Protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru gęstości brodawek grzybowych na podstawie zdjęć cyfrowych. Metoda ta włącza priorytetyzację i obiektywne wskaźniki charakterystyki do oryginalnej pracy opisowej na temat brodawek grzybowatych autorstwa Millera i Reedy'ego (1990).

Streszczenie

Celem Protokołu Denver Papillae jest użycie klucza dychotomicznego do zdefiniowania i priorytetyzacji cech brodawek grzybowatych (FP), aby zapewnić spójne punktowanie między punktantami. Protokół ten opiera się na potrzebie, która pojawiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad badań nad smakiem przy użyciu FP jako wskaźnika gęstości porów smakowych. Gęstość FP była historycznie analizowana przy użyciu charakterystyki ich morfologii Miller i Reedy z 1990 roku: okrągły, zabarwiony, jaśniejszy, duży i podwyższony. W niniejszej pracy autorzy ostrzegali, że konieczne jest nakreślenie bardziej rygorystycznych definicji morfologii FP. Pomimo tego wezwania do działania, literatura następcza była niewielka, a większość badań nadal cytuje oryginalną pracę Millera i Reedy'ego. W związku z tym raporty dotyczące gęstości FP były bardzo zróżnicowane, co w połączeniu z małymi rozmiarami prób może przyczynić się do rozbieżnych wniosków na temat roli FP we wrażliwości smakowej. Laboratorium Genetyki Smaku zbadało tę pozorną niespójność w liczeniu i odkryło, że osoby oceniające indywidualnie priorytetowo traktowały znaczenie tych cech w różny sposób i nie miały żadnych wskazówek dotyczących tego, kiedy brodawka ma niektóre, ale nie wszystkie, zgłaszane cechy FP. Rezultatem tej subiektywności jest bardzo zmienna liczba FP tego samego obrazu języka. Protokół Denver Papillae został opracowany w celu zaradzenia tej konsekwencji poprzez zastosowanie klucza dychotomicznego, który dodatkowo definiuje i ustala priorytety znaczenia cech zaproponowanych przez Millera i Reedy'ego. Proponowana metoda może pomóc w stworzeniu standardowego sposobu ilościowego oznaczania FP dla naukowców zajmujących się badaniami nad smakiem i wartościami odżywczymi.

Wprowadzenie

Brodawki to widoczne guzki na powierzchni języka. Istnieją cztery rodzaje brodawek: grzybowate (FP), foliatywne, obwodowe i nitkowate. Podczas gdy brodawki nitkowate są rozmieszczone na powierzchni języka, okołokształtne są zlokalizowane tylko z tyłu języka, a liście znajdują się po bokach. Natomiast FP znajdują się w przedniej części języka. Brodawki FP, foliowe i okołobrzegowe są uważane za smakowe, ponieważ mogą zawierać kubki smakowe, podczas gdy nitkowate nie. Kubki smakowe to skupiska komórek odpowiedzialnych za wykrywanie chemicznych degustatorów i przekształcanie bodźców w sygnał smakowy w mózgu. Cząsteczki śliny i pokarmu dostają się do kubków smakowych przez otwory zwane porami smakowymi, w których cząsteczki smaku mają potencjał aktywacji komórek smakowych.

Interesujące, istnieją duże indywidualne różnice w gęstości kubków smakowych, co po raz pierwszy zaobserwowano w badaniu histologicznym języków z 18 zwłok (Miller, 1988)¹. Same kubki smakowe nie są widoczne na powierzchni języka, jednak pory smakowe są widoczne przy użyciu odpowiednich technik powiększania, oświetlenia i barwienia, co skłoniło Millera i Reedy'ego (1990) do opracowania metody identyfikacji porów smakowych i brodawek grzybowatych za pomocą wideomikroskopii u żywych ludzi². Wiele laboratoriów zmodyfikowało swoją oryginalną technikę wideomikroskopii, wykorzystując nieruchome zdjęcia i niewielkie lub żadne powiększenie. Ponieważ jednak brodawki grzybowate są znacznie łatwiejsze do wizualizacji niż pory przy użyciu tych ostatnich technik, laboratoria zwróciły się do liczenia brodawek grzybowatych zamiast porów smakowych. Zakłada się przy tym, że gęstość brodawek grzybowatych jest rozsądną miarą zastępczą gęstości porów smakowych, mimo że wiele brodawek grzybowatych nie zawiera porów smakowych ani kubków smakowych³; FP są nie tylko bardziej widoczne i dostępne niż brodawki okołolistne i liściaste, ale ich rejestracja obrazu jest mniej czasochłonna niż analiza porów smakowych za pomocą alternatywnej metody wideomikroskopii^2,4. W 1990 roku Miller i Reedy wykorzystali tę technikę, aby odkryć, że gęstości porów smakowych są skorelowane z gęstościami FP³, co zostało następnie potwierdzone w Bartoshuk i wsp.⁵ Oprócz tego anatomicznego związku, Miller i Reedy odkryli również, że 8 osób w górnej połowie rozkładu gęstości porów smakowych oceniło również sacharozę, NaCl i propylotiouracyl (PROP) jako znacznie bardziej intensywne niż pozostałe^{8 osób.} Późniejsze prace Bartoshuka i wsp. (1994) zaobserwowały korelację między ponadprogową intensywnością smaku PROP a gęstością brodawek grzybowatych, a także gęstością porów smakowych u 42 osób⁵. Ta wygodna metoda doprowadziła do wpływowych badań donoszących, że osoby, których język ma wiele brodawek, wywołują silniejszą reakcję na wiele degustacji, w tym gorzkie degustatory fenylotiokarbamid (PTC) i PROP ^6,7.

PTC i PROP są dobrze przebadanymi degustatorami, często używanymi ze względu na wyraźny związek między fenotypem wrażliwości smakowej danej osoby a jej genotypem. Badania populacyjne wykazały, że osoby, które mają homozygotyczny recesywny diplotyp genu, TAS2R38, mają znacznie niższą wrażliwość na PROP niż nosiciele dominującego lub heterozygotycznego wariantu genu^8-10. To dziedziczne zjawisko zostało po raz pierwszy opisane w 1932 roku, kiedy Arthur L. Fox ogłosił swoje odkrycie "ślepoty smakowej" PTC¹¹. Wśród osób, które są w stanie posmakować tych gorzkich związków, intensywność zgłaszanego smaku może wahać się od lekko nieprzyjemnego do rozdzierająco gorzkiego⁶. Aby wyjaśnić wariancję, której nie można wyjaśnić za pomocą TAS2R38, wysunięto teorię, że można ją przypisać gęstości FP na języku⁴.

Wraz z postępem badań nad smakiem, dziedzina ta została podzielona na dwie szkoły myślenia wokół tej teorii dotyczącej roli FP i wrażliwości na gorzki smak. Chociaż wiele badań potwierdziło pierwotne twierdzenie, że gęstość FP jest czynnikiem wpływającym na czułość PROP^4,6,12,13, istniała niewielka, ale ważna ewentualność, która znalazła dowody na jego obalenie, zgłaszając niezdolność do odtworzenia roli^10,14,15,16. Delwiche i wsp. (2001) ostrzegał, że tendencja jest bardzo zmienna; Gęstość FP nie uwzględnia jednolicie różnic we wrażliwości na gorycz u badanych i była możliwa do wykazania tylko dla osób o co najmniej umiarkowanej wrażliwości na PROP⁷. Oprócz zastosowania mniej rygorystycznie zdefiniowanej metody Millera i Reedy'ego dotyczącej ilościowego oznaczania FP, ważne jest, aby zauważyć, że z wyjątkiem Beaver Dam Offspring Study¹⁵ przeprowadzonego przez Fischera i wsp., większość z powyższych badań miała małe rozmiary próby, co może również przyczyniać się do niespójnych ustaleń dotyczących roli FP w smaku.

Krótko mówiąc, w przełomowym artykule metodologicznym Millera i Reedy'ego (1990), autorzy zabarwili języki na niebiesko, aby określić ilościowo FP, ponieważ FP pozostają różowe, podczas gdy brodawki nitkowate wchłaniają barwnik i zmieniają kolor na niebieski. Sklasyfikowali FP jako "zaokrąglone różowe struktury o średnicy około 0,5 mm"². Podczas gdy autorzy zalecili, aby przed zastosowaniem tej metody do dalszych prac analitycznych charakterystyki FP zostały ściślej zdefiniowane i doszli do wniosku, że zmienność już odnotowana w literaturze "może być przypisana różnym populacjom badanych, różnym metodom i różnym badaczom"², ich badania doprowadziły do powszechnie akceptowanych cech, że FP są okrągłe^17,18, duży², różowy lub poplamiony jaśniejszy² i podwyższony⁴. Na pierwszy rzut oka cechy te wydają się bardzo proste. W Laboratorium Genetyki Smaku (GoT Lab lub Lab) stosowanie metody było skomplikowane ze względu na indywidualne próby oceny kwalifikacji i priorytetyzacji ważności powyższych cech, gdy niektóre, ale nie wszystkie, cechy były obecne. Powikłania te obejmowały małe brodawki, które wydawały się różowe pośród znacznie większych brodawek; cały język wchłania niebieski barwnik, eliminując w ten sposób klasyfikację na podstawie zmienności koloru; podłużne brodawki zamiast okrągłych; i języki bez różnic w wysokości, co przyczyniło się do tego, że strzelcy zgłaszali bardzo zróżnicowane liczby FP tego samego obrazu.

Te różnice w analizie skłoniły nas do przejrzenia literatury w celu określenia subiektywności, zidentyfikowania wszelkich wyjątków od powszechnie akceptowanych cech FP i ostatecznie opracowania protokołu do dokładnego i obiektywnego zdefiniowania i oceny FP.

Po pierwsze, kształt FP jest opisany w literaturze jako zaokrąglona, przypominająca grzyba struktura^17,18. Wspomniano jednak również o godnych uwagi wyjątkach. Miller podkreślił, że termin "forma grzyba" jest mylący i że wiele FP nie ma kształtu grzyba, ale może się znacznie różnić pod względem wielkości i morfologii¹⁸. Melis i wsp. (2013) opisał również kilka brodawek, które uznano za "zniekształcone", gdzie średnica FP w jednym kierunku była co najmniej o dwa odchylenia standardowe większa niż w innym kierunku¹⁹. Co więcej, Cheng i Robinson odkryli, że wskazując FP poprzez barwienie, wahały się one od płaskiego wierzchołka do wydłużonego wyglądu²⁰. Biorąc pod uwagę powyższe wyjątki, charakterystyka FP jako okrągłego i w kształcie grzyba wydaje się zbyt wąską definicją.

Po drugie, kolor FP jest opisany jako "różowe kółka na niebieskim tle"⁷ po zabarwieniu języka niebieskim barwnikiem. Chociaż barwienie jaśniejszym było najbardziej konsekwentnym kryterium FP w całej literaturze, nadal nie było to jednolite kwalifikatory. Cheng i Robinson zaobserwowali, że FP nie zawsze były lekko zabarwione, co utrudniało identyfikację i czyniło ją niepewną^. Wydaje się więc, że języki inaczej wchłaniają barwnik i chociaż kontrast jest widoczny na wielu językach, niektóre stają się całkowicie niebieskie bez rozróżnienia, podczas gdy inne natychmiast tracą jakikolwiek ślad niebieskiego barwnika²¹.

Trzecia cecha, rozmiar FP, był dość spójny wśród papierów, wahając się od 0,5 mm do 0,97 mm^6,18. W literaturze Miller zauważył, że na grzbietowej przedniej stronie języka występują dwa zakresy wielkości brodawek. Brodawki o większych średnicach były głównie brodawkami grzybowatymi i stożkowatymi, podczas gdy brodawki o mniejszej średnicy były przeważnie nitkowate¹⁸. Jednakże, z wyjątkiem badania Beaver Dam Offspring Study²¹, rozmiar nie wydaje się określać, czy struktura jest FP w literaturze, ale został podany dla brodawek już sklasyfikowanych jako "grzybowate".

Na koniec, wysokość jest wymieniona jako czwarta cecha FP⁴, chociaż Miller zauważył, że rozróżnienie między brodawkami nitkowatymi i grzybowatymi jest trudne, gdy używa się tego kryterium w pobliżu krawędzi języka. Podał dwa przykłady FP, które różniły się znacznie wysokością, jeden miał 0,8 mm wysokości, podczas gdy drugi miał mniej niż 0,1 mm wysokości, ale nadal miał dwa pory smakowe, które były wyraźnie obserwowane¹⁸. Obserwacja ta była również kontynuowana i potwierdzona przez Shahbake i wsp.⁴

Te definicje i ich zgłoszone wyjątki pokazują, że branża smakowa już dawno dostrzegła niekonsekwencję w charakterystyce FP i niedociągnięcia powszechnie używanego protokołu od Miller & Reedy. Rzeczywiście, Miller i Reedy nawoływali do dalszego definiowania cech FP². Postawiliśmy hipotezę, że osoby oceniające przypisywały różną wagę cechom i inaczej ustalały priorytety ich ważności, gdy brodawki nie spełniały wszystkich kryteriów, na przykład gdy brodawka była duża i miała kształt grzyba, ale była zabarwiona na niebiesko. Uznano, że badacze wcześniej opublikowanych badań prawdopodobnie zrobili to samo, co w połączeniu z małą liczebnością próby może tłumaczyć zróżnicowane wyniki wynikające z zastosowania tej metody.

Laboratorium GoT zajęło się tą luką w metodologii FP, opracowując wytyczne, które definiują każdą cechę za pomocą obiektywnych pomiarów i ustalają priorytety cech, aby wskazać, które mają pierwszeństwo w analizie. Tą metodą jest Denver Papillae Protocol (DPP), dychotomiczny klucz z wyraźną i wyraźną charakterystyką FP, aby zapewnić dokładne i powtarzalne zliczenia na podstawie cyfrowych zdjęć języka. DPP jest proponowaną metodą standaryzacji poprzednio stosowanej metody Millera i Reedy'ego, eliminując w ten sposób indywidualną interpretację i zapewniając bardziej spójne wyniki podczas analizy gęstości FP. W ten sposób DPP może być wykorzystany do bardziej wiarygodnego określenia roli FP w smaku.

Zdjęcia języka wykonane badanym zostały przeanalizowane przez naukowców obywatelskich (oceniających) z Laboratorium, którzy są prawdziwymi obiektami tego badania. Trzon Laboratorium stanowią naukowcy obywatele-naukowcy w różnym wieku (lata) od 16 do połowy lat 80. Podsumowujący raport ewaluacyjny zlecony przez Muzeum w 2012 r. opisuje naukowców amatorskich jako żywo zainteresowanych nauką, a dwie trzecie z nich posiada wykształcenie wyższe w danej dyscyplinie naukowej²². Kandydaci na naukowców-amatorów są obecnie rekrutowani pocztą pantoflową, muszą pomyślnie przejść proces rozmowy kwalifikacyjnej z doświadczonymi wolontariuszami w Muzeum i przejść okres próbny na stałej wystawie zdrowia Muzeum, Expedition Health, zanim będą mieli możliwość ubiegania się o stanowisko w laboratorium. Po przyjęciu do laboratorium naukowcy-amatorzy przechodzą 12-tygodniowe szkolenie, aby uzyskać certyfikat uprawniający do przyjmowania do pracy na ludziach. Po uzyskaniu tej certyfikacji są oni w stanie wziąć udział w modułach szkoleniowych dotyczących różnych technik w laboratorium (np. liczenie brodawek, ekstrakcja DNA), a po uzyskaniu dodatkowych certyfikatów i regularnych środków kontroli jakości, ci naukowcy-amatorzy mają możliwość aktywnego udziału w analizie danych. Naukowcy-amatorzy poświęcają swój czas i nie otrzymują wynagrodzenia za swój wkład w Muzeum.

Protokół

Obrazy oceniane w niniejszym badaniu zostały zebrane w ramach szerszego badania nad smakiem, przeprowadzonego w Genetics of Taste Lab w Denver Museum of Nature & Science (Muzeum)¹⁰. Podmiotami w szerszym badaniu byli goście muzeum (n = 1195) w wieku od 18 do 93 lat. Choć osoby badane pochodziły z sześciu z siedmiu kontynentów, uczestnicy wywodzili się głównie z populacji europejskiej. Dane każdego podmiotu zebrano podczas jednej, 30-minutowej sesji laboratoryjnej. Protokół został zatwierdzony przez Western Institutional Review Board, uzyskano pisemną świadomą zgodę, a podmioty poświęciły swój czas dobrowolnie i nie otrzymały wynagrodzenia za udział w badaniu.

1. Gromadzenie danych

1. Przechwytywanie obrazów
   1. Pokaż badanym fotografię przedstawiającą sposób ustawienia pozycji ciała (Rycina 1) oraz to, jak będzie wyglądać przechwycony obraz.
      Rycina 1: Pozycja podczas przechwytywania obrazu. Jest to fotografia pokazywana badanym w laboratorium GoT w celu prawidłowego ustawienia się do zdjęcia języka.
   2. Poleć badanym osuszenie języka papierowym ręcznikiem i pozostawienie go w wysunięciu z ust.
   3. Nanieś około 3 ml niebieskiego barwnika spożywczego w stężeniu 1:36 na wierzchołek języka, używając sterylnego aplikatora rayonowego z końcówką o długości 1 cala. Poproś badanych o schowanie języka do jamy ustnej i przełknięcie, aby usunąć nadmiar barwnika.
   4. Poproś badanych o przyjęcie pozycji przedstawionej na Rycynie 1, z podbródką opartą na dłoniach i łokciami wspartymi o stół dla zapewnienia stabilności. Poleć badanym wysunięcie języka na komfortową odległość i delikatne unieruchomienie go między zębami.
   5. Przyklej fragment papieru filtrującego o wymiarach 2.5 cm z wyciętym w nim okręgiem o średnicy 10 mm do końcówki przedniej części lewej strony języka, obok linii środkowej (patrz Rycina 1).
   6. Wykonaj co najmniej trzy zbliżenia języka, obejmując cały okrąg o średnicy 10 mm, aby zapewnić wizualizację wszystkich FP w tym obszarze. Użyj ustawienia makro wysokiej jakości cyfrowego aparatu kompaktowego zamocowanego na statywie dla stabilności.
      1. Przybliż obraz do stopnia, w którym cały wycięty obszar zostanie sfotografowany, pozostając w zalecanym zakresie przybliżenia aparatu. Upewnij się, że płaszczyzna obiektywu aparatu jest równoległa do płaszczyzny języka i że wycięcie na zdjęciu ma kształt okrągły, a nie wydłużony. Przejrzyj zdjęcia, aby upewnić się, że są wysokiej jakości i przydatne do zliczania.
2. Wybór i przygotowanie obrazów
   1. Prześlij zdjęcia na komputer.
   2. Z obrazów wykonanych językowi tego samego badanego wybierz tylko jeden do dalszej analizy, kierując się wyraźną definicją struktur na języku przy najwyższym przybliżeniu i najmniej zniekształconym kącie, tak aby język był szeroki i płaski względem aparatu.
   3. Otwórz wybrany surowy obraz w oprogramowaniu open source ImageJ. Kliknij „Plugins”, w menu rozwijanym przewiń do „Analyze” i kliknij „Cell Counter”. Po otwarciu licznika komórek kliknij „Initialize”, aby powiązać obraz z licznikiem.
      Uwaga: W tym miejscu należy użyć ImageJ 1.45 sec z 32-bitową wersją Java 1.6.0_10.
      1. Użyj standardowego powiększenia 50% dla zachowania spójności między osobami oceniającymi oraz do wykorzystania w kolejnych krokach oceny FP. Przesuń ten obraz na lewą stronę ekranu, obok licznika komórek. Obraz ten będzie określany jako Kopia A (patrz Rycina 2, lewa strona ekranu).
3. Otwórz drugą kopię surowego obrazu (kopia B) w celu pomiaru średnic kwantyfikowanych brodawek. Przybliżaj i oddalaj obraz zgodnie z preferencjami oceniającego w trakcie całego procesu oceny. Przesuń tę kopię na prawą stronę ekranu, aby dwie kopie nie zostały przypadkowo pomylone. (Patrz Rycina 2, prawa strona ekranu)
4. Kliknij narzędzie linii. Korzystając z kopii B, przybliż obraz tak bardzo, jak to konieczne, aby dokładnie narysować średnicę wewnątrz 10 mm okręgu papieru filtrującego pod dowolnym kątem, a następnie kliknij „Analyze” i „Set Scale”. W polu „Known Distance” wpisz „10”. Zweryfikuj poprawność skali, mierząc pod innym kątem i upewnij się, że zakres średnicy mieści się w przedziale 9.8-10.2 mm. Jeśli tak nie jest, powtórz ten krok.

Rycina 2: Kopia A i Kopia B. Kopia A (po lewej) jest powiązana z oknem licznika komórek i pozostaje przy 50% powiększeniu w celu zachowania spójności między różnymi osobami oceniającymi, podczas gdy kopię B (po prawej) można powiększyć zgodnie z preferencjami danej osoby.

2. Punktacja FP z wykorzystaniem klucza dychotomicznego protokołu Denver Papillae

1. Dla każdej potencjalnej brodawki należy zastosować poniższy klucz dychotomiczny (kroki 2.2-2.5), szczegółowo opisujący kryteria ustalenia, czy jest to FP. W celu wizualizacji brodawek zaklasyfikowanych jako FP oraz tych, które zostały odrzucone na każdym etapie procesu, należy odnieść się do Rysunku 3.
   Rysunek 3: FP a brodawki odrzucone. Rysunek 3a przedstawia język z kilkoma kwalifikującymi się FP, podczas gdy na 3b-3e zaznaczono obszary naruszające poszczególne reguły. (3b) obszar jest amorficzny; (3c) brodawki są zbyt małe; 3d) brodawka jest niebieska w porównaniu do otaczających ją struktur, (3e) brodawka jest zagłębiona w stosunku do otaczających ją struktur.
2. Kształt
   1. Należy ustalić, czy potencjalna brodawka jest amorficzna (bezkształtna). Przy powiększeniu 50% należy sprawdzić, czy występuje powszechnie rozpoznawalny kształt geometryczny (owalny, kostkowy, okrągły).
   2. Jeśli występuje kształt geometryczny (patrz Rysunek 3a), należy przejść do kroku 2.3.
   3. Jeśli nie występuje kształt geometryczny (patrz Rysunek 3b), należy przejść do okna licznika komórek i kliknąć „Type 1”. Na kopii A (powiększenie 50%) należy kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako amorficzną i niebędącą FP. Klikanie typów 1-4 w tym i kolejnych krokach pozwala oceniającym upewnić się, że przeanalizowano wszystkie potencjalne brodawki, oraz kategoryzuje, która reguła została naruszona przy odrzuceniu struktury, co ułatwi dyskusję w kroku 2.7.2.
3. Kolor
   1. Należy odnieść się do kopii A przy powiększeniu 50% i ustalić, czy na powierzchni języka występuje jakiekolwiek zróżnicowanie kolorystyczne. Jeśli tak, należy kontynuować w kroku 2.3.2. Jeśli nie, koloru nie należy traktować jako czynnika decydującego; należy przejść do kroku 2.4.
   2. Należy ustalić, czy potencjalna brodawka jest jaśniejsza od otaczającej ją tkanki lub brodawek (patrz Rysunek 3a). Jeśli jakakolwiek część potencjalnej brodawki pozostała różowa lub została zabarwiona jaśniej, należy przejść do kroku 2.4.
   3. Jeśli potencjalna brodawka jest niebieska, a otaczające ją brodawki są jaśniejsze (patrz Rysunek 3c), należy przejść do okna licznika komórek i kliknąć „Type 2”. Na kopii A należy kliknąć potencjalną strukturę, aby oznaczyć ją jako zbyt niebieską i niebędącą FP.
4. Rozmiar
   1. Korzystając z kopii B, należy powiększyć obraz do stopnia, w którym można wyraźnie dostrzec obrys potencjalnej brodawki.
   2. Należy wybrać narzędzie linii i zmierzyć najdłuższy wymiar potencjalnej brodawki. Należy kliknąć „Analyze”, a następnie „measure”. Jeśli zmierzona długość wynosi 0.5 mm lub więcej (patrz Rysunek 3a), należy przejść do kroku 2.5.
   3. Jeśli zmierzona długość wynosi 0.499 mm lub mniej, należy zmierzyć ją ponownie, aby upewnić się co do dokładności. Jeśli nadal wynosi 0.499 mm lub mniej (patrz Rysunek 3d), należy kliknąć „Type 3” w oknie licznika komórek, a na kopii A kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako zbyt małą i niebędącą FP.
5. Zagłębienie
   1. Korzystając z kopii A, należy ocenić, czy potencjalna brodawka ma wysokość wyrównaną z resztą języka lub jest wyniesiona. Jeśli brodawka znajduje się w zagłębieniu, należy określić jej wysokość w stosunku do innych struktur w tym zagłębieniu, a nie względem powierzchni języka. Jeśli brodawka jest niższa od otaczających ją brodawek (patrz Rysunek 3e), należy wybrać „Type 4” i na kopii A kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako zagłębioną i niebędącą FP.
   2. Jeśli potencjalna brodawka ma wysokość wyrównaną z resztą języka lub jest wyniesiona (patrz Rysunek 3a), należy użyć „Type 5”, kliknąć ją i oznaczyć jako FP. Suma dla typu 5 stanowi surowy wynik FP. Na tym etapie nie należy zamykać kopii, ponieważ ImageJ nie zapisuje wyników w liczniku komórek ani kolorowych oznaczeń typów 1-5 na kopii A.
6. Zapisywanie kopii A
   1. Należy zapisać surowy wynik FP w notatniku.
   2. W oknie licznika komórek należy kliknąć „Export Image”. Plik należy zapisać zgodnie z przyjętym w laboratorium systemem nazewnictwa. Pozwoli to na ponowne otwarcie kopii A w przyszłości z zachowaniem kolorowych oznaczeń typów 1-5. Nie zapisze to jednak surowego wyniku FP.
7. Kontrola jakości
   1. Każde zdjęcie powinno zostać ocenione przez dwóch niezależnych oceniających, a następnie wyniki należy porównać⁷.
   2. Jeśli wyższy surowy wynik FP mieści się w granicach 10% niższego surowego wyniku FP, należy wyciągnąć średnią z obu wyników w celu uzyskania konsensusowego wyniku FP. Jeśli dwa surowe wyniki FP różnią się o więcej niż 10%, należy wyświetlić oba ocenione zdjęcia na ekranie.
      1. Należy wykorzystać typy licznika 1-4, aby pomóc w dyskusji nad rozbieżnościami i uzgodnić ostateczny wynik konsensusowy. Jeśli podczas dyskusji nie uda się osiągnąć konsensusu, należy zrobić przerwę w ocenie. W późniejszym czasie należy ponownie ocenić obraz i przedyskutować wynik. Jeśli konsensus nadal nie zostanie osiągnięty, należy zaprosić trzeciego oceniającego. Należy poprosić go o ocenę obrazu i przeprowadzenie dialogu z pozostałą dwójką.

3. Szkolenie oceniających w zakresie stosowania DPP

1. Informacje o szkoleniu
   1. Dwóch oceniających zliczyło różnorodne obrazy, dokonując pomiarów indywidualnie i regularnie konsultując się, aby upewnić się, że stosują te same kryteria. Metodę (sfinalizowaną powyżej) uznano za akceptowalną i określono mianem DPP dopiero wtedy, gdy indywidualne wyniki zliczeń dla każdego obrazu były konsekwentnie zbliżone do siebie w granicach 10%.
   2. Wybierz 15 obrazów oficjalnych i 15 obrazów treningowych (Ryciny uzupełniające 2-17) do oceny w kolejności sekwencyjnej. Jeśli wybrany obraz zostanie uznany za niezliczalny, pomiń go i wybierz kolejny obraz w sekwencji.
      Uwaga: Obrazy te różnią się jakością i rozmiarem, ponieważ zostały wybrane w czasie, gdy laboratorium wciąż opanowywało prawidłową technikę fotografowania. Jeden z wybranych obrazów uznano za niezliczalny w procesie pierwotnego zliczania, ale pozostawiono go, aby upewnić się, że oceniający potrafią podjąć taką decyzję w razie potrzeby. W związku z tym stażystom przekazano 16 obrazów, mimo że tylko 15 z nich podlega ocenie.
   3. Z wykorzystaniem DPP wyżej wspomniani oceniający zliczyli 15 obrazów treningowych i ustalili dla każdego z nich wynik konsensusowy.
   4. Przekaż stażystom 15 obrazów oficjalnych i poproś o ich ocenę zgodnie z metodą Millera i Reedy'ego w celu stworzenia punktu odniesienia. Zapisz wyniki. Przeprowadź szkolenie grupowe zgodnie z krokiem 3.2. Po zakończeniu kroku 3.2 poproś oceniających o ponowne ocenienie 15 obrazów oficjalnych i zapisz ich wyniki.
2. Szkolenie kolejnych oceniających w zakresie DPP
   1. Przekaż szkolącym się pierwszy obraz treningowy i zademonstruj metodę DPP dla kilku brodawek na tym obrazie. Omów powody wyboru lub odrzucenia każdej brodawki jako FP. Pozwól stażystom kontynuować ćwiczenia z oceniania pozostałej części zdjęcia i porównać wynik z liczbą konsensusową (liczbę konsensusową laboratorium GoT oraz markery Typu 1-5 przedstawiono na Rycini uzupełniającej 1). W przypadku tego zdjęcia omów wszelkie rozbieżności, niezależnie od progu 10%, aby zapewnić zrozumienie DPP.
   2. Przekaż kolejnym oceniającym drugi obraz treningowy i poproś o jego ocenę przy użyciu DPP.
   3. Jeśli surowy wynik FP stażysty mieści się w granicach dziesięciu procent ustalonego zliczenia konsensusowego z sekcji 3.1.3., pozwól stażyście przejść do następnego obrazu i powtórzyć kroki.
   4. Jeśli wynik wykracza poza zakres dziesięciu procent, wykorzystaj kolorowe oznaczenia stażysty reprezentujące typy 1-5, aby zrozumieć i zidentyfikować niespójność, a następnie wyjaśnij rozbieżności w rozumieniu DPP.
   5. Daj stażyście możliwość ponownej oceny obrazu i ponownie zweryfikuj nowy wynik. W przypadku sukcesu stażysta przechodzi do następnego obrazu, aż do ukończenia wszystkich zdjęć.

Wyniki

Poniżej przedstawiono reprezentatywną fotografię ocenioną przez dwóch niezależnych oceniających z zastosowaniem powszechnie używanej metodologii Millera i Reedy’ego do identyfikacji FP, opartej na standardach terenowych dotyczących kształtu okrągłego, dużych rozmiarów, koloru różowego lub jaśniejszego zabarwienia oraz wypukłości, a następnie tę samą fotografię ocenioną przez dwóch oceniających z użyciem DPP. Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla wysokiej wariancji obserwowanej przy zastosowaniu oryginalnej metody w porównaniu z niższą wariancją uzyskaną dzięki DPP.

Rysunek 4: Ilościowe oznaczanie metodą Millera i Reedy'ego w porównaniu do oznaczania metodą DPP. Obraz po lewej stronie jest reprezentatywny dla zliczeń przeprowadzonych przez dwóch oceniających z wykorzystaniem metody Millera i Reedy'ego. Obraz po prawej stronie przedstawia zliczenia dwóch oceniających z wykorzystaniem DPP. Kolor czerwony oznacza oceniającego 1, żółty oceniającego 2, a zielony obu oceniających (1 i 2).

Niezawodność statystyczna DPP została wcześniej zbadana przy użyciu mieszanego modelu liniowego w celu oceny zmienności¹⁰W skrócie, aby uzyskać dane do oceny roli, jaką DPP odgrywa w spójności wyników, piętnaście obrazów oceniono dwukrotnie. W pierwszej serii ocen oceniający nieznający DPP użyli metody Millera& Metoda Reedy'ego²Następnie przeszkolono oceniających w obsłudze oprogramowania DPP, a obrazy zostały ponownie ocenione indywidualnie, z pominięciem końcowego etapu wypracowania konsensusu opisanego w sekcji 2.7 dotyczącej kontroli jakości (Rysunek 5). Następnie zbiór danych z wyników FP wykorzystano w modelu mieszanym w celu oceny łącznych różnic wynikających z protokołu (Rycina 6), zmienność wewnątrzoceniającego oraz interakcję między tymi dwoma czynnikami. Model ten wykazał istotną różnicę w punktacji przy zastosowaniu metody Millera & Metoda Reedy'ego w porównaniu z DPP (wartość p) <1 x 10^-6) przy czym w przypadku DPP liczba była wyższa o 6,99 (SE = 0,99); 5,2% zmienności wyniku wynikało z treningu, 25,9% z oceniającego, a pozostała część ze zmienności specyficznej dla obrazu¹⁰Następnie, w celu wygenerowania danych do określenia zmienności wewnątrzoceniającego, 11 osób oceniło serię trzydziestu obrazów w losowej kolejności. Bez wiedzy oceniających seria ta zawierała trzy powtórzone obrazy. Zaobserwowano drastyczną różnicę w zmienności ocen przy porównaniu obrazów różnych i powtórzonych.

Rycina 5: Brak przeszkolenia DPP vs po przeszkoleniu DPP. Panele przedstawiają wykresy pudełkowe ocen recenzentów dla 15 obrazów przed i po przeszkoleniu zgodnie z Denver Papillae Protocol. Na każdym wykresie pudełkowym wypełnione koło oznacza średnią, natomiast puste koło oznacza wartość odstającą.

Rysunek 6: Zmiana wariancji oceniających. Kolor szary reprezentuje wariancję dla poszczególnych oceniających przed szkoleniem DPP. Kolor czarny reprezentuje tego samego oceniającego po szkoleniu DPP.

Dyskusja

Korzystając z DPP, wariancja w liczbie obrazów między niezależnymi punktorami i w obrębie punktatorów znacznie się zmniejszyła. Chociaż metoda ta sprawia, że wizualna analiza gęstości FP bez wideomikroskopii jest mniej subiektywna, należy zauważyć, że metoda ta ocenia tylko FP. DPP nie może zagwarantować, że struktury sklasyfikowane jako FP mają pory smakowe, a zatem są brodawkami smakowymi, ani że liczby odzwierciedlają rzeczywistą gęstość kubków smakowych^20,23. Natura tej metody polega na tym, że zapewnia niezawodność poprzez spójność i precyzję; Jednak może to być stronnicze wyniki w spójnym kierunku. Testowanie dokładności w stosunku do innych metod wykorzystujących prawdziwy pomiar gęstości kubków smakowych (np. wideomikroskopia) wykraczałoby poza zakres tego badania. Jednakże, poprzez bardziej rygorystyczne scharakteryzowanie morfologii FP i stworzenie klucza dychotomicznego, metoda ta odpowiada na zarzut Millera i Reedy'ego dotyczący dziedziny, że należy przeprowadzić więcej charakterystyki FP, aby uzyskać konsensus co do ich morfologii i kwantyfikacji². Ponadto wskazali, że ta charakterystyka może "wyjaśnić niektóre różnice między badanymi i wyjaśnić niektóre z rozbieżnych wyników wśród badaczy²". Zapewniając jednolitą metodę kwantyfikacji, wiele rozbieżności dotyczących roli FP w badaniach związanych ze smakiem i odżywianiem może zostać skorygowanych.

Klucz dychotomiczny można dostosować do różnych technik przechwytywania obrazu. Znaną odległość dla skali pomiarowej można łatwo ustawić na średnicę używaną w każdym laboratorium, a recesję można zdyskontować, jeśli na język umieszczono folię saran lub szkło w celu uchwycenia obrazu. W laboratorium GoT stwierdzono, że neutralny język zapewnia najlepszą definicję brodawek. Może to być spowodowane ilością światła w laboratorium, która powodowała, że folia saran lub szkło odbijały światło z powrotem do kamery, tworząc odblaski, które utrudniały ocenę. Niektóre laboratoria stwierdziły, że barwnik jest trudniejszy do policzenia, ale laboratorium GoT stwierdziło, że rozcieńczony niebieski barwnik spożywczy o stężeniu 1:36 zapewnia idealny kontrast między brodawkami grzybowatymi i nitkowatymi na większości języków.

Stworzenie dychotomicznego klucza do charakterystyki FP pozwoli badaczom z różnych laboratoriów, przy użyciu różnych metod przechwytywania obrazu, na konsekwentną analizę struktur na języku i pewność co do raportowania ich wyników. Wreszcie, użycie klucza dychotomicznego może mieć zastosowanie w innych obszarach metodologii naukowej, w których cechy struktur lub obiektów dostarczają niespójnych liczb z badania na badanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obraz J	National Institutes of Health	http://rsb.info.nih.gov/ij
Barwnik spożywczy, ciemnoniebieski odcień	Esco	http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
sterylne aplikatory położnicze / ginekologiczne z końcówką ze sztucznego jedwabiu	Puritan	25-808 Bibuła
klasy 1 Whatman		Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10,3 megapiksela) i P500 (12,1 megapiksela)	Nikon	http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/	żaden model nie wydaje się być już dostępny na stronie internetowej
Ręczniki papierowe	Kleenex	https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

filtracyjna 1PR