jest szczególnie trudna, a komórki te nie są podatne na manipulacje genetyczne. Opisana tutaj metoda pozwala na ocenę dynamiki cyklu komórkowego i badanie komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego bez tradycyjnej synchronizacji lub modyfikacji genetycznej. Ta metoda może być również przydatna w przypadku innych typów komórek, w których modyfikacja genetyczna i tradycyjne procedury synchronizacji nie są łatwe do osiągnięcia. Metoda opiera się na ugruntowanym od dawna stosowaniu inkorporacji bromodeoksyurydyny (BrdU), która ma bardzo mały wpływ na krótkoterminowy wzrost i proliferację komórek. ⁴ Ustalone protokoły BrdU wykorzystują włączenie BrdU do nowo zsyntetyzowanego DNA podczas fazy S. To trwale oznacza, że komórki były w fazie S podczas ekspozycji na BrdU. Populacja ta może być zidentyfikowana w późniejszych punktach czasowych poprzez barwienie pod kątem inkorporacji BrdU, a tym samym działać jako zsynchronizowana populacja, którą można śledzić i oceniać w czasie, co pozwala na badanie wpływu leku na tranzyt cyklu komórkowego. BrdU musi być wystawiony na działanie przeciwciał przed barwieniem przeciwciał, zwykle uzyskuje się je po leczeniu DNazą lub kwasem. ^6,7 Zastosowanie cytometrii przepływowej do wykrywania włączonego BrdU umożliwia włączenie dodatkowych markerów. Najważniejsze jest zastosowanie barwników do pomiaru zawartości DNA, umożliwiających ocenę rozkładu faz cyklu komórkowego komórek, które na początku badania znajdowały się w fazie S. ⁸ Ponadto można również badać dodatkowe antygeny powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe. ⁹ Mogą one odnosić się do zdarzeń cyklu komórkowego, takich jak Ki67 lub do pozornie niepowiązanych cech komórek, takich jak markery apoptozy, takie jak rozszczepiona kaspaza-3. Potencjalne zastosowania są ograniczone wyobraźnią badacza.

Protocol

Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową ostrej białaczki limfoblastycznej NALM6, ale może być stosowany do innych typów komórek.

1. Roztwory i odczynniki

1. Kompletny RPMI
   1. Dodaj 56 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 5,5 ml 200 mM L-glutaminy do 500 ml butelki pożywki RPMI-1640.
2. Roztwór podstawowy BrdU
   1. Przygotować 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
3. BrdU Kompletny RPMI
   1. Dodać 6,2 μl roztworu podstawowego BrdU do 10 ml Complete RPMI.
4. Rozwiązanie DNazy
   1. Przygotować 1 mg DNazy/ml w DPBS.
5. Bufor do barwienia
   1. Przygotować 3% inaktywowany termicznie FCS i 0,09% azydek sodu w DPBS.
6. Zapoznaj się z listą materiałów, aby zapoznać się z definicjami bufora utrwalającego, buforu przepuszczalnego i bufora do płukania.

2. Komórki

Uwaga: Komórki nie były hodowane dłużej niż 6 miesięcy. Metodę tę można bezpośrednio dostosować do każdej nieprzylegającej linii komórkowej z dostosowaniem gęstości komórek i pożywki hodowlanej. Użyj komórek, które rosną wykładniczo na początku eksperymentu.

1. Utrzymuj komórki NALM6 w kolbach hodowlanych T-75 w Complete RPMI. Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach, korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
   1. Utrzymuj komórki NALM6 między 1-2 x 10⁶ komórek na ml, dzieląc kulturę trzy razy w tygodniu.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w powietrzu.

3. Pulsacyjne znakowanie komórek za pomocą BrdU

UWAGA: Z BrdU należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to potencjalny mutagen i teratogen.

1. Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut. Uwaga: Przeniesienie komórek do świeżej pożywki poprawia odtwarzalność wyników.
2. Wykonaj zliczanie komórek i ponownie zawieś komórki w Complete RPMI przy 2 x 10⁶ komórkach/ml.
3. Rozcieńczyć komórki 1 w 2 za pomocą BrdU Complete RPMI, uzyskując końcowe stężenie komórek 1 x 10⁶ komórek/ml.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 45 minut, a następnie rozcieńczyć komórki 1:10 pełnym RPMI. Odwirować komórki o masie 150 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucić cały supernatant.
5. Ponownie zawieś komórki w małej objętości (~100 μl) pełnego RPMI, wykonaj liczenie komórek i dostosuj do 1 x 10⁶ komórek/ml.
6. Odpipetować 1 ml komórek do dołków płytki 48-dołkowej. Odpipetować 1 ml DPBS do wszystkich wolnych studzienek, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki.
7. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w powietrzu dla żądanych punktów czasowych, tutaj 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24 godziny. Uwaga: Czas trwania będzie zależał od tego, co projekt eksperymentalny ma na celu zmierzyć.
8. Przenieś wszystkie komórki do probówek FACS za pomocą pipety. Przepłukać studzienkę sekwencyjnie objętością 1 ml PBS do końcowej całkowitej objętości 5 ml.
9. Wirować przy 150 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć cały supernatant. Komórki są gotowe do barwienia, wykonaj to natychmiast (sekcja 4).

4. Barwienie komórek

Uwaga: Jeśli wymagane jest barwienie powierzchni komórek, wykonaj je przed utrwaleniem, upewniając się, że komórki są utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały czas.

1. Zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego (w przypadku opcjonalnego barwienia powierzchniowego dodać zalecaną objętość przeciwciała do antygenów powierzchniowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C).
2. Dodać 1 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut przy 150 x g i odrzucić supernatant.
   Uwaga: Specyficzne przeciwciało, stężenie, czas inkubacji itp. będą się różnić w zależności od konkretnych celów eksperymentalnych.
3. Utrwalenie i przepuszczalność
   1. Zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 1 ml buforu do przemywania i wirować przez 5 minut przy starciach 150 x g i odrzucić supernatant.
   3. Zawiesić komórki w 100 μl buforu permeabilacyjnego i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie.
   4. Dodać 1 ml buforu do przemywania i odwirowywać przez 5 minut przy sile 150 x g i odrzucić sklarowany osad.
   5. Zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego na probówkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Dodać 1 ml buforu do płukania, odwirowywać przez 5 minut przy 150 x g i odrzucić supernatant.
      Uwaga: W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać. Utrwalone komórki są stabilne przez kilka dni w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną ponownie zawieszone w buforze barwiącym. Przed kontynuowaniem usunąć bufor barwiący po odwirowaniu.
4. Leczenie DNazy
   1. Zawiesić komórki w 100 μl roztworu DNazy (30 μg DNazy/10⁶ komórek) i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Dodać 1 ml buforu do przemywania i odwirowywać przy sile 150 x g przez 5 minut i odrzucić sklarowany sklarat nad osadem.
5. Barwienie przeciwciałami
   Uwaga: Barwienie na obecność markerów wewnątrzkomórkowych innych niż BrdU można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem BrdU.
   1. WAŻNE: Przygotuj kontrole kompensacyjne składające się z niebarwionych komórek i komórek znakowanych każdym pojedynczym fluorochromem. Najlepiej użyć tych samych przeciwciał do kontroli kompensacji, co te używane w probówkach eksperymentalnych. Jeśli jednak nie jest to wykonalne, zastąp przeciwciała antygenami o wysokiej ekspresji sprzężonymi z tym samym fluorochromem.
   2. Zawiesić komórki w 50 μl buforu do przemywania i dodać 1 μl/10⁶ komórek przeciwciała BrdU. Uwaga: Można również dodać bezpośrednio sprzężone przeciwciała przeciwko innym specyficznym antygenom wewnątrzkomórkowym.
      UWAGA: Przeciwciała przeciwko histonowi H3 fosforylowanemu na Ser10 mogą być używane do rozróżniania komórek w G2 i M, histon H3 jest fosforylowany na Ser10 podczas mitozy. ¹⁰ Przeciwciała przeciwko cdc2 fosforylowane na Tyr15 można wykorzystać do wykrycia komórek, które zobowiązały się do mitozy. ¹¹
   3. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Dodać 1 ml buforu do przemywania wodą, odwirować komórki o sile 150 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.

6. Barwienie DNA do analizy cyklu komórkowego
   1. Poluzować osad i dodać 20 μl roztworu 7-AAD (0,25 μg). Uwaga: Bardzo ważne jest, aby używać stałej ilości 7-AAD/ogniwo.
   2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu barwiącego.

5. Zbieranie danych cytometrii przepływowej

Uwaga: Wymagana maszyna będzie zależeć od liczby i rodzaju użytych fluorochromów.

1. Zbierz następujące parametry: FSC-A, SSC-A, FSC-H (zamiast FSC-H można użyć FSC-W) i fluorescencja 7-AAD w skali liniowej. Zbierz kanał APC na skali logarytmicznej. Zbierz wszelkie dodatkowe kanały wymagane do oceny powierzchni lub etykiet wewnętrznych za pomocą skali logarytmicznej.
2. Przed analizą próbek należy przeprowadzić kompensację nakładających się sygnałów w widmach emisyjnych obserwowanych między różnymi fluorochromami. Uwaga: Większość cytometrów przepływowych wykonuje to automatycznie.
3. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.

6. Analiza danych cytometrii przepływowej

Uwaga: FlowJo został użyty w tym badaniu do analizy danych cytometrii przepływowej, ale można również użyć innych pakietów oprogramowania. Strategię bramkowania zilustrowano na rysunku 1.

1. Zidentyfikuj żywotną populację komórek za pomocą parametrów FSC-A i SSC-A.
2. W tej populacji należy wykluczyć dublety i agregaty za pomocą FSC-A i FSC-H (FSC-W może być również używany tutaj).
3. W tej populacji ustaw wykres kropkowy, używając 7-AAD na osi x i BrdU-APC na osi y.

Rysunek 1: Strategia bramkowania. Lewy panel: nieaktywne komórki są pokazane na wykresie punktowym FCS-A vs. SSC-A. Żywotną populację komórek identyfikuje się za pomocą pokazanej bramki. Panel środkowy: komórki bramkowane z lewego panelu są pokazane na wykresie punktowym FSC-A vs. FSC-H (zamiast wysokości można użyć FSC-W). Dublety i agregaty są identyfikowane i wykluczane przez pokazaną bramę. Prawy panel: komórki bramkowane od daty wykluczenia dubletu w panelu środkowym są pokazane na wykresie kropkowym 7-AAD i APC-A. Przeciwciało BrdU jest znakowane APC, co pozwala na identyfikację komórek, które zawierają BrdU podczas znakowania impulsowego. 7-AAD dostarcza informacji o zawartości DNA. Górna bramka definiuje komórki dodatnie dla BrdU, a zatem w fazie S w momencie impulsu BrdU, dolna lewa bramka, komórki w G_0/1, a dolna prawa bramka te w G₂/M. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Analiza cyklu komórkowego
   1. Otwórz pierwszy plik danych i bramkę w komórkach w bramce wykluczenia dubletu.
   2. Przeanalizuj tę populację pod kątem rozkładu cyklu komórkowego (znajdującego się na platformach w oprogramowaniu FloJo) i użyj modelu Deana-Jetta-Foxa.
   3. Uzyskaj pozycje pików G_0/1 i G₂/M za pomocą bramek tworzenia.
   4. Bramka na komórkach BrdU dodatnich i poddaj tę populację tej samej analizie cyklu komórkowego.
   5. Podaj pozycje pików G_0/1 i G₂/M, stosując te same bramki z bramek tworzenia i ustawiając ograniczenia (przy użyciu utworzonych bramek) dla pozycji pików G_0/1 i G₂/M. Jest to zilustrowane na pierwszych 2 panelach rysunku 2.
      Uwaga: Do analizy danych może być również używane inne oprogramowanie, a instrukcje będą się odpowiednio różnić.

Rysunek 2: Progresja cyklu komórkowego. Pierwszy panel (Wszystkie komórki) jest bramkowany na populacji komórek zdefiniowanej przez bramkę wykluczenia dubletu. Populacja ta została przedstawiona na histogramie z 7-AAD na osi X. Szczyt piku G_0/1 jest oznaczony strzałką poniżej osi. W kolejnych panelach komórki dodatnie BrdU zostały bramkowane, jak pokazano na rysunku 1. Wartość pozycji G_0/1 uzyskana podczas bramkowania podwójnej bramki wykluczenia jest stosowana do dodatnich bramkowanych komórek BrdU w oprogramowaniu cyklu komórkowego FlowJo. Każdy kolejny panel był bramkowany na populacji BrdU dodatniej, jak pokazano na rysunku 1 i pozycji piku G_0/1 na podstawie wartości uzyskanej podczas analizy całej populacji, jak pokazano na pierwszych dwóch panelach. Wykorzystanie frakcji ujemnej BrdU do określenia lokalizacji populacji G_0/1 dla komórek BrdU dodatnich w tej samej próbce kontroluje wszelkie niewielkie różnice w intensywności barwienia DNA między próbkami. Liczba pokazana na każdym panelu reprezentuje czas, jaki upłynął od zakończenia impulsu BrdU. Obliczone fazy cyklu komórkowego są pokazane w kolorze zacienionym na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Ta metodologia może być użyta do uzyskania szeregu informacji. W tym miejscu przedstawiono kilka zastosowań.

Ocena czasu trwania cyklu komórkowego

Aby określić czas potrzebny komórkom na przejście przez cykl komórkowy, komórki są zbierane w różnych punktach czasowych po impulsie BrdU. Interwały między ocenami mogą być dostosowane do poszczególnych analizowanych komórek. Linie komórek krwiotwórczych oceniano co godzinę przez okres 24 godzin przy braku jakiegokolwiek ...

Discussion

Możliwość analizy cyklu komórkowego jest ważna dla zrozumienia biologii nowotworów i mechanizmu działania zarówno leków, jak i genów, które wpływają na proliferację i wzrost komórek. Chociaż istnieje wiele testów, które podobno mierzą proliferację komórek, większość z nich zapewnia tylko miarę, która wskazuje liczbę obecnych komórek. Należą do nich testy, które mierzą liczbę komórek poprzez bezpośrednią wizualizację i zliczanie, aktywność metaboliczną lub stężenie ATP. Główną zaletą wielu z tych metod jest to, że są one ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw przepływowy APC BrdU	BD Biosciences	552598	Zawiera przeciwciało BrdU, 7-AAD i bufor BD Cytofix/Cytoperm (określany jako bufor utrwalający)
Bufor permeabilacyjny BD Cytoperm Plus	BD Biosciences	561651	określany jako bufor permeabilizacji
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	określany jako bufor płuczący
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  mm Probówki FACS	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Barin Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA cytometr przepływowy	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 bez L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Płodowa surowica bydlęca	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamina	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoksyurydyna	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 kolby wentylowane	BD Biosciences	355001
Pipety 25  ml	Greiner	760180
Pipety Aersol 200  &mikro; l	Pipety Interpath	24700
Aersol 1  ml	Interpath	24800
Wirówka	Spintron	GT-175R
Inkubator CO2	Binder	C 150
AF488 anty-histon H3 Fospho (Ser10) Sygnalizacja	komórkowa	przeciwciała 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Sygnalizacja komórkowa mAb królika		2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Sygnalizacja komórkowa mAb królika		2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128