Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tolerancja immunologiczna w ciąży wymaga, aby układ odpornościowy matki ulegał charakterystycznym zmianom, aby akceptować i pielęgnować rozwijający się płód. Tolerancja ta jest inicjowana podczas stosunku, ustalana podczas zapłodnienia i zagnieżdżania się i utrzymywana przez całą ciążę. Aktywne mediatory komórkowe i molekularne tolerancji matczyno-płodowej są wzbogacone w miejscu kontaktu między tkankami płodu i matki, znanym jako interfejs matczyno-płodowy, który obejmuje łożysko oraz tkanki macicy i dziesiętne. Ten interfejs składa się z komórek zrębu i naciekających leukocytów, a ich liczebność i cechy fenotypowe zmieniają się w trakcie ciąży. Naciekające leukocyty na granicy matczyno-płodowej obejmują neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki tuczne, limfocyty T, limfocyty B, komórki NK i komórki NKT, które razem tworzą lokalne mikrośrodowisko podtrzymujące ciążę. Brak równowagi między tymi komórkami lub jakakolwiek niewłaściwa zmiana w ich fenotypach jest uważana za mechanizm choroby w ciąży. Dlatego badanie leukocytów, które infiltrują granicę matczyno-płodową, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów immunologicznych, które prowadzą do powikłań związanych z ciążą. Opisany w niniejszym dokumencie jest protokół, który wykorzystuje kombinację delikatnej dysocjacji mechanicznej, po której następuje silna dezagregacja enzymatyczna z proteolitycznym i kolagenolitycznym koktajlem enzymatycznym w celu wyizolowania naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej. Protokół ten pozwala na izolację dużej liczby żywotnych leukocytów (>70%) o wystarczająco konserwatywnych właściwościach antygenowych i funkcjonalnych. Wyizolowane leukocyty można następnie analizować za pomocą kilku technik, w tym immunofenotypowania, sortowania komórek, obrazowania, immunoblottingu, ekspresji mRNA, hodowli komórkowej i testów funkcjonalnych in vitro, takich jak mieszane reakcje leukocytów, proliferacja lub testy cytotoksyczności.
Wprowadzenie
Tolerancja immunologiczna w ciąży to okres, w którym zachodzą charakterystyczne zmiany w układzie odpornościowym matki. Zmiany te pozwalają matce tolerować płód, przeszczep półallogeniczny1. Płód wykazuje ekspresję ojcowskich antygenów głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC)2, a komórki płodowe znaleziono w krążeniu matki3; Jednak płód nie jest odrzucany4,5. Zagadka ta nie jest do końca zrozumiała.
Najnowsza hipoteza mówi, że tolerancja matczyno-płodowa jest tworzona podczas stosunku płciowego i zapłodnienia6,7 i utrzymywana do utrzymania donoszonej ciąży8-10. Załamanie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przed rozpoczęciem pracy z próbkami wymienionymi w tym protokole, Lokalna Komisja Etyki Badań Naukowych i Instytucjonalne Komisje Rewizyjne muszą wyrazić zgodę na etyczne stosowanie zwierząt. Podczas pracy z krwią zwierzęcą, komórkami lub czynnikami niebezpiecznymi, jak wspomniano w niniejszym protokole, należy przestrzegać odpowiednich działań w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego.
1. Obsługa myszy i pobieranie tkanek
- Przygotuj sterylne stanowisko pracy i zaopatrz się w sterylne narzędzia do pobierania tkanek. Narzędzia te będą obejmować duże i małe nożyczki chirurgiczne, kleszcze i pęsety z c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Preparatyka tkanek mysich z interfejsu matka-płód została przedstawiona na Rysunku 1; procedura ta obejmuje otwarcie jamy otrzewnej (Rysunek 1A,B), rogów macicy (Rysunek 1C) w tym miejsc implantacji (Rysunek 1D), a także pobranie tkanek macicy (Rysunek 1E), łożyska (Rysunek 1F) oraz tkanek decydualnych (Rysunek 1G) w 16,5 dpc. Rysunek 2 przedstawia morfologię wyizolowanych makrofagów (F4.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Gromadzenie spójnych danych, które rejestrują obfitość i cechy fenotypowe naciekających leukocytów na granicy matczyno-płodowej, jest niezbędne do zrozumienia patogenezy powikłań związanych z ciążą. Opisano kilka technik, które ułatwiają izolację naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej przez cały okres ciąży31,38,39,43-46. Jednak każda technika jest inna, wykorzystuje różne enzymy lub kombinacje enzymów, wymaga różnych czasów dysocjacji, nie określa ilości tkanki i, co najważniejsz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.
Podziękowania
NGL był wspierany przez Wayne State University Perinatal Initiative in Maternal, Perinatal and Child Health. Wyrażamy wdzięczność Maureen McGerty i Amy E. Furcron (Wayne State University) za ich krytyczną lekturę manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Separator komórek | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μ m filtry do wstępnej | separacji Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml probówki stożkowe | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Buffer | Militenyi Biotec | Preparat laboratoryjny | (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2mM EDTA i 1x PBS, pH 7,2) |
| Odczynniki | |||
| Roztwór enzymatyczny Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anty-mysie CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Przeciwciała zewnątrzkomórkowe przeciw myszom | BD Bioscences/eBiosciencesTabela | 1 | |
| Azydek sodu | Fisher | S227-500 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| ŻYWY/MARTWY barwnik żywotności | Life Technologies | L23105 | |
| Roztwór buforowy do utrwalania | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Bufor | BD Biosciences | Preparat laboratoryjny | 0,1% BSA, 0,05% azydek sodu, 1x PBS, pH 7,4 |
| Roztwór błękitu trypanowego 0,4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Dodatkowe instrumenty | |||
| Inkubator z wytrząsarką | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Cytometr przepływowy | BD LSRFortessa | ||
| Wirówka | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| System | zbudowany laboratoryjnie | ||
| Inkubator | Termo Inkubator Naukowy | 3307 | |
| Łaźnia wodna | Precyzyjna | 51221035 | |
| Licznik komórek | BIO-RAD | TC20 Automatyczny licznik | |
| Mikroskopy optyczne i fluorescencyjne | Zeiss i Olympus | Zeiss LSM780 i Olympus CKX41 |
Bibliografia
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
