Technika przeszczepu nerki u myszy

Podsumowanie

Celem tego manuskryptu jest opisanie kroków wymaganych do przeprowadzenia przeszczepu nerki u myszy, zwracając szczególną uwagę na szczegóły zespolenia tętniczego.

Streszczenie

Pierwsza technika przeszczepu nerki na myszach została opublikowana w 1973 roku¹ przez laboratorium Russella. Chociaż zajęło kilka lat, aby inne laboratoria stały się biegłe w tej technice i wykorzystywały ją, obecnie jest ona szeroko stosowana przez wiele laboratoriów na całym świecie. Znaczące udoskonalenie oryginalnej techniki wykorzystującej aortę dawczą do tworzenia zespolenia tętniczego zamiast tętnicy nerkowej zostało opracowane i zgłoszone w 1993 r. przez Kalinę i Mottram ², a dalszy postęp pochodził z tego samego laboratorium w 1999 r. ³. Chociaż można stać się biegłym w tym modelu, przeszukanie literatury pokazuje, że wiele laboratoriów nadal doświadcza wysokiego odsetka utraty przeszczepu z powodu zakrzepicy tętniczej. Opisujemy tutaj technikę, która została opracowana w naszym laboratorium, a która znacznie zmniejsza skrzeplinę tętniczą zgłaszaną przez innych ^4,5. Osiąga się to poprzez utworzenie mankietu piętowo-palcowego aorty podnerkowej dawcy, który ułatwia większe zespolenie i prostszy przepływ krwi do nerki.

Wprowadzenie

Od 1973 roku model przeszczepu nerki u myszy jest cennym narzędziem badawczym, ale problemy techniczne utrudniają jego powszechne stosowanie. Na przestrzeni lat opublikowano kilka artykułów szczegółowo opisujących ulepszenia/udoskonalenia tej procedury. Jako model głównie unaczynionego przeszczepu narządów litych, procedura ta jest prawdopodobnie druga po heterotopowym modelu przeszczepu serca, który również został opracowany przez laboratorium Russella w 1973 ^roku. Oba modele nadają się do badań nad allogenicznymi reakcjami odrzucenia, rozwojem opóźnionej funkcji przeszczepu i uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym.

Jednym z najczęstszych problemów zgłaszanych przy przeszczepie nerki jest stosunkowo wysoka częstość występowania zakrzepicy tętniczej ^4,5,7, której również doświadczyliśmy w naszym laboratorium. W związku z tym postanowiliśmy przeprowadzić przegląd literatury na temat powstawania skrzeplin i ewentualnie znaleźć przyczynę tego problemu technicznego, a także opracować możliwe rozwiązanie. Najbardziej prawdopodobną przyczyną zakrzepicy jest nieco kręta droga, jaką krew pokonuje od aorty biorczej do aorty nerkowej dawcy, a następnie dalej do tętnicy nerkowej dawcy. Ta ścieżka powoduje turbulencje w tętnicy nerkowej, które mogą prowadzić do aktywacji płytek krwi i tworzenia się skrzepliny. Na podstawie ostatnich obserwacji i przeszukania odpowiedniej literatury ^8-14 opracowaliśmy nową technikę, która zmniejszyła zakrzepicę do 0%.

Opisana tutaj technika różni się od wcześniej opisanych technik tworzenia mankietu tętniczego pięty i palców, co poprawia przepływ krwi i znacznie zmniejsza powstawanie skrzeplin. Mankiet jest tworzony przez podzielenie aorty podnerkowej w poprzek powierzchni ujścia tętnicy nerkowej pod kątem mniejszym niż 45^o do osi podłużnej aorty (ryc. 1A i 1B). Daje to mankiet o długości około 2 mm. Żylna łata Carrela powstaje przez przecięcie żyły nerkowej do IVC, zwiększając w ten sposób średnicę mankietu. Mankiet pięty i palców u nogi dawcy aorty brzusznej dawcy jest zespolony z boku do aorty brzusznej biorcy, a plaster żyły nerkowej/IVC dawcy jest zespoleny z boku do żyły głównej dolnej biorcy (IVC). Moczowód jest następnie wprowadzany do pęcherza moczowego i zakotwiczany w nim, jak opisano przez Hana i wsp. ³.

Dla tego badania porównano nieleczone przeszczepy z ciepłym czasem niedokrwienia (tj. bez zimnego niedokrwienia). W tym przypadku ciepłe niedokrwienie odnosi się do czasu od ustania przepływu krwi przez nerkę dawcy (krok 1.11 poniżej) i reperfuzji przeszczepu u biorcy (krok 2.11 poniżej). Zimne niedokrwienie odnosi się do czasu, w którym nerka nie jest perfundowana i jest przechowywana w chłodni do początku zabiegu implantacji.

Protokół

Wszystkie myszy zostały zakupione w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i trzymane w warunkach wolnych od patogenów na University of Colorado Denver, Barbara Davis Center Animal Facility zgodnie z wytycznymi NIH i za zgodą University of Colorado Denver IACUC.

1. Pobranie nerki od dawcy

1. Sterylizuj wszystkie narzędzia, noś sterylne rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Wszystkie operacje należy wykonywać przy użyciu mikroskopu operacyjnego.
2. Chirurgicznie usunąć nerki dawcy myszy od dawców znieczulonych pentobarbitalem (60 mg / kg IP). Ustal głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i obserwuj częstość oddechów.
3. Przypnij futro, a następnie unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów. Przygotuj skórę z jodonem powidonu i ułóż mysz w sterylny sposób.
4. Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Cofnij jelito w górę i uzewnętrznij je na klatkę piersiową. Utrzymuj jelito owinięte sterylną, wilgotną gazą przez cały czas trwania zabiegu.
5. Zidentyfikuj wielkie naczynia brzuszne i zmobilizuj je, zidentyfikuj wszelkie gałęzie lędźwiowe i kauteryzuj je lub podwiązaj za pomocą nylonowego szwu 10/0.
6. Bezpośrednio dystalnie do lewej nerki naczynia nerkowe rozdzielić żyłę główną dolną (IVC) i aortę brzuszną (AA) przez rozwarstwienie na około 2 mm. Podwiązać nylonem 10/0 i oddzielić małe gałęzie tętnicze i żylne od naczyń nerkowych.
7. Teraz ostrożnie oddziel żyłę nerkową od tętnicy nerkowej poprzez rozwarstwienie tych struktur. Pozwala to na dokładne stworzenie łaty Carrela na bliższym końcu żyły nerkowej, która posłuży do utworzenia zespolenia koniec do boku do biorcy IVC.
8. Zidentyfikuj, podwiąż i podziel lewe naczynia nadnerczy. Umożliwia to dostęp do aorty nadnerczowej, a jedwabny szew 6-0 jest umieszczany wokół aorty w ramach przygotowań do podwiązania, ale nie jest w tym czasie wiązany.
9. Zmobilizuj nerkę, naczynia i moczowód z otaczającej powięzi. Obróć nerkę w prawo i podwiązaj/podziel wszelkie tylne gałęzie. Następnie przywróć nerkę w lewo.
10. Teraz skieruj uwagę na moczowód. Nie naruszając wnęki nerkowej, uwolnij moczowód z otaczającej go powięzi, dbając o zachowanie naczyń moczowodowych. Podziel moczowód na poziomie przewodu nasieniowodowego. Nerka jest teraz gotowa do regeneracji.
11. Powoli wstrzyknąć 300 jednostek heparyny do dystalnego IVC, powodując w ten sposób heparynizację dawcy. Zawiązać jedwabny szew 6-0 umieszczony wokół nadnerczowego AA i wykonać perfuzję lewej nerki przez dystalną aortę brzuszną za pomocą 0,8 ml roztworu soli fizjologicznej heparyny (100 U/ml).
12. Po ustaniu perfuzji natychmiast utwórz żylny plaster Carrela, aby wyeliminować przepływ wsteczny do nerki. Cofnij żyłę nerkową w kierunku nerki, odsłaniając AA i tętnicę nerkową pod spodem.
13. Podziel aortę przylegającą do tętnicy nerkowej, tworząc mankiet pięty i palców, jak pokazano na rysunku 1. Usunąć nerkę, naczynia i moczowód od dawcy.
14. Nerkę należy pobrać bezpośrednio do wcześniej przygotowanego biorcy (0 min czas niedokrwienia zimna) lub przechowywać w temperaturze 4 ^oC w wybranym roztworze przez wcześniej określony czas do czasu implantacji. Poddano dawcom eutanazję przez wykrwawienie i zwichnięcie szyjki macicy. Całkowity czas rekonwalescencji nerki dawcy wynosi ok. 15-20 min.

2. Technika implantu nerkowego

1. Znieczulić mysz biorcę pentobarbitalem (dawka początkowa 60 mg/kg IP, w razie potrzeby dawka uzupełniająca 25 mg/kg IP). Ustal głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i obserwuj częstość oddechów. Obetnij futro, a następnie unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych ograniczeń i nałóż maść okulistyczną na oczy. Przygotuj skórę z jodonem powidonu i ułóż mysz w sterylny sposób.
2. Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Cofnij jelito wyżej i uzewnętrznij na klatkę piersiową. Utrzymuj jelito owinięte sterylną, wilgotną gazą przez cały czas trwania zabiegu.
3. W tym czasie wykonaj prawostronną nefrektomię. Podwiązać tętnicę nerkową i żyłę za pomocą szwów jedwabnych 6-0. Wyciąć nerkę dystalnie do szwów. Podwiązać moczowód jedwabiem 6-0, a następnie podzielić proksymalnie do nerki.
4. Odizoluj aortę brzuszną i żyłę główną dolną (IVC) poniżej naczyń nerkowych. Umieść bawełniane opaski 4-0 wokół aorty i IVC górne, a następnie poniżej miejsca zespolenia. Zidentyfikuj i podwiąż wszelkie naczynia lędźwiowe w terenie za pomocą nylonowego szwu 10-0.
5. Zawiąż bawełniane krawaty, najpierw niższe, a następnie lepsze. W ten sposób część krwi zostaje zatrzymana w aorcie, co ułatwia aortomię.
6. Uformuj aortomię za pomocą igły 30G, aby wprowadzić się do światła aorty. Przedłuż nacięcie cienkimi mikronożyczkami na długość około 2 mm.
7. Wykonaj zespolenie końcowo-boczne mankietu piętowo-palcowego aorty dawcy z aortą biorcy w następujący sposób. Umieść nylonowy szew podtrzymujący 10-0 w aorcie dawczej i do dolnego kąta nacięcia w aorcie biorcy i zawiąż.
8. Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w aorcie dawczej i górnym rogu nacięcia w aorcie brzusznej i zawiąż. Wykonaj biegnącą linię szwu od górnej do dolnej w bocznej ścianie aorty i przywiąż do wcześniej umieszczonego ściegu podporowego. Następnie zszyj ścianę przyśrodkową w sposób biegowy i zawiąż.
9. Wykonać zespolenie końca z boku żyły nerkowej dawcy do IVC biorcy w następujący sposób. Nakłuć IVC igłą 30G i przedłużyć nacięcie cienkimi mikronożyczkami. Przywiąż żyłę nerkową dawcy do dolnego rogu nacięcia w IVC nylonem 10-0. Wykonaj linię szwów biegnących między żyłą nerkową a IVC i zawiąż.
   UWAGA: Niezwykle ważne jest również, aby uzyskać pełną grubość przejść igły do szwu, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną. Odwrócenie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Chociaż hemostatyczny środek krzepnięcia może być przydatny do zmniejszenia przecieków, zalecamy, aby chirurg zamiast tego polegał na dobrej technice.
10. Upewnij się, że zespolenia są "czyste". Oznacza to, że przeciwległe ściany nie są zaczepiane podczas umieszczania szwów. Spowoduje to znaczne zwężenie przepływu, co spowoduje nieudany przeszczep, a w skrajnych przypadkach paraliż kończyn tylnych.
    UWAGA: Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia nerki.
11. Zwolnij dystalną bawełnianą opaskę 4-0, przywracając przepływ żylny. Po zaobserwowaniu hemostazy zespolenia żylnego stopniowo poluzuj proksymalną bawełnianą krawat 4-0 i obserwuj zespolenie tętnicze pod kątem hemostazy.
12. Zdejmij bawełniane opaski z myszy, gdy oba zespolenia zostaną uznane za bezpieczne. Przekłuć pęcherz igłą o sile 20 G, tworząc dwa otwory.
13. Przełóż końcówki zakrzywionych kleszczy przez otwory i przeciągnij moczowód dawcy przez pęcherz za pomocą kleszczy z bliższym końcem moczowodu zakotwiczonym w ścianie pęcherza moczowego za pomocą dwóch nylonowych szwów 10-0. Przyciąć nadmiar moczowodu wystającego z drugiego otworu, umożliwiając cofnięcie moczowodu w pęcherzu moczowym i zamknąć otwór dwoma nylonowymi szwami 10-0.
14. Wróć do jelita brzusznego. Zamknij ścianę brzucha w dwóch warstwach za pomocą szwu 5-0 Silk w sposób biegowy.
15. Podać 1,0 ml bolusa sterylnego, ciepłego roztworu soli fizjologicznej do jamy brzusznej w ramach resuscytacji płynowej po zamknięciu, a po operacji wstrzyknąć podskórnie 0,8 ml soli fizjologicznej. Podczas zabiegu nie są wymagane żadne inne środki wspomagające.
16. Odzyskaj zwierzę na kocu rozgrzewającym. Całkowity czas implantacji to ok. 35-45 min. Podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml na początku zabiegu i co 6-12 godzin przez 72 godziny po operacji.

3. Nefrektomia kontrallateralna

1. W zależności od wymagań protokołu, kilka dni po zabiegu implantacji należy wykonać nefrektomię kontralateralną w znieczuleniu izofluranem (5% wziewnego izofluranu do indukcji, 1,5-2,0% do konserwacji).
2. Wejdź do jamy brzusznej i delikatnie cofnij jelito w prawo od zwierzęcia. Odsłoń lewą nerkę i tępo wypreparuj z otaczającej powięzi.
3. Podwiązać tętnicę nerkową, żyłę i moczowód za pomocą jedwabnych szwów 6-0, a następnie wyciąć nerkę powyżej szwów i usunąć nerkę. Całkowity czas operacji wynosi ok. 10 min.

4. Ocena przeszczepu

1. Zmierz stężenie kreatyniny w surowicy za pomocą metody alkalicznego pikonianu (reakcja Jaffego).

Wyniki

Ta technika chirurgiczna pozwala na proste badania przeżycia/odrzucenia przeszczepu, albo na dość skomplikowane protokoły eksperymentalne. Na poniższych rysunkach przedstawiono zalety stosowania tej ulepszonej techniki zespolenia tętniczego. Stosując tę technikę, znacznie zmniejszyliśmy częstość występowania zakrzepicy tętniczej z 35% do 0%, zwiększając w ten sposób produktywność. Stosujemy tę technikę od ponad roku z utrzymanym tym samym wynikiem 0% zakrzepicy. Rysunek 1 opisuje metodę tworzenia mankiet...

Dyskusja

Opanowanie tej techniki przeszczepu jest trudne, ale gdy już się ją osiągnie, jest to bardzo potężne narzędzie badawcze. Pacjent chirurg/badacz zostanie nagrodzony dbałością o szczegóły i spójnością techniki, co jest kluczem do opanowania każdej procedury chirurgicznej, tym bardziej w przypadku małych modeli zwierzęcych. Trudności techniczne związane z opanowaniem przeszczepu nerki u myszy są wielorakie i jest wysoce prawdopodobne, że przed przystąpieniem do tej procedury należy zdobyć doświadczenie w innych modelach prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Prosty kleszcz do mikropreparacji #5	RS-5015	11295-51
Zakrzywiony kleszcz do mikropreparacji #7	RS-5047	11297-00
Zakrzywiony ząbkowany kleszcz	RS-5137	11052-10
Nożyczki do mikropreparacji Vannas, krótkie	RS-5610		09.140.08
Nożyczki do mikropreparacji, proste, ostre, długie		11.602.11
		igły z mikrouchwytem sprężynowym	11.549.15
	do komarów prosty	91308-12
Nożyczki do mikropreparacji, proste,	RS-5962	14078-10
Nożyczki do mikropreparacji, zakrzywione,	RS-5981	14079-10
Mikro zwijacz	RS-6540
Taca na narzędzia, 10" x 6 i frac12; ” x & frac34; "	RT-1350S
Szew jedwabny, 5/0, szpula 22,5 m	18020-50
		Aplikatory bawełniane
B-D 1cc insulina, #329424		Fisher-brand, #23-400-100
			powidonowo-jodowe
PDI, #B40600
4/0 Krawaty
Bawełna domowa autoklawizowana z narzędziami