Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52863

⸱

21 maja 2015

 ,  ,  ,  , 
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Ciąża charakteryzuje się infiltracją leukocytów w tkankach rozrodczych i na styku matki i płodu (decidua basalis i decidua parietalis). Ten interfejs jest anatomicznym miejscem kontaktu między tkankami matczynymi i płodowymi; Dlatego jest to immunologiczne miejsce działania w czasie ciąży. Naciekające leukocyty na granicy matczyno-płodowej odgrywają kluczową rolę w implantacji, utrzymaniu ciąży i czasie porodu. Dlatego charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna tych leukocytów zapewni wgląd w mechanizmy, które prowadzą do zaburzeń ciąży. Opisano kilka protokołów w celu wyizolowania naciekających leukocytów z decidua basalis i decidua parietalis; Jednak brak spójności odczynników, enzymów i czasów inkubacji utrudnia porównanie tych wyników. Opisane w niniejszym artykule jest nowatorskie podejście, które łączy zastosowanie delikatnych technik dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej w celu zachowania żywotności i integralności markerów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych w leukocytach wyizolowanych z tkanek ludzkich na granicy matczyno-płodowej. Oprócz immunofenotypowania, hodowli komórkowych i sortowania komórek, przyszłe zastosowania tego protokołu są liczne i zróżnicowane. Zgodnie z tym protokołem wyizolowane leukocyty można wykorzystać do określenia metylacji DNA, ekspresji genów docelowych, funkcjonalności leukocytów in vitro (tj. Fagocytozy, cytotoksyczności, proliferacji komórek T i plastyczności itp.) oraz produkcji reaktywnych form tlenu na granicy matczyno-płodowej. Dodatkowo, korzystając z opisanego protokołu, laboratorium to było w stanie opisać nowe i rzadkie leukocyty na granicy matczyno-płodowej.

Wprowadzenie

Ciąża charakteryzuje się trzema odrębnymi fazami immunologicznymi: 1) implantacja i wczesne łożyskowanie związane z reakcją prozapalną (tj. implantacja przypomina 'otwartą ranę'); 2) drugi trymestr i większość trzeciego trymestru ciąży, kiedy homeostaza immunologiczna jest osiągana poprzez przeważający stan przeciwzapalny na granicy matczyno-płodowej; i 3) poród, stan prozapalny1-7. Komórki odpornościowe odgrywają ważną rolę w regulacji odpowiedzi zapalnej na granicy matczyno-płodowej, gdzie ich liczebność i lokalizacja zmieniają się w czasie ciąży6-9.

U ludzi interfejs matka-płód reprezentuje obszar bezpośredniego kontaktu między tkankami matki (decidua) i płodu (kosmówka lub trofoblast). Interfejs ten obejmuje: 1) decidua parietalis, która wyściela jamę macicy, która nie jest pokryta łożyskiem i jest w zestawieniu z kosmówką; i 2) decidua basalis, znajdujący się w płytce podstawnej łożyska, gdzie jest atakowany przez trofoblasty śródmiąższowe10 (ryc. 1). Bliskość tych obszarów kontaktu stwarza warunki do ekspozycji płodu na antygeny układu odpornościowego matki11-13. Nic dziwnego, że leukocyty stanowią do 30-40% komórek dziesiętnych8,9,14,15 oprócz typowych komórek zrębowych i komórek gruczołowych8,14,16. Rola leukocytów na styku matka-płód obejmuje wiele procesów, które obejmują ograniczenie inwazji trofoblastu17, przebudowę tętnic spiralnych18,19, utrzymanie tolerancji matczynej12,20 i rozpoczęcie porodu21-26. Leukocyty zarówno adaptacyjnych, jak i wrodzonych kończyn układu odpornościowego, tj. limfocytów T, makrofagów, neutrofili, limfocytów B, komórek dendrytycznych i komórek NK, zostały zidentyfikowane w tkankach dziesiętnych, a ich proporcje i stan aktywacji wykazały, że zmieniają się przestrzennie i czasowo w czasie ciąży6-10,12,14,24,27-30. Zaburzenia w populacji i/lub funkcji leukocytów są związane ze spontanicznym poronieniem31, stanem przedrzucawkowym32, wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrostu32,33 i przedwczesnym porodem7,24. W związku z tym badanie cech fenotypowych i funkcjonalności leukocytów na granicy ludzkiej matki i płodu ułatwi wyjaśnienie szlaków immunologicznych rozregulowanych w zaburzeniach ciąży.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi używanych do określania fenotypu i funkcjonalnych właściwości leukocytów jest cytometria przepływowa, technologia pozwalająca na ilościową analizę wielu parametrów jednocześnie34-36. Aby przeanalizować leukocyty za pomocą cytometrii przepływowej, wymagana jest izolacja leukocytów w zawiesinie jednokomórkowej. Dlatego potrzebna jest metoda oddzielania naciekających leukocytów od granicy matczyno-płodowej w celu zbadania ich właściwości fenotypowych i funkcjonalnych.

Opisano kilka metod izolowania leukocytów z ludzkiej granicy matczyno-płodowej10,14,25,27,37-39. Podczas gdy niektórzy stosują dezagregację mechaniczną10,25,27,38, inni używają trawienia enzymatycznego37,40 do dysocjacji tkanek. Ponieważ dezagregacja mechaniczna daje niższą wydajność i zmniejszoną żywotność41, a dysocjacja enzymatyczna może wpływać na żywotność i zatrzymywanie markerów na powierzchni komórki42, opisana tutaj metoda łączy delikatną dysocjację mechaniczną z enzymatyczną obróbką wstępną w celu zwiększenia wydajności izolowanych leukocytów bez uszczerbku dla żywotności komórek. Wykazano, że podobna kombinacja metod jest skuteczna w izolacji leukocytów z tkanek dziesiętnych na granicy matczyno-płodowej39. Dlatego opisany tutaj protokół obejmuje mechaniczną dezagregację za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek, który zwiększa spójność, jednocześnie oszczędzając czas i pracę w porównaniu z tradycyjnym mieleniem za pomocą przeciwstawnych skalpeli, żyletek lub nożyczek chirurgicznych10,28. Enzymem wybranym do dysocjacji tkanek była Accutaza. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanej kolagenazy43, dypazy44 i trypsyny45, Accutaza (roztwór do odrywania komórek) łączy w sobie zarówno ogólne działania proteolityczne, jak i kolagenolityczne, które przyczyniają się do wydajnej, ale delikatnej dysocjacji46,47. Po dysocjacji leukocyty są wzbogacane z całkowitej populacji komórek dziesiętnych przez wirowanie w gradiacji gęstości. Wcześniej stosowano różne podłoża o gradiencie gęstości, z których najczęstszymi są Percoll (zawiesina koloidalnych cząstek krzemionki)48 i Ficoll (polimer sacharozy o wysokiej syntetycznej masie cząsteczkowej)49. Wykazano już wcześniej wyższą skuteczność izolacji za pomocą polimeru sacharozy50, a opisany tu protokół dodatkowo dowodzi, że to podłoże o gradionym gradiencie gęstości wytwarza wystarczająco wysoką czystość leukocytów jednojądrzastych.

Stąd, protokół opisany tutaj łączy mechaniczną dezagregację tkanek z automatycznym dysocjatorem tkanek, trawienie enzymatyczne z roztworem oddzielającym komórki, oraz separację leukocytów za pomocą pożywki o gradiencie gęstości (1,077 + 0,001 g/ml) w celu wyizolowania leukocytów z ludzkich tkanek dziesiętnych. Udowodniono, że protokół ten zachowuje antygeny powierzchniowe komórek wraz z ich żywotnością. Wyizolowane leukocyty mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do immunofenotypowania z cytometrią przepływową i badań funkcjonalnych in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest odpowiedni do izolacji leukocytów z decidua basalis i decidua parietalis w ramach przygotowań do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane do sortowania komórek, hodowli komórek, izolacji RNA i cytologii. Przed rozpoczęciem pracy z próbkami wymienionymi w niniejszym protokole należy uzyskać zgodę etyczną człowieka od Lokalnej Komisji Etyki Badań Naukowych i Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych. Pobieranie i wykorzystanie próbek ludzkich do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Narodowego Instytutu Zdrowia Dzieci i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej (DHHS, Bethesda, MD, USA) oraz Wayne State University (Detroit, MI, USA). Uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich kobiet w ciąży przed pobraniem próbek tkanek.
UWAGA: Podczas pracy z krwią zwierzęcą, komórkami lub czynnikami niebezpiecznymi, jak wspomniano w niniejszym protokole, konieczne jest przestrzeganie odpowiednich działań w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego.

1. Rozwarstwienie tkanek dziesiętnych człowieka

UWAGA: Płytka podstawowa jest podstawą pod łożyskiem i jest do niego przymocowana i reprezentuje powierzchnię matki. Błony owodniowe obejmują owodnię i kosmówkę. Płytka podstawowa zawiera decidua basalis, a kosmówka zawiera decidua parietalis (ryc. 1).

  1. Decidua Basalis
    1. Wytnij fragment płytki podstawnej z jednego liścienia łożyska (ryc. 1A i 1B).
    2. Umieść go na sterylnej desce do krojenia kosmkami łożyskowymi skierowanymi do góry. Strona przedstawiająca kosmki łożyskowe jest zwykle krwawoczerwona z wyglądem owłosionej tkanki. Płytka podstawowa jest gładka i bladoczerwona.
    3. Użyj ostrych, cienkich nożyczek i kleszczy, aby usunąć tkankę kosmkową i naczynia krwionośne. Podczas procesu utrzymuj tkankę nasączoną 1x PBS (wolne od Ca2 + - i Mg2 + - ) (Rysunek 1C). Zbierz od 2 do 3 takich kawałków i dokładnie spłucz je 1x PBS, aby usunąć krew (Rysunek 1D).
  2. Decidua Parietalis
    1. Wypreparuj fragment błon owodniowych (około 10 cm x 10 cm, ryc. 1E). Umieść go na tablicy kosmówką skierowaną do góry. Strona kosmówkowa zawiera krwawe skrzepy i jest zwykle jasnożółtawa.
    2. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć jak najwięcej skrzepów krwi (ryc. 1E). Wypłucz membranę w sterylnym 1x PBS, aby usunąć nadmiar krwi z membrany, aż 1x PBS będzie czysty.
    3. Użyj jednorazowego sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać warstwę dziesiętną z membrany. Nałóż sterylny 1x PBS na membranę podczas zakończenia tego procesu (Rysunek 1F). Zebrać tkanki dziesiętne i umieścić je w plastikowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym 1x PBS (ryc. 1G).

2. Mechaniczna dezagregacja i trawienie enzymatyczne

  1. Umyć tkankę wyciętą z decidua basalis (z kroku 1.1.3) lub decidua parietalis (z kroku 1.2.3) sterylnym 1x PBS w plastikowej probówce o pojemności 50 ml. Zebrać granulki tkanek przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Ostrożnie odessać supernatant znajdujący się nad osadem tkankowym, nie naruszając osadu.
    UWAGA: W tym momencie, granulki są bardzo luźne, ponieważ zawierają czerwone krwinki. Jeżeli objętość osadu wynosi około lub mniej niż 3 ml, należy zawiesić osad w 6 ml roztworu do oddzielania komórek podgrzanego do temperatury 37 °C. Jeśli osad jest większy niż 3 ml objętości, dodaj więcej roztworu do odrywania komórek (dodać około 2-krotność objętości próbek tkanek).
  3. Przenieść homogenizowane tkanki (decidua basalis + roztwór do odrywania komórek lub decidua parietalis + roztwór do odrywania komórek) do probówki C.
  4. Umieść rurkę C w automatycznym dysocjatorze i uruchom odpowiedni program.
    UWAGA: Program dla decidua basalis trwa 17 sekund z łączną liczbą 668 rund na bieg. Program decidua parietalis trwa 37 sekund, a łączna liczba rund wynosi 235 razy. Programy te zostały dostosowane do izolowania leukocytów z decidua basalis lub decidua parietalis z dobrą wydajnością i żywotnością komórek.
  5. Po mechanicznej dezagregacji tkanek należy je roztrawić dostępnym w handlu roztworem do odrywania komórek, takim jak akutaza; (koktajl zawierający enzymy proteolityczne i kolagenolityczne) przez 45 minut w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem.

3. Izolacja leukocytów

  1. Po inkubacji dodać 10 ml 1x PBS do mieszaniny wytrawiającej i przepuścić przez sitko o wielkości 100 μm do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. W zależności od lepkości mieszanki wytrawiającej, może być konieczne użycie kilku sitek komórkowych do jednej mieszanki.
  2. Napełnij probówkę 1x PBS i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń 1x PBS nad osadkami komórek i ponownie zawiesij granulki w 5 ml lodowatego buforu FACS.
    UWAGA:Aby zbadać leukocyty wielojądrzaste i jednojądrzaste razem, przejdź do kroku 6.1; aby zbadać leukocyty jednojądrzaste, przejdź do kroku 3.3.
  3. Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości 20% (1,077 + 0,001 g/ml) do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i powoli nakładać zawiesinę komórek na podłoże o gradiencie gęstości. Podczas nakładania warstw próbki ważne jest, aby nie mieszać podłoża gradientu gęstości z zawiesiną komórkową.
  4. Wirówka z odchylanym rotorem o sile 500 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C bez hamulca. Bardzo ważne jest, aby wyłączyć hamulec, aby uniknąć mieszania się komórek i utraty gradientu. Leukocyty zostaną znalezione na granicy faz między pożywką gradientu gęstości a buforem FACS.
  5. Bardzo ostrożnie usuń górną warstwę zawierającą bufor FACS i resztki komórek za pomocą pipety. Pasmo na granicy zawiera dziesiętne komórki jednojądrzaste i część leukocytów wielojądrzastych.
  6. Przenieś komórki na granicy faz całkowicie do nowej plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj co najmniej 3 razy większą objętość bufora FACS.
  7. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby granulować komórki. Odessać supernatant i przemyć komórki buforem FACS. Granulować komórki za pomocą kolejnego wirowania przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Aby przeprowadzić hodowlę komórkową, patrz krok 4. Aby przeprowadzić sortowanie komórek, zobacz krok 5. Aby przeprowadzić immunofenotypowanie, patrz Krok 6.

4. Zastosowania – Hodowla komórkowa

  1. Ponownie zawiesić komórki z kroku 3.7 w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640. Policz żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i roztworu błękitu trypanowego 0,4%.
  2. Zsumuj ilość pożywki hodowlanej RPMI, aby uzyskać stężenie komórek 1 x 106 komórek/ml. Komórki są teraz gotowe do hodowli.

5. Zastosowania – Izolacja makrofagów do pierwotnej hodowli komórkowej

  1. Aby wyizolować komórki CD14+, oznacz magnetycznie komórki z kroku 3.7 mikrogranulkami CD14 (20 μl kulek na 107 komórek), inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C i oddziel komórki CD14+ od innych typów komórek za pomocą pola magnetycznego. Po 2 płukaniach buforem MACS i usunięciu pola magnetycznego należy wymyć magnetycznie zatrzymane komórki CD14 + za pomocą bufora MACS.
  2. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osady komórkowe w pożywce hodowlanej RPMI 1640. Ogniwa są gotowe do posiewu (rysunek 2).

6. Zastosowania – Immunofenotypowanie

  1. Aby użyć komórek do immunofenotypowania, ponownie zawiesić komórki z kroku 3.7 w 1 ml 1x PBS. Policz żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i roztworu błękitu trypanowego 0,4%.
  2. Oznacz komórki możliwym do utrwalenia barwnikiem żywotności (ryc. 3). Umyj komórki dwukrotnie buforem FACS i ponownie zawieś komórki w buforze do barwienia. Inkubować z blokerem FcR przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodaj przeciwciała zewnątrzkomórkowe sprzężone z fluorochromami. Na przykład w tym protokole należy użyć przeciwciał anty-CD3, anty-CD19, anty-CD14, anty-CD15 i anty-CD56 (Tabela 1). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  4. Po 2 płukaniach 1x PBS komórki zostaną przeanalizowane w 500 μl buforu barwiącego za pomocą cytometru przepływowego. Przedstawienie strategii bramkowania zastosowanej do analizy subpopulacji leukocytów znajdujących się w tkankach dziesiętnych przedstawiono na rycinie 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Preprocessing tkanek ludzkich na styku matka-płód (decidua basalis i decidua parietalis) przedstawiono na Rysunku 1. Procedura ta obejmuje preparowanie płyty podstawnej, która zawiera decidua basalis (Rysunek 1A-D). Decidua basalis jest uzyskiwana poprzez usunięcie kosmków łożyska (strona płodowa) z płyty podstawnej (Rysunek 1C). Decidua parietalis jest zbierana poprzez delikatne skrobanie błonyt chorionu (Rysunek 1E-F)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Charakterystyka właściwości funkcjonalnych i fenotypowych naciekających leukocytów na granicy faz człowiek-matka-płód jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów immunologicznych, które prowadzą do zaburzeń ciąży. Opisano kilka technik izolowania leukocytów z ludzkiej granicy matczyno-płodowej przez cały okres ciąży 10,14,25,28,37,42,43. Jednak każda z tych technik jest inna, wykorzystuje różne enzymy lub kombinacje enzymów, wymaga różnych czasów dysocjacji, nie określa ilości tkanki i, co najważniejsze, nie zaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver, NIH/DHHS. Prace te były również częściowo wspierane przez Inicjatywę Perinatalną Uniwersytetu Stanowego Wayne w zakresie zdrowia matki, dziecka i matki. Serdecznie dziękujemy Maureen McGerty (Wayne State University) za jej krytyczne odczytanie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dysparsekcja
Sterylne narzędzia do preparacji: nożyczki chirurgiczne, kleszcze i pęsety z cienką końcówką Dowolny dostawca20012-027
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Life Technologies(1X PBS)
Duże i małe szalki PetriegoDowolny dostawca
Dysocjacja
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(roztwór do odrywania komórek)
Sterylne probówki stożkowe o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiemDowolna
stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlDowolny dostawca
100 i mikro; m sitka komórkoweFALCON/Corning352360
5 ml probówki z polistyrenu z okrągłym dnemDowolny dostawca
Pipety transferoweDowolny dostawca
Probówki CMiltenyi Biotec130-093-237
Cell Culture
RPMI pożywka hodowlana 1640 Life Technologies22400-089(1X) (10% FBS i 1% P/S)
Szkiełka z tworzywa sztucznegoInkubator177437
Scientific Corporation ŁaźniaHEPA Class 100
Fisher ScientificISOTEMP 110
Licznik komórekMikroskop NexelcomCellometer Auto2000
OlympusOlympus CKX41
Cell Separation
MS kolumnyMiltenyi Biotec130-042-201
Separator komórekMiltenyi Biotec130-042-109
30 μ m filtry do separacji wstępnejMiltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 ml probówki stożkowe safe-lockBufor MACS dowolnego dostawcy
 (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2 mM EDTA i 1X PBS)
odczynniki
FcR blokująceMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
Przeciwciała anty-antygenowe powierzchni komórek ludzkich BD Biosciences(Tabela 1)
Albumina surowicy bydlęcej SigmaA7906
LIVE/DEAD barwnik żywotnościBD Biosciences564406
Bufor Lyse/Fix BD Biosciences346202
bufor FACS (0,1% BSA, 0,05% azydek sodu i 1X PBS, pH = 7,4)
Bufor barwiący BD Biosciences554656
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-02Pożywka o gradinie gęstości 20% (1,077 + 0,001 g/ml)
Dodatkowe instrumenty
Inkubator z wytrząsarkąThermo ScientificMAXQ 4450
Cytometr przepływowyWirówka BD BiosciencesLSR-Fortessa
 Beckman CoulterSpinChron DLX
System próżniowyDowolny dostawca
Automatyczny dysocjator tkanek DysocjatorMiltenyi Biotec
dostawcaThermo wodna gentleMACS

Bibliografia

  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
  4. Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, Suppl 1. S7(2007).
  5. Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
  6. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  7. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
  8. Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
  9. Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
  10. Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
  11. Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
  12. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  13. Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
  14. Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
  15. Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
  16. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
  17. Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
  18. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  19. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  20. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  21. Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
  22. Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
  23. Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
  24. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39(2012).
  25. Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
  26. Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946(2013).
  27. Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
  28. Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
  29. Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
  30. Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
  31. Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
  32. Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
  33. Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
  34. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  35. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
  36. Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
  37. Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
  38. Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
  39. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
  40. Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
  41. Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
  42. White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
  43. Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
  44. Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
  45. Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
  46. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  47. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  48. Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
  49. Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
  50. Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
  51. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  52. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  53. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja leukocyt wtkanka decydualnadysagregacja mechanicznatrawienie enzymatycznewirowanie w gradiencie g sto cifiltracja przez sitko kom rkoweimmunofenotypowanieywotno kom rektesty funkcjonalne
Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.