Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość zgonów związanych z rakiem jest spowodowana przerzutami nowotworu, a nie samym guzem pierwotnym. Jednak mechanizmy leżące u podstaw przerzutów nowotworowych są nadal niejasne. Modele zwierzęce są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów i oceny nowych strategii leczenia nowotworów z przerzutami. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy opis "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów guzów narządów litych. Opisano przeżycie chirurgicznej implantacji mysich komórek raka wątrobowokomórkowego BNL 1ME A.7R.1 bezpośrednio do wątroby (narządu pochodzenia) wsobnego, kompetentnego immunologicznie szczepu myszy laboratoryjnej typu dzikiego, BALB/c. Sukces i powtarzalność tej metodologii rekomenduje ją do powszechnego stosowania w wyjaśnianiu biologicznych mechanizmów przerzutów raka narządów litych.
Wprowadzenie
Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów, o złym rokowaniu i niskiej oczekiwanej długości życia. Prawie wszystkie zgony związane z rakiem są spowodowane przerzutowym rozprzestrzenianiem się choroby z narządu pierwotnego do dodatkowych odległych narządów2-6. Progresja HCC jest złożonym procesem. Dlatego możliwość modelowania mikrośrodowiska guza, które naturalnie występuje w przerzutowym HCC w modelach zwierzęcych, może okazać się skutecznym i użytecznym sposobem na ujawnienie odpowiednich mechanizmów u ludzi. 7Niestety, mechanizmy przerzutów nowotworowych są nadal w dużej mierze niejasne. W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia modeli zwierzęcych, które umożliwią nam wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw przerzutów nowotworów, takich jak HCC3,5.
Systemy modeli mysich są bardzo użytecznym podejściem do określania mechanizmów i oceny nowych strategii leczenia przerzutowych nowotworów u ludzi5,8. Różne systemy modeli mysich, które obecnie istnieją, są świadectwem wysiłków badaczy mających na celu prawidłowe zobrazowanie złożoności choroby5,8,9.
Ogunwobi i koledzy niedawno wykorzystali chirurgiczne podejście do przetrwania, aby zademonstrować stworzenie nowego ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania przerzutów w HCC3. Ich praca pozwoliła na stworzenie "podobnego do pacjenta" modelu mysiego, który podsumowuje cechy agresywnych i przerzutowych HCC3. Wykazano ponadto, że ten mysi system modelowy może być wykorzystany do badania biologii krążących komórek nowotworowych i że ma to potencjał w uzyskaniu nowych informacji na temat mechanizmów przerzutów nowotworowych3.
Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie metodologii użytej do stworzenia tego "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego mysiego modelu przerzutów HCC3. Opisana zostanie metodologia wszczepiania mysich komórek HCC BNL 1ME A.7R.1 bezpośrednio do wątroby (narządu pochodzenia) wsobnego, kompetentnego immunologicznie szczepu myszy laboratoryjnej typu dzikiego, BALB/c3 przy użyciu chirurgii przeżycia. W przeciwieństwie do innych mysich modeli guzów ksenoprzeszczepowych, w których ludzkie komórki nowotworowe są wszczepiane myszom z niedoborem odporności, system ten jest syngeniczny i dlatego nadaje się do badania roli układu odpornościowego w przerzutach nowotworowych3,5,8. Podejście to prawdopodobnie znajdzie szerokie zastosowanie w badaniu mechanizmów przerzutów w nowotworach narządów litych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Hunter College of The City University of New York.
Uwaga: W tej eksperymentalnej procedurze użyto ośmiu myszy BALB/c. Pięciu myszom BALB/c wszczepiono 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 mysich komórek raka wątrobowokomórkowego w celu wytworzenia pierwotnych guzów. Jako grupę kontrolną wykorzystano trzy myszy BALB/c bez implantacji. BNL 1ME A.7R.1 to mysia linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego, która została uzyskana w wyniku przemiany chemicznej z mysiej nienowotworowej linii komórkowej hepatocytów BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 został uzyskany z American Type Culture Collection (ATCC).
1. Przed operacją
- Upewnij się, że myszy do wszystkich operacji przetrwania są zdrowe. Aby upewnić się, że myszy są zdrowe, sprawdź oznaki odwodnienia, kładąc się na skórze. W tych eksperymentach nie używaj myszy z jakimikolwiek objawami choroby lub stresu.
- Zważ myszy, aby upewnić się, że nie mają niedowagi. Upewnij się, że waga wynosi co najmniej 16-20 gramów.
- Przygotowanie mysich komórek HCC 5×106 BNL 1ME A.7R.1 do implantacji na mysz:
- Odessać pożywkę z 10 ml 60% - 70% zlewającego się naczynia do hodowli komórek myszy BNL 1ME A.7R.1 HCC. Przemyć dwukrotnie 5 ml PBS. Dodać 2 ml trypsyny do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z powietrzem i 5% CO2 przez 5 minut.
- Następnie należy pobrać pipetowanie 10 μl trypsynizowanych komórek do ręcznego hemocytometru w celu zliczenia komórek pod mikroskopem w powiększeniu 10X. Policz całkowitą liczbę komórek znajdujących się w czterech dużych kwadratach narożnych i pomnóż współczynnik rozcieńczenia przez całkowitą liczbę komórek. Następnie podziel przez liczbę policzonych kwadratów i pomnóż przez 106 dla stężenia komórek (komórek na ml).
- Korzystając z obliczeń, zbierz 5 milionów komórek na mysz w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Oznaczyć probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
- Ponownie zawiesić mysie komórki HCC 5×106 BNL 1ME A.7R.1 w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj te komórki na lodzie do momentu implantacji w operacji.
- Wykonuj czynności wymagane do przygotowania myszy do operacji, takie jak indukcja znieczulenia i strzyżenie włosów z dala od sterylnego sprzętu i materiałów, aby uniknąć zanieczyszczenia.
- Wywołać znieczulenie ogólne u myszy poprzez wdychanie izofluranu za pomocą parownika izofluranu wraz z tlenem przy stałym stężeniu przepływu 1 l na minutę (ok. 2,1%). Uwaga: System jest samowystarczalny i zawiera precyzyjny waporyzator, dopływ tlenu i kanister na węgiel drzewny, który jest podłączony do obwodu oddechowego potrzebnego do usuwania gazów/środków znieczulających.
- Upewnij się, że znieczulenie jest odpowiednie, aby zapobiec odczuwaniu bólu przez zwierzę podczas operacji. Uszczypnij palec u nogi i obserwuj zwierzę pod kątem braku reakcji, aby potwierdzić znieczulenie.
- W tym czasie przełącz przewód zaworu, uszczelnij do skrzynki i otwórz do stożka nosowego.
- Jak tylko mysz zostanie znieczulona, nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na rogówkę jako środek zapobiegawczy przed wysuszeniem i uszkodzeniem.
- Następnie przenieś zwierzę do obszaru przygotowania, z prawidłowo umieszczonym i podłączonym stożkiem nosowym (do znieczulenia podtrzymującego). Przygotuj miejsce nacięcia chirurgicznego do zabiegu poprzez depilację w tym obszarze przygotowania.
- Upewnij się, że obszar operacji znajduje się w miejscu wolnym od wszelkiej innej aktywności.
- Przed zabiegiem upewnij się, że powierzchnia robocza jest solidna i odpowiednio zdezynfekowana, niezabrudzona i wolna od bałaganu. Połóż na nim sterylny kawałek bielizny lub tacę chirurgiczną.
- Upewnij się, że pole operacyjne jest dostępne tylko dla osób przeprowadzających operację. Upewnij się, że sala operacyjna jest wyczyszczona i zamiatana odpowiednim środkiem czyszczącym oraz spryskana odpowiednim środkiem dezynfekującym.
- Upewnij się, że jest również umieszczony z dala od drzwi i okien, ponieważ prądy powietrza mogą rozprzestrzeniać kurz, prowadząc do zanieczyszczenia terenu.
- Przeprowadzić operację przeżycia za pomocą sterylnych narzędzi. Albo namoczyć narzędzia w środku dezynfekującym zgodnie z zaleceniami producenta, albo w autoklawie. Używaj podstawowych sterylnych materiałów, które są gotowe do użycia.
- Oddzielne narzędzia w zależności od funkcji, aby zapobiec zanieczyszczeniu sterylnych obszarów.
- Ogolić około 1 cala wokół miejsca nacięcia (nacięcia w linii środkowej), aby uzyskać dostęp do wątroby zwierzęcia. Usuń sierść zwierzęcia z dala od miejsca operacji.
- Po goleniu wyszoruj obszar środkiem dezynfekującym z mydłem (peeling chirurgiczny betadyna) i zmyj nadmiar środka dezynfekującego sterylnym roztworem PBS. Wykonaj to kilka razy, przy czym cały proces peelingu trwa około 5 minut. Usuń i wyrzuć zużyte rękawice.
- Następnie zmień odzież ochronną, taką jak fartuch chirurgiczny, top do szorowania i maska na twarz. Następnie zdezynfekuj ręce odpowiednim roztworem do szorowania przed założeniem rękawic chirurgicznych. Uwaga: Jest to niezbędny krok, aby zapobiec zrzucaniu i zanieczyszczeniu pola operacyjnego potencjalnymi zanieczyszczeniami.
2. Chirurgia
- Zapewnij zewnętrzne źródło ciepła dla ciepła przez cały okres znieczulenia. Zwierzę może doświadczyć pewnej hipotermii, ponieważ znieczulenie powoduje zaburzenia termoregulacji; Dlatego utrzymuj temperaturę ciała.
- Połóż mysz na plecach przez cały czas trwania operacji.
- Przymocuj kończyny przednie, tylne i ogon myszy do stołu operacyjnego za pomocą kawałków taśm chirurgicznych.
- Wykonaj nacięcie w linii prostej bezpośrednio poniżej xyphisternum.
- Użyj sterylnego, samozatrzymującego się retraktora chirurgicznego, aby odsłonić wątrobę.
- Za pomocą strzykawki z igłą 20G powoli i ostrożnie wstrzyknąć 100 μl PBS zawierającego 5×106 BNL 1ME A.7R.1 mysich komórek HCC do prawego płata wątroby.
- Po wyjęciu igły należy przyłożyć sterylny wacik na co najmniej 1 minutę, aby zatamować potencjalne krwawienie z powodu dużego unaczynienia wątroby.
- Zamknij tkankę podskórną wchłanialnym szwem, a następnie zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych. Następnie ponownie oczyść ranę peelingiem betadyny. Uwaga: Zapewni to zamknięcie rany pooperacyjnej.
- Podskórnie podać 100 μl soli fizjologicznej.
3. Po operacji
- Bezpośrednio po zabiegu przenieś mysz do czystej klatki z pooperacyjną kartą identyfikacyjną, aby powiadomić opiekunów o stanie myszy. Zapewnij jedzenie i wodę. Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że mysz, która właśnie przeszła operację, poradzi sobie najlepiej, jeśli będzie trzymana sama z mokrym jedzeniem i wodą przez początkowy 24-godzinny okres po operacji.
- Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą lampy grzewczej, która wytwarza ciepło nieprzekraczające 38 ºC. Użyj termometru, aby zmierzyć temperaturę, aż mysz w pełni wyzdrowieje.
- Trzymaj zwierzę w klatce, najlepiej z papierową ściółką, aby zapewnić komfort.
- Po początkowym powrocie do zdrowia należy monitorować zwierzę pod kątem oznak dyskomfortu, krwawienia, bólu i niepokoju. Podawać buprenorfinę (0,05 -0,1 mg/kg) w celu złagodzenia bólu. Uważnie monitoruj aktywność, zachowanie i wygląd, a także spożycie wody i jedzenia przez około 2 godziny. W przypadku chodzenia przenieś zwierzę z powrotem do obszaru, w którym myszy są regularnie trzymane w normalnych warunkach, i kontynuuj monitorowanie w odstępach 6-12 godzin przez 24 godziny po operacji. W razie potrzeby wykonaj kontrolę wagi.
- Jeśli jednak zwierzę ma problemy z rekonwalescencją, podejmij odpowiednie działania wspomagające. Jeśli myszy nie są w stanie wyzdrowieć, humanitarnie poddaj je eutanazji poprzez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Postępuj zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi eutanazji.
- Po operacji sprawdź, czy nie ma dowodów klinicznych na HCC, które zwykle można zaobserwować jako znaczne obniżenie oceny kondycji ciała. Uwaga: W tym momencie prawdopodobnie rozwinął się guz pierwotny w wątrobie, a złogi przerzutowe prawdopodobnie rozwinęły się w płucach.
- W tym momencie należy złożyć w ofierze wszystkie myszy (eksperymentalne i kontrolne) biorące udział w eksperymencie poprzez humanitarną eutanazję. Poddaj myszy uduszeniu dwutlenkiem węgla: bardzo powoli uwalniaj dwutlenek węgla do komory przez okres 5 -10 minut. Spowoduje to zatrzymanie oddechu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W wątrobach myszy Balb/c zaimplantowano 5×106 komórek HCC myszy BNL 1ME A.7R.1. Kliniczne objawy rozwoju HCC były widoczne 63 dni po zabiegu. W związku z tym myszy poddano humanitarnej eutanazji. U uśpionych zwierząt przeprowadzono nekropsję. Wycięto płuca i wątrobę, a następnie wykonano dokładne badanie makroskopowe w celu zidentyfikowania guzów. U jednej myszy zaobserwowano powierzchowny guz na powierzchni wątroby z pewnym przytwierdzeniem do ściany brzusznej (Rycina 1A). U drugiej myszy zao...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule tym podano szczegółowy opis metody, która została niedawno opisana przez Ogunwobi i współpracowników o udanym ustanowieniu ortotopowego syngenicznego mysiego modelu przerzutów HCC (Figura 2)3. Wskaźnik przyjmowania nowotworów do tej procedury jest na ogół wysoki. Wcześniej zaobserwowaliśmy wskaźnik wchłaniania guza na poziomie 100%3. Jednak wskaźnik poboru może być zmienny w zależności od kompetencji badacza. W niedawnym eksperymencie przeprowadzonym przez świeżo upieczon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Pascalowi DuBois za korektę artykułu. Autorzy pragną również podziękować personelowi Animal Facility w Hunter College of The City University of New York. Praca ta była wspierana przez grant NIH RCMI dla Hunter College.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pęseta do mikro preparacji | Roboz | (RS-5040) | Końcówka 0,20 x 0,12 mm |
| Graefe Micro Kleszcze preparacyjne, ząbkowana zakrzywiona końcówka | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 zęby, zakrzywiona szerokość końcówki 0,6 mm |
| Mikro zwijacz preparacyjny-Agricola (3 na 3 zęby) | Roboz | (RS-6501) | 3 X 3 zęby, głębokość 4 mm, rozpiętość 25 mm |
| Mikro zwijacz preparacyjny-Goldstein (3 na 3 zęby) | Roboz | (RS-6503) | , 3 X 3 zęby, głębokość 4 mm, rozpiętość 19 mm |
| Jameson Caliper (mierzy guzy) | Roboz | (RS-6466) | Skala 80 mm/3 cale, chromowana |
| Nożyczki do mikro preparacji, duże sissory pierścieniowe, proste i ostre | Roboz | (RS-5852) | Ostrza 23 mm, długość 4 cale, płaskie trzonki i duże pierścienie |
| Skalpel z ostrzami, do delikatnych procedur preparacyjnych | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Rękojeść skalpela | Roboz | (RS-9884) | Solidne |
| syszorki Littauer Stitch | Roboz | (RS-7074) | Długość 4,5 cala |
| Brązowy uchwyt na igłę, do łatwego wiązania szwów | Roboz | (RS-7960) | Wypukła szczęka, drobne ząbkowanie |
| Klipsy do nawijania Reflex 7MM z aplikatorem klipsa Reflex 7 | Roboz | (RS-9262) | bezpieczna, pewna alternatywna metoda zamykania ran |
| Taca na instrumenty i pokrywka | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-maszynka do strzyżenia z odłączanym ostrzem | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (Terminator zarazków) Suchy sterylizator | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | Do szybkiej dekontaminacji narzędzi do mikrosekcji. Narzędzia odkażają się w ciągu 15 sekund. |
| Igły do mikroiniekcji | VWR | BD305125 | 25G Igła |
Bibliografia
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
