Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Podsumowanie

Wykazano, że

Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Streszczenie

Przerzuty do raka są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Ostatnie badania wykazały, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach raka. Rzeczywiście, liczba CTC koreluje z wielkością guza. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy opis metodologii izolacji i namnażania CTC z syngenicznego mysiego modelu raka wątrobowokomórkowego (HCC), co pozwala na dalszą analizę potencjalnie ważnych mechanizmów molekularnych przerzutów guza w narządach litych. Ta metoda jest wydajna i powtarzalna. Jest to technika nieinwazyjna, a zatem może zastąpić inwazyjną biopsję tkanek pobranych od ludzi, co może wiązać się z powikłaniami. Dlatego omawiana tutaj metoda pozwala na izolację i namnażanie CTC z próbek krwi pełnej, tak aby można je było zbadać i scharakteryzować. Ma to potencjał do przyszłej adaptacji do zastosowań klinicznych, takich jak diagnoza i spersonalizowana terapia celowana.

Wprowadzenie

Społeczność badaczy raka wiedziała o istnieniu krążących komórek nowotworowych (CTC) od czasu ich pierwszej obserwacji przez Thomasa Ashwortha w 1869^roku. Od tego czasu wykazano, że CTC odgrywają ważną rolę w przerzutach guza i progresji choroby^2-5. Obecnie guzy lite są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. CTC to rzadkie komórki, które pochodzą z guzów pierwotnych i przemieszczają się przez krwiobieg do różnych narządów, z których tylko niewielka część ostatecznie rozwija się w przerzuty^2-5. Warto zauważyć, że istnieje dodatnia korelacja między wielkością guza a liczbą CTC^3,4.

Zrozumienie biologii CTC może przyczynić się do poszukiwania terapii celowanej. Ponadto CTC mogą mieć zastosowania diagnostyczne. Aby osiągnąć te potencjalne zastosowania kliniczne, należy przezwyciężyć niektóre obecne wyzwania związane z badaniem CTC. Jedno z wyzwań wiąże się z faktem, że CTC mogą być obecne jako pojedyncze komórki lub jako klastry, a nawet mogą być w stanie zmienić swój fenotyp w odpowiedzi na mikrośrodowisko krwi². Co więcej, wykrywanie może być bardzo trudne, częściowo ze względu na niską liczbę CTC (od kilku do kilkuset na mililitr) wśród jednego miliarda komórek hematologicznych na mililitr we krwi⁶. Niemniej jednak w ostatnich latach zintensyfikowano badania nad potencjalnymi zastosowaniami klinicznymi CTC w nowotworach narządów litych.

Pomimo tych wysiłków, wyzwania związane z badaniem i zrozumieniem roli CTC nadal istnieją ze względu na rzadkość CTC i nieadekwatność obecnie dostępnych narzędzi technologicznych. Pomimo tych wyzwań, ogromny potencjał zastosowań klinicznych nadal stanowi zachętę do kontynuowania badań nad rolą CTC w przerzutach raka.

Ostatnio udało nam się wyizolować i rozmnożyć w hodowli komórkowej CTC z ortotopowego syngenicznego mysiego modelu przerzutów raka wątrobowokomórkowego (HCC)⁵. Celem niniejszego artykułu jest szczegółowe opisanie wszystkich aspektów skutecznej metodologii. Znaczenie tej metodologii polega na tym, że podejście to może być modyfikowane w celu skutecznego wyizolowania i namnażania w hodowli ludzkich CTC, zwiększając w ten sposób możliwości badań in vitro biologii CTC.

Istnieje wiele potencjalnych zastosowań klinicznych dla stosowania CTC. CTC mogą być przydatne do prognozowania, monitorowania odpowiedzi, badań przesiewowych, dynamicznego monitorowania zmian molekularnych nowotworu i spersonalizowanej terapii⁴. W związku z tym lepsze zrozumienie biologii CTC ma duży potencjał oddziaływania klinicznego.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Hunter College of The City University of New York.

1. Procedury przed eksperymentem

1. Po przybyciu do obiektu dla zwierząt, początkowo umieść 3 myszy BALB/c w klatce z filtrowaną górą i ściółką z wiórów drzewnych. Upewnij się, że myszy mają swobodny dostęp do jedzenia, karmy dla gryzoni purina i wody. Pościel i jedzenie należy zmieniać dwa razy w tygodniu, a klatki czyścić raz w tygodniu.
2. Wywołać znieczulenie ogólne u myszy za pomocą parownika izofluranu wraz z tlenem przy stałym natężeniu przepływu 1 l na minutę. System jest samowystarczalny i zawiera precyzyjny waporyzator.
3. Umieść zwierzę w plastikowym pudełku, do którego podłączony jest precyzyjny waporyzator i system gazowo-znieczulający. Początkowo ustaw waporyzator na 2,5, aż zwierzę straci przytomność, w którym to momencie obniż waporyzator do 2.
4. W tym czasie przełącz przewód zaworu, uszczelniając go do skrzynki i otwierając do stożka nosowego.
5. Przenieś zwierzę do obszaru przygotowania, z prawidłowo umieszczonym i podłączonym stożkiem nosowym (do znieczulenia podtrzymującego).
6. Przygotuj 5 × 10⁶ mysich komórek HCC BNL 1ME A.7R.1 do implantacji na mysz. BNL 1ME A.7R.1 powinien być hodowany w pożywce (10% inaktywowany termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) inkubowany w naczyniu do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z powietrzem i 5 % CO_{2 .}
7. Za pomocą strzykawki z igłą 20 G wszczepić 100 μl PBS zawierającego 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mysich komórek raka wątrobowokomórkowego do płata wątroby myszy BALB/c w celu wytworzenia guzów pierwotnych. Po implantacji myszy BALB/c należy umieścić w klatce o takich samych wymaganiach domowych, jak przed implantacją.
8. W eksperymentalnym punkcie końcowym dowody kliniczne raka wątrobowokomórkowego można zaobserwować jako znaczne obniżenie oceny kondycji ciała (zwykle wykrywane po 4 tygodniach). W tym momencie istnieje prawdopodobieństwo, że pierwotne guzy rozwinęły się w wątrobie, podczas gdy złogi przerzutowe utworzyły się w płucach. Następnie rozpocznij proces izolacji i namnażania krążących komórek nowotworowych.

2. Pobieranie krwi pełnej do izolacji krążących komórek nowotworowych

UWAGA: Odpowiednio zdezynfekuj obszar operacji i upewnij się, że jest wolny od bałaganu. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie lub zanurzyć w płynie dezynfekującym zgodnie z zaleceniami producenta

1. Składanie ofiar z myszy przez humanitarną eutanazję w eksperymentalnym punkcie końcowym (kliniczne dowody rozwoju guza). Eutanazja myszy powinna wiązać się z uduszeniem CO₂ . Obserwuj myszy prawidłowo, aby upewnić się, że znieczulenie jest prawidłowo rozprowadzone. Dwutlenek węgla powinien być powoli uwalniany do komory przez okres 5 - 10 minut, powodując zatrzymanie oddechu. Następnie wykrwawienie wewnątrzsercowe i zwichnięcie szyjki macicy. ⁵
2. Do pobrania krwi pełnej należy użyć igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Nastrzykać strzykawkę 0,01 ml heparyny. Natychmiast nakłuć skórę igłą poniżej ksylfisterku pod kątem około 45°. Powoli przesuwaj igłę, aby nakłuć serce, a następnie zmniejsz kąt igły. Równomiernie przytrzymać igłę i strzykawkę na miejscu i pobrać 500 μl - 1 000 μl pełnej krwi z serca.
3. Wyjąć strzykawkę i igłę i przenieść krew do wstępnie oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od pirogenów. Odwirować krew pełną zebraną do 1,5 ml probówki wolnej od pirogenów o stężeniu 1,167 x g przez 5 minut.
   UWAGA: Wirowanie rozdziela próbkę krwi pełnej na trzy warstwy: dolną lub hematokrytową warstwę składającą się z czerwonych krwinek, pośrednią cienką warstwę kożucha i górną warstwę osocza.
4. Ostrożnie usunąć osocze, pipetując i zbierając je do oddzielnej probówki wolnej od pirogenów o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów, takich jak wykrycie bezkomórkowych kwasów nukleinowych⁷.
5. W celu wyizolowania krążących komórek nowotworowych (CTC) należy zebrać płaszcz kożuchowy do oddzielnej probówki wolnej od pirogenów o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania do lizy krwinek czerwonych (RBC). Jest to konieczne, aby usunąć resztki erytrocytów w warstwie kożuchowca.

3. Przepis na bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC)

1. Przygotować 1 l roztworu buforu do lizy RBC.
2. Przygotować 500 ml chlorku amonu i 500 ml Tris. Następnie wymieszać, aby uzyskać 1 l roztwór buforu do lizy RBC o końcowym stężeniu 155 mM chlorku amonu i 10 mM Tris.
3. Zbuforować roztwór do pH 7,5. Przechowywać bufor do lizy RBC w temperaturze od +2 do +8 °C i bezpośrednio przed użyciem doprowadzić do RT.

4. Erytrocyt Sierść Buffy

1. Dodać 1 ml buforu do lizy RBC do sterylnej, wolnej od pirogenów probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej zebraną powłokę kożuchową.
2. Wymieszaj zawartość probówki, odwracając ją kilka razy. Inkubować zmieszaną zawartość probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej na stole. Odwirowywać wymieszaną zawartość przez 5 minut przy sile 1,167 g.
3. Po odwirowaniu otrzyma się białawe osady. Czerwonawy supernatant powoli i ostrożnie wyrzucić do 10% wybielacza, nie naruszając przy tym osadu. Jeśli osad nie jest białawy, powtórz kroki 3.1 - 3.5. Pomocne może być również wydłużenie czasu inkubacji w buforze do lizy RBC do 10 - 15 min.
4. Odpady biologiczne należy bezpiecznie zutylizować po zakończeniu odkażania odpadów biologicznych w 10% wybielaczu po 24 godzinach.

5. Rozmnażanie w hodowli komórkowej

UWAGA: Komórki nowotworowe to zazwyczaj szybko rosnące białe krwinki, które obfitują w oryginalną mieszankę komórek umieszczonych w naczyniu. Po wielokrotnej zmianie pożywki i kolejnych pasażach CTC wszystkie białe krwinki są usuwane i pozostaje stosunkowo czysta populacja CTC.

1. Po odrzuceniu supernatantu do 10% wybielacza, przynajmniej raz przemyć białawe osady w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawiesić w kompletnej pożywce hodowlanej w celu rozmnażania w hodowli komórkowej.
2. Po zakończeniu płukania dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej BNL 1ME A.7R.1 (10% inaktywowanego termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) do osadu i ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej.
3. Zasiać ponownie zawieszoną mieszaninę komórek do naczynia do hodowli komórkowej. Inkubować naczynie do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z powietrzem i 5% CO₂ .
4. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co dwa do trzech dni. Po pięciu do siedmiu dniach CTC przylgną do szalki z hodowlą komórkową i zaczną się namnażać. Komórki te pozostaną żywotne po upływie 25 pasaży i po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania⁵.

6. Weryfikacja linii komórkowej krążącego raka wątrobowokomórkowego

1. Wykonaj metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby amplifikować tylko jeden specyficzny segment DNA mysiego genu β-globiny, aby potwierdzić, że nowo ustalone linie komórkowe CTC są komórkami myszy, takimi jak oryginalna wszczepiona linia HCC BNL 1ME A.7R.1. Metoda została pierwotnie opisana i zwalidowana przez Steube i wsp. ^5,8
pkt.
2. Wykonaj barwienie immunologiczne dla specyficznego dla hepatocytów markera cAMP reagującego na element wiążący białko 3-podobne 3 (CREB3L3) przy użyciu specyficznego przeciwciała. Potwierdzi to, że nowo ustalone CTC są rzeczywiście hepatocytami, takimi jak oryginalna wszczepiona linia komórkowa BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Wyniki

Opisana tutaj metodologia wykazała, że możliwe jest wyizolowanie CTC. Myszy poddano humanitarnej eutanazji w punkcie końcowym eksperymentu. Proces obejmował uduszenie dwutlenkiem węgla, eksanguinację wewnątrzsercową oraz zwichnięcie stawów szyjnych. Schemat kluczowych etapów procedury przedstawiono na Rysunku 2. Próbki krwi pełnej pobrane drogą eksanguinacji wewnątrzsercowej przetworzono zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Następnie zastosowano wirowanie w celu wyznaczenia warstwy buffy coat, która zo...

Dyskusja

W tym badaniu opisano sposób izolowania i namnażania CTC z pełnej krwi myszy syngenicznej z HCC. Celem niniejszej pracy jest pogłębienie trwających badań nad mechanizmami przerzutów nowotworowych.

Czynnikiem, który przyczynia się do złego rokowania w przypadku wielu nowotworów, jest brak szybkiego wykrywania, a co za tym idzie szerokiego rozpowszechnienia nowotworu^{złośliwego 3}. CTC wywodzą się z nowotworów pierwotnych i rozprzestrzeniają się przez krwiobieg do odległych narządów. W...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Heparyna Sól sodowa 1 g	VWR	89508-852
BTX Tubka Micro 1,5 ml Przezroczysta NS	VWR	89511-254	1,5 ml  Probówki eppendorf bez pirogenów Igła
Sterylna dysz BD 25 G x 1 cala	VWR	BD305125	25 G Końcówka igły
Slp SRNG 1 ml 200 szt. w opakowaniu	VWR	BD309659	1 ml końcówka strzykawki
Strzykawka 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	Strzykawka 1 ml
VWR Kleszcze Chusteczki 6	VWR	82027-446	Kleszcze
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Prowadnica 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Prowadnice
VWR Szkło osłonowe #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Szkło pokrywowe
VWR Skrzynka przesuwna True North Fm Pu	VWR	89140-278	Skrzynka przesuwna
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	Długopis PAP
Woda bez RNASe i DNAz 2 L	VWR	101454-204	Bufor wodny bez nukleaz
Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Bufor
Chlorek amonu ACS Grade 2, 5 kg	VWR	97062-048	Bufor chlorku amonu
Falcon Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm Polistyren Styl	VWR	353002	Naczynie do hodowli tkankowych
Wybielacz bakteriobójczy Clorox, zwykły	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) bez wapnia i magnezu (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  z 4,5 g/l glukozy i L-glutamina bez pirogronianu sodu	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x pożywka dla komórek BNL 1ME A.7R.1
Surowica bydlęca	płodu Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicylina Streptomycyna Roztwor, 100x Penicylina	Scientific	30-002-Cl	Penicylina Streptomycyna
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Wirówka 13 000 obr./min