Artykuł metodologiczny

Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52849

⸱

12 sierpnia 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

W tym artykule

Podsumowanie

Wyciszanie genów przez siRNA stanowi wygodną strategię eksperymentalną do analizy funkcji biologicznych zależnych od BRCA2 z natychmiastowymi implikacjami dla lepszego zrozumienia biologii raka. Przedstawiono metodę skutecznego wyciszania BRCA2 wraz z eksperymentalną procedurą wykrywania i ilościowego określania zmian w ekspresji białka BRCA2 poprzez immunoblotting w ludzkich liniach komórkowych.

Streszczenie

Wyciszenie białka supresorowego BRCA2 i jego wykrycie za pomocą konwencjonalnych analiz biochemicznych stanowi wielkie wyzwanie techniczne ze względu na duży rozmiar ludzkiego białka BRCA2 (około 390 kDa). Informujemy o modyfikacjach standardowych protokołów transfekcji siRNA i immunoblottingu w celu wyciszenia ludzkiego BRCA2 i wykrycia endogennego białka BRCA2 w ludzkich liniach komórkowych nabłonka. Kluczowe kroki obejmują wysoki stosunek odczynnika siRNA do transfekcji i dwie kolejne rundy transfekcji siRNA w tym samym eksperymencie. Korzystając z tych i innych modyfikacji standardowego protokołu, konsekwentnie osiągamy ponad 70% wyciszenie ludzkiego genu BRCA2, co oceniono na podstawie analizy immunoblottingu z przeciwciałami anty-BRCA2. Ponadto denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze 55 °C zamiast konwencjonalnej 70-100 °C oraz inne techniczne optymalizacje procedury immunoblottingu umożliwiają wykrycie nienaruszonego białka BRCA2 nawet wtedy, gdy dostępne są bardzo małe ilości materiału wyjściowego lub gdy poziomy ekspresji białka BRCA2 są bardzo niskie. Skuteczne wyciszanie BRCA2 w komórkach ludzkich stanowi cenną strategię zakłócania funkcji BRCA2 w komórkach z nienaruszonym BRCA2, w tym w komórkach nowotworowych, w celu zbadania nowych szlaków molekularnych i funkcji komórkowych, na które mogą mieć wpływ patogenne mutacje BRCA2 w nowotworach. Adaptacja tego protokołu do skutecznego wyciszania i analizy innych "dużych" białek, takich jak BRCA2, powinna być łatwo osiągalna.

Wprowadzenie

Gen BRCA2 (BReast CAncer susceptibility gene-2) koduje białko supresorowe nowotworu, które odgrywa kluczową rolę w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA poprzez regulację funkcji enzymu rekombinazy Rad51 1. BRCA2 jest również zaangażowany w modulację transkrypcji i kontrolę cyklu komórkowego 2. Mutacje germinalne w genie BRCA2 wywołują autosomalną dominującą podatność na raka piersi i jajnika u kobiet oraz raka prostaty u mężczyzn, a także predyspozycje do innych typów nowotworów 3,4. Jednak pomimo zwiększonego ryzyka zachorowania na raka, mutacje BRCA2, które hamują lub zmniejszają funkcję BRCA2, mogą sprawić, że komórki rakowe będą bardziej podatne na chemioterapeutyki, które powodują uszkodzenie DNA 5-7. Sporadyczne nowotwory wykazują niski odsetek mutacji BRCA2 (< 3%), chociaż w niektórych typach nowotworów wykryto obniżony poziom białka BRCA2, co sugeruje, że białko BRCA2 może zostać utracone podczas nowotworzenia w sporadycznych nowotworach poprzez mechanizmy niezależne od mutacji 7,8. Dlatego ważne jest, aby w pełni zrozumieć funkcje BRCA2 w kontekście biologii nowotworów, a także w innych warunkach biologicznych.

Potężnym narzędziem używanym do identyfikacji nowych funkcji genu w komórkach ssaków jest wyciszenie jego ekspresji. Na przykład, wyciszenie ekspresji BRCA2 w różnych normalnych komórkach nabłonka doprowadziło ostatnio do zidentyfikowania nowej funkcji BRCA2 jako regulatora oporności na anoikis, co jest ważnym krokiem w nabywaniu zdolności inwazyjnej i przerzutowej komórek nowotworowych 9. Wyciszanie genów można osiągnąć poprzez wprowadzenie do komórek małych cząsteczek RNA interferujących (si) lub krótkich cząsteczek RNA typu spinka do włosów (sh) ukierunkowanych na określony gen. Wysoka siła działania siRNA i łatwość użycia sprawiają, że jest to preferencyjne narzędzie do wyciszania eksperymentów mających na celu uzyskanie nowego wglądu w krytyczne procesy biologiczne i identyfikację nowych celów terapeutycznych. Jednak skuteczne obniżenie ekspresji genów może nie być łatwe do osiągnięcia dla wszystkich genów i może być bardzo zmienne w zależności od typu komórki. Ponieważ spadek poziomu białek wewnątrzkomórkowych jest najistotniejszym badanym fenotypem, kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie wyciszania genów za pomocą analizy immunoblottingu produktu genu. W związku z tym białko BRCA2 stanowi kolejne wyzwanie: ze względu na to, że białko jest duże (około 390 kDa), istnieją trudności techniczne w przypadku konwencjonalnej analizy biochemicznej, w tym immunoblottingu.

Przedstawiamy tutaj protokół zoptymalizowany pod kątem skutecznego wyciszania BRCA2 w ludzkich liniach komórkowych nabłonka oraz szybkiego i skutecznego wykrywania knockdownu białka BRCA2 za pomocą analizy immunoblottingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj roztwory siRNA

  1. Zawiesić 5 nmol zaszyfrowanych (Ctrl) i 5 nmol wysuszonych granulek BRCA2 siRNA w 100 μl wody wolnej od RNaz (końcowe stężenie siRNA: 50 μM). Jest to podstawowy siRNA i musi być przechowywany w temperaturze -20 °C w 10 μl podwielokrotności.
  2. Pobrać podwielokrotność 10 μl z podstawowego siRNA i dodać 40 μl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać 10 μM roztworu roboczego siRNA. Rozcieńczenie to należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Roztwór roboczy siRNA nie powinien być zamrażany/rozmrażany więcej niż 3 razy.

2. Zasiewanie ludzkich linii komórkowych nabłonka

  1. Usunąć pożywkę wzrostową z linii komórkowych ludzkiego nabłonka rosnących jako monowarstwy komórek na płytkach do hodowli tkankowych w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Umyć komórki w płytce raz za pomocą RT PBS (10 ml PBS na płytkę 100 mm).
  3. Aby oderwać komórki od płytki, dodaj 2 ml 0,25% roztworu trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubuj 3-5 minut w zależności od typu komórki.
  4. Przed pobraniem oderwanych komórek należy zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
  5. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Odwirować komórki przy 320-330 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
  7. Zawiesić osady komórkowe w 5 ml pożywki wolnej od antybiotyków.
  8. Policz komórki pod mikroskopem w komorze Burkera lub za pomocą automatycznego systemu liczenia zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Wysiewaj komórki na płytkach 6-dołkowych, aby po 24 godzinach były zlewające się w około 80% (0,5-1 x106 komórek w 2 ml pożywki na każdą studzienkę). Optymalna liczba komórek do wysiewu może się różnić w zależności od konkretnych linii komórkowych i tempa wzrostu.
    UWAGA: W tym momencie nie dodawaj antybiotyków do pożywki, ponieważ antybiotyki negatywnie zakłócą skuteczność transfekcji. Bardzo ważne jest, aby komórki znajdowały się w niskich pasażach hodowlanych (< 10), aby osiągnąć wysoką skuteczność transfekcji siRNA BRCA2.

3. Komórki transfekcyjne z siRNA

  1. Dwadzieścia cztery godziny po posianiu komórek przystąp do pierwszej rundy transfekcji.
    1. Rozcieńczyć 6 μl odczynnika do transfekcji swoistego dla 10 siRNA na bazie lipidów w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.
    2. Rozcieńczyć 3 μl 10 μM siRNA (30 pmol) w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.
    3. Połączyć rozcieńczone siRNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Podczas inkubacji usunąć pożywkę z komórek i dodać 2 ml świeżej pożywki wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C (bez antybiotyków).
    5. Dodać 250 μl kompleksów odczynników do transfekcji siRNA do komórek (ilość ta dotyczy pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej).
    6. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Po 24 godzinach przystąpić do drugiej rundy transfekcji, powtarzając kroki 3.1.1-3.1.5 z następującą modyfikacją dla kroku 3.1.2: rozcieńczyć 5 μl 10 μM siRNA (50 pmol) w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.
    1. Inkubować komórki przez 1-2 dni w temperaturze 37 °C przed analizą.
      UWAGA: Dwie rundy transfekcji i użycie wysokiego stosunku siRNA do odczynnika do transfekcji w drugiej rundzie są niezbędne do uzyskania wysokiej skuteczności wyciszania BRCA2.

4. Liza komórek do analizy immunoblottingu

  1. Przygotować świeży bufor do lizy z PBS (pH 7,4) zawierający 1% niejonowego, niedenaturującego detergentu oktylofenoksypolietylenu, 5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM ortowananianu sodu, 10 mM fluorku sodu, 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μg/ml leupeptyny, 10 μg/ml aprotyniny. Trzymaj go na lodzie.
  2. Usunąć pożywkę z komórek i przemyć je raz zimnym PBS (2 ml/studzienkę) w płytce. Aby zapobiec przeniesieniu PBS, należy całkowicie usunąć go z płytki.
  3. Dodać 200 μl buforu do lizy do każdego dołka.
    UWAGA: Jeśli komórki muszą być użyte również do innych testów, trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1-2.6 i ponownie zawieś komórki w odpowiednim buforze/pożywce zgodnie z zastosowaniem, które ma być użyte.
  4. Delikatnie obrócić płytkę, aby równomiernie rozprowadzić bufor do lizy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze.
  5. Zebrać lizat komórkowy w probówce mikrowirówkowej na lodzie za pomocą skrobaka do komórek.
  6. Odwirować przy 17 900 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowej probówki.
  7. Zmierzyć stężenie białka za pomocą dostępnego na rynku testu białkowego zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Analiza immunoblottingu BRCA2

  1. Przygotować bufor do biegania, rozcieńczając 50 ml 20x Tris-Acetate SDS bufor do biegania (50 mM trycyny, 50 mM zasady Tris, 0,1% SDS, pH 8,24) 950 ml wody destylowanej.
  2. Przygotować próbkę w następujący sposób: dodać 15 μg całkowitego lizatu komórkowego, 5 μl 4 μl buforu próbki zawierającego dodecylosiarcan litu o pH 8,4, 2 μl 10 x środka redukującego próbkę (0,5 M DTT) i bufor do lizy do końcowej objętości 20 μl.
    UWAGA: Protokół ten umożliwia wykrycie BRCA2 w normalnych liniach komórkowych również przy użyciu mniejszej ilości białek ogółem (do 5 μg).
  3. Denaturyzacja próbek w temperaturze 55 °C przez 10 min.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać 55 °C. Ponieważ białko BRCA2 jest termoczułe11, wyższe temperatury denaturacji powodują stałą utratę nienaruszonego białka BRCA2 o pełnej długości (390 kDa).
  4. Ustawić komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Załadować próbki i 10 μl wstępnie wybarwionego wzorca białka o wysokiej masie cząsteczkowej na prefabrykowany żel (octan trisu 3-8%) i pracować pod napięciem 120 V przez około 2 godziny 12. Zatrzymaj przebieg elektroforetyczny, zanim niebieski znacznik o wartości 55 kDa opuści prefabrykowany żel.
  6. Przygotować bufor transferowy z 50 ml 20-krotnego buforu transferowego, 100 ml 100% metanolu i 850 ml wody.
  7. Aktywować membranę PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przez moczenie w 100% metanolu przez 5 minut, płukanie wodą destylowaną i równowaga w buforze transferowym przez co najmniej 5 minut. Namoczyć gąbki aparatu transferowego w buforze transferowym w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  8. Po zakończeniu przebiegu elektroforetycznego złóż kanapkę w stosie transferowym w następującej kolejności (od dołu do góry): trzy gąbki nasycone buforem transferowym, jeden arkusz papieru klasy 3MM nasycony buforem transferowym, żel, aktywowana membrana PVDF, jeden arkusz papieru klasy 3MM nasycony buforem transferowym, trzy gąbki nasycone buforem transferowym 13,14. Umieścić stos w aparacie i przenieść białka o natężeniu 350 mA przez 4 godziny w temperaturze 4 °C lub w temperaturze 180 mA przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ponieważ BRCA2 jest białkiem bardzo dużym, ważne jest, aby wydłużyć czas transferu z 1 godziny (zgodnie z sugestiami producenta i większości protokołów transferu) do 4 godzin lub z dnia na dzień, aby zapewnić całkowity transfer białek o dużej masie cząsteczkowej. Ponadto, ze względu na długi czas przenoszenia, konieczne jest wykonanie blottingu w chłodni w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować przegrzanie i ułatwić demontaż kanapek. Półsuche systemy transferowe nie są dobre do przenoszenia dużych białek.
  9. Po przeniesieniu przemyć membranę TBS, zablokować ją na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w TBS-Tween 0,25% (TBS-T) zawierającej 5% odtłuszczonego mleka w proszku i sondować przez noc w temperaturze 4 °C 30 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-BRCA2 (200 μg/ml), rozcieńczonego w 9 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku [rozcieńczenie 1:300 (v/v)].
  10. Przemyć membranę trzykrotnie (po 10 minut) TBS-T, a następnie inkubować filtr przez 1 godzinę z 1 μl wtórnego przeciwciała przeciw królikowi sprzężonego z peroksydazą chrzanową rozcieńczonego w 10 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Następnie przemyj membranę trzy razy (po 10 minut) TBS-T.
  11. Przeprowadzić immunodetekcję za pomocą ECL w celu ujawnienia białka BRCA2 przy użyciu odczynnika Western Blotting Detection o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wizualizacja pasm immunochemiluminescencyjnych na foliach ECL o wysokiej rozdzielczości.
  12. Przeprowadzić immunodetekcję za pomocą przeciwciała dla genu porządkowego, takiego jak β-tubulina (55 kDa), na tym samym filtrze, co kontrola obciążenia, używając przeciwciała monoklonalnego przeciwko β-tubulinie rozcieńczonego w stosunku 1:1000 (10 μl przeciwciała antytubulinowego w 10 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć i inkubować przeciwciało drugorzędowe zgodnie z opisem dla BRCA2 (5.10-5.11), z wyjątkiem stosowania przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową zamiast przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi.
  13. Uzyskaj cyfrowy obraz filmów odciśniętych za pomocą pasm immunochemiluminescencyjnych i przeanalizuj intensywność pasma za pomocą dedykowanego oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed przystąpieniem do analizy biologicznej/biochemicznej w celu zbadania wpływu wyciszenia genu BRCA2 na funkcje komórkowe, pierwszym krokiem jest potwierdzenie swoistości wyciszenia poprzez równoległe zastosowanie kontrolowanego siRNA (siRNA niecelującego) oraz BRCA2 siRNA (małe interferujące RNARysunek 1A). Ważne jest przeprowadzenie drugiej rundy transfekcji siRNA przy zastosowaniu wysokiego stosunku siRNA do czynnika transfekcyjnego, aby uzyskać wysoką wydajność BRCA2 wyciszanie. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ mutacje germinalne genu BRCA2 prowadzą do zwiększonego ryzyka kilku typów nowotworów, w tym raka piersi u kobiet i mężczyzn, raka jajnika, raka prostaty, raka trzustki i czerniaka 3,4, podjęto szereg badań w celu zrozumienia biologicznej funkcji białka BRCA2. Większość z tych badań ma podłoże genetyczne, głównie ze względu na trudności techniczne w analizie tak gigantycznego białka jak BRCA2. Opisana tutaj metoda wyciszania i analizy ekspresji białka BRCA2 stanowi skuteczne narzędzie do badan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 i RBNE08HWLZ_012, oraz przez włoskie Ministerstwo Gospodarki i Finansów dla CNR na projekt "FaReBio di Qualità".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus Odczynnik
RNAiMAX do puli lipofekctaminy Life Technologies13778075Odczynnik do transfekcji
OPTI-MEM I Medium o zredukowanej surowicyTechnologies31985-070Pożywka do zabiegu transfekcji
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Prefabrykatżelowy Life TechnologiesEA0378Żel do elektroforezy białek
NuPAGE LDS Bufor próbki Life TechnologiesNP0007Odczynnik do elektroforezy białek
NuPAGE Środek redukujący próbki (10x)Life TechnologiesNP0004Odczynnik do elektroforezy białek
NuPAGE AntioxidantLife TechnologiesNP0005Odczynnik do elektroforezy białek
HiMark Wstępnie barwiony standard białkaLife TechnologiesLC5699Wstępnie zabarwiony marker do żelu elektroforeza
XCell SureLoc Mini-Cell  SystemLife TechnologiesEI0002Sprzęt do elektroforezy/transferu białek
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Odczynnik do Western blotting
membrany PVDFMilliporeIPVH00010 Odczynnik do Western blotting
NuPAGE Transfer BufferLife TechnologiesNP0006-1Odczynnik do Western blotting
BRCA2 H-300 królicze przeciwciało poliklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-83261:300 rozcieńczenie
Przeciwciało monoklonalne beta-tubulinySigma AldrichT4026-100UL1:1,000 rozcieńczenie
Odtłuszczone mleko w proszkuSigma Aldrich70166Odczynnik do Western blotting
Tween-20Sigma AldrichP1379Odczynnik do Western blotting
Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico/FemtoPierce Thermo Scientific34080/34096System chemiluminescencyjny
Komórki PNT1ASIGMA Aldrich (dla ECACC)95012614PNT1A ludzki, normalny nabłonek prostaty unieśmiertelniony komórkami SV40
NthySIGMA Aldrich (dla ECACC)90011609Linia komórkowa Nthy-ori 3-1 ludzkie, komórki nabłonka pęcherzyków tarczycy
Proliferacja komórek Zestaw I (MTT)Roche11465007001Zestaw do oznaczania proliferacji komórek
Life

Bibliografia

  1. Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
  2. Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
  3. Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
  4. Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
  5. Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
  6. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
  7. Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82(2013).
  8. Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
  9. Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
  10. Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
  11. Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  15. Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
  16. Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
  17. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
  18. Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
  19. Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyciszanie BRCA2transfekcja siRNAWestern blottingdetekcja bia ekprzygotowanie lizatu kom rkowegobia ka o wysokiej masie cz steczkowejanaliza supresor w nowotworowychwydajno wyciszania gen woptymalizacja immunoblottingustosunek transfekcji siRNA

Powiązane artykuły