Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

17.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

21 maja 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Tolerancja immunologiczna w ciąży wymaga, aby układ odpornościowy matki ulegał charakterystycznym zmianom, aby akceptować i pielęgnować rozwijający się płód. Tolerancja ta jest inicjowana podczas stosunku, ustalana podczas zapłodnienia i zagnieżdżania się i utrzymywana przez całą ciążę. Aktywne mediatory komórkowe i molekularne tolerancji matczyno-płodowej są wzbogacone w miejscu kontaktu między tkankami płodu i matki, znanym jako interfejs matczyno-płodowy, który obejmuje łożysko oraz tkanki macicy i dziesiętne. Ten interfejs składa się z komórek zrębu i naciekających leukocytów, a ich liczebność i cechy fenotypowe zmieniają się w trakcie ciąży. Naciekające leukocyty na granicy matczyno-płodowej obejmują neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki tuczne, limfocyty T, limfocyty B, komórki NK i komórki NKT, które razem tworzą lokalne mikrośrodowisko podtrzymujące ciążę. Brak równowagi między tymi komórkami lub jakakolwiek niewłaściwa zmiana w ich fenotypach jest uważana za mechanizm choroby w ciąży. Dlatego badanie leukocytów, które infiltrują granicę matczyno-płodową, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów immunologicznych, które prowadzą do powikłań związanych z ciążą. Opisany w niniejszym dokumencie jest protokół, który wykorzystuje kombinację delikatnej dysocjacji mechanicznej, po której następuje silna dezagregacja enzymatyczna z proteolitycznym i kolagenolitycznym koktajlem enzymatycznym w celu wyizolowania naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej. Protokół ten pozwala na izolację dużej liczby żywotnych leukocytów (>70%) o wystarczająco konserwatywnych właściwościach antygenowych i funkcjonalnych. Wyizolowane leukocyty można następnie analizować za pomocą kilku technik, w tym immunofenotypowania, sortowania komórek, obrazowania, immunoblottingu, ekspresji mRNA, hodowli komórkowej i testów funkcjonalnych in vitro, takich jak mieszane reakcje leukocytów, proliferacja lub testy cytotoksyczności.

Wprowadzenie

Tolerancja immunologiczna w ciąży to okres, w którym zachodzą charakterystyczne zmiany w układzie odpornościowym matki. Zmiany te pozwalają matce tolerować płód, przeszczep półallogeniczny1. Płód wykazuje ekspresję ojcowskich antygenów głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC)2, a komórki płodowe znaleziono w krążeniu matki3; Jednak płód nie jest odrzucany4,5. Zagadka ta nie jest do końca zrozumiała.

Najnowsza hipoteza mówi, że tolerancja matczyno-płodowa jest tworzona podczas stosunku płciowego i zapłodnienia6,7 i utrzymywana do utrzymania donoszonej ciąży8-10. Załamanie tej tolerancji matczyno-płodowej jest uważane za mechanizm choroby we wczesnych i późnych stadiach ciąży10-16. Tolerancja matczyno-płodowa obejmuje udział różnych subpopulacji leukocytów, w tym limfocytów T (limfocytów T regulatorowych, komórek Th1, komórek Th2 i komórek Th17), makrofagów, neutrofili, komórek tucznych, komórek NK i komórek NKT, komórek dendrytycznych i komórek B, które zmieniają gęstość i lokalizację w czasie ciąży15,17-19. Tolerancja matczyno-płodowa jest wzbogacona na granicy matczyno-płodowej20 - anatomicznym miejscu, w którym układ odpornościowy matki oddziałuje z antygenami płodu20,21.

Interfejs matczyno-płodowy powstaje podczas łożyskowania, gdy pozakosmkowe komórki trofoblastu płodu atakują błonę śluzową macicy22-24. Po stronie płodu tego interfejsu błony otaczające płód tworzą wyspecjalizowaną powierzchnię nabłonka w łożysku, a komórki syncytiotrofoblastu kontrolują wymianę składników odżywczych poprzez bezpośredni kontakt z krwią matki22. Po matczynej stronie interfejsu, decidua rekrutuje heterogeniczną pulę leukocytów, które u myszy stanowią od 30% do 50% wszystkich komórek dziesiętnych. Oprócz udziału w matczynej tolerancji immunologicznej, komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych procesach zachodzących w czasie ciąży, np. w ochronie układu rozrodczego przed infekcjami, zapłodnieniu, zagnieżdżeniu się zarodka7,25, angiogenezie dziesiętnej26, przebudowie naczyń krwionośnych24,27, inwazji trofoblastu28, rozwoju łożyska24,25 i ostatecznie porodzie i porodzie15,17. Dlatego badanie leukocytów biorących udział w tolerancji matczyno-płodowej jest niezbędne do wyjaśnienia patogenezy powikłań związanych z ciążą.

Podczas gdy użycie immunohistochemii i immunofluorescencji wygenerowało dane do bezpośredniej wizualizacji i lokalizacji leukocytów macicy, dziesiętnych lub łożyskowych29,30, analiza cytometrii przepływowej ujawniła również specyficzne podzbiory leukocytów w każdej z tych tkanek31,32. Dodatkowo zastosowano cytometrię przepływową do określenia gęstości i proporcji leukocytów na granicy matczyno-płodowej33 oraz poziomów ekspresji białek zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych8-10,34. Analiza leukocytów metodą cytometrii przepływowej na granicy matczyno-płodowej wymaga zawiesiny jednokomórkowej. W celu wyizolowania leukocytów naciekających z tkanek liściastych, macicy i łożyska zastosowano dwie metody dysocjacji tkanek: mechaniczną i enzymatyczną. Obie metody pozwalają na oddzielenie naciekających leukocytów od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) tych tkanek. Enzymatyczna dysocjacja tkanek jest lepsza niż mechaniczna dysocjacja tkanek, ponieważ pozwala na wyższą wydajność leukocytów przy mniejszych uszkodzeniach związanych z siłą ścinającą35. W związku z tym mechaniczna dysocjacja tkanek wymaga łączenia tkanek36, co może zwiększyć zmienność i niejednorodność próbek. Jednak dysocjacja mechaniczna może być wyborem, gdy antygen będący przedmiotem zainteresowania może zostać zmieniony przez dysocjację enzymatyczną lub gdy konieczne jest zachowanie funkcjonalności komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. cytotoksyczność komórek NK)35.

Użycie proteolizy z określonymi enzymami do degradacji ECM eliminuje niskie plony obserwowane przy dysocjacji mechanicznej. Kilka badań wykazało stosowanie trypsyny32, kolagenazy37, DNazy31, dyspazy38 i komercyjnych koktajli różnych enzymów32,39. Jednak charakter i stężenie różnych enzymów oraz czas trawienia muszą być skrupulatnie określone i zwalidowane, aby zapewnić utrzymanie integralności epitopów antygenowych na powierzchni komórki wymaganych do immunofenotypowania. Różne struktury powierzchniowe są w różny sposób podatne na zniszczenie przez różne enzymy, przy czym niektóre enzymy, takie jak trypsyna, są znane z usuwania epitopów powierzchniowych leukocytów rozpoznawanych przez wiele przeciwciał monoklonalnych.

Tu przedstawiona jest metoda wykorzystująca proteolityczny i kolagenolityczny koktajl enzymatyczny, zwany Accutase. Ten enzymatyczny roztwór jest wystarczająco delikatny, a jednocześnie skuteczny w dysocjacji tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej i nie wymaga dodawania innych odczynników dysocjujących lub surowicy w celu zakończenia reakcji dysocjacji. Co więcej, jest gotowy do użycia w takiej postaci, w jakiej został dostarczony i chociaż czas dysocjacji musi zostać zweryfikowany, jest bardziej wytrzymały niż wyżej wymienione enzymy40,41.

Wykorzystanie kombinacji obu typów dezagregacji tkanek poprawia jakość i ilość uzyskanych komórek; dlatego w kilku badaniach zastosowano łączne zastosowanie dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej z zadowalającymi wynikami31,32,37. Opisany w niniejszym dokumencie protokół został ustalony i zatwierdzony w naszym laboratorium; Wykorzystuje kombinację delikatnej dysocjacji mechanicznej, po której następuje silna dezagregacja enzymatyczna. Protokół ten pozwala na izolację i dalsze badanie naciekających leukocytów w tkankach mysich na granicy matczyno-płodowej (macica, decidua i łożysko). Poniższy protokół utrzymuje również integralność markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, jak wykazano w analizie cytometrii przepływowej. Wreszcie, protokół ten utrzymuje spójność przygotowania komórek do analizy i porównania różnych tkanek mysich tworzących interfejs matczyno-płodowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przed rozpoczęciem pracy z próbkami wymienionymi w tym protokole, Lokalna Komisja Etyki Badań Naukowych i Instytucjonalne Komisje Rewizyjne muszą wyrazić zgodę na etyczne stosowanie zwierząt. Podczas pracy z krwią zwierzęcą, komórkami lub czynnikami niebezpiecznymi, jak wspomniano w niniejszym protokole, należy przestrzegać odpowiednich działań w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego.

1. Obsługa myszy i pobieranie tkanek

  1. Przygotuj sterylne stanowisko pracy i zaopatrz się w sterylne narzędzia do pobierania tkanek. Narzędzia te będą obejmować duże i małe nożyczki chirurgiczne, kleszcze i pęsety z cienką końcówką. Dołączyć małe szalki Petriego oznakowane odpowiednimi nazwami tkanek, wypełnione 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (3 - 5 ml) zrównoważonym do temperatury suchej (20 - 22 °C). Dołącz również dużą szalkę Petriego, nieoznakowaną, wypełnioną 1x roztworem PBS (10 - 15 ml).
  2. Poddaj eutanazji ciężarną mysz (10,5 do 19,0 dni po stosunku (dpc) lub przed porodem) za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ). Aby upewnić się, że mysz zostanie poddana eutanazji, użyj techniki zwichnięcia szyjki macicy.
    Uwaga: Przed 10,5 dpc trudno jest ręcznie oddzielić tkanki dziesiętne od tkanek macicy. Jeśli izolacja leukocytów dziesiętnych nie jest wymagana, leukocyty z tkanek macicy myszy niebędących w ciąży lub leukocyty z myszy w <10,5 dpc można również wykonać, postępując zgodnie z tym protokołem.
  3. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych całkowicie usuń dolną część skóry i tkankę mięśniową brzucha. Za pomocą kleszczy odsuń na bok wszystkie inne narządy, aż macica i jajniki będą widoczne. Gdy macica jest nadal przyczepiona, użyj kleszczy, aby przesunąć ją na zewnątrz jamy otrzewnej (ryc. 1A).
  4. Zlokalizuj jajniki dystalnie do jajowodu i połączenia macicowo-jajowodowego każdego rogu macicy. Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na połączeniu maciczniowo-tubowym i oddziel rogi macicy od krezki zawierającej naczynia maciczne; następnie wyciąć szyjkę macicy, aby oderwać rogi macicy od jamy otrzewnej (ryc. 1B).
  5. Małymi nożyczkami chirurgicznymi wykonaj nacięcie między szyjką macicy a dolnym odcinkiem rogów macicy. Podczas tego procesu pozostaw przyczepioną część szyjki macicy (ryc. 1C), aby uniknąć otwarcia rogu macicy.
  6. Zanurz rogi macicy (w tym szyjkę macicy) na dużej szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (10 - 15 ml), aby nawodnić miejsca implantacji.
  7. Będąc nadal zanurzonym w roztworze 1x PBS, odetnij tłuszcz z rogów macicy za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Utrzymuj tkanki zanurzone w 1x roztworze PBS przez cały czas trwania sekcji.
  8. Przytrzymując rogi macicy na miejscu za pomocą kleszczy, usuń jedno z miejsc implantacji z macicy za pomocą poprzecznego przecięcia przez obszar międzyimplantacyjny, używając małych nożyczek chirurgicznych (ryc. 1D). W miejscu implantacji znajduje się płód otoczony błoną kosmówkowo-omoczniową oraz tkanki macicy, liściastej i łożyska.
  9. Za pomocą kleszczy przytrzymaj miejsce na miejscu i wykonaj małe nacięcie w ścianie macicy przylegającej do tkanek łożyskowych i dziesiętnych (ryc. 1E). Przyciąć na obwodzie łożyska/decidua, aż zostaną one oddzielone zarówno od ściany macicy, jak i błony kosmówkowo-omoczniowej, która obejmuje płód (ryc. 1F).
  10. Usunąć łożysko i dołączone tkanki dziesiętne i umieścić w 1x roztworze PBS (3 - 5 ml; patrz krok 1.12).
  11. Umieść płód otoczony błoną kosmówkowo-omoczkową przyczepioną do tkanek macicy na szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (3 - 5 ml). Nawodnienie tych tkanek ułatwi oddzielenie błony kosmówkowo-omoczniowej od ściany macicy (patrz krok 1.14).
  12. Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie oderwij tkankę dziesiętną (biało-szarą warstwę) z powierzchni łożyska. Wykonaj ten krok ostrożnie, aby zachować integralność tkanek łożyska i tkanek liściastych (ryc. 1G).
  13. Umieść łożysko i tkanki dziesiętne na dwóch oddzielnie oznakowanych szalkach Petriego wypełnionych 1x roztworem PBS (3 - 5 ml każda).
  14. Delikatnie usuń ścianę macicy z błony kosmówkowo-omoczniowej za pomocą pęsety z cienką końcówką. Są to tkanki macicy.
  15. Umieść tkanki macicy na szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (3 - 5 ml).
  16. Powtarzaj kroki od 1.8 do 1.15, aż wszystkie miejsca implantacji zostaną przetworzone.
  17. Zbierz kilka tkanek macicy, dziesiętnych i łożyska, aby poprawić wydajność komórek podczas trawienia enzymatycznego. Ilość chusteczek zależy od wielkości ściółki; Jednak izolacja leukocytów wymaga >2 kawałków tkanki.
    Uwaga: Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat sekcji miejsc implantacji w różnych dniach ciąży, zobacz zdjęcia znajdujące się w rozdziale drugim >Przewodnika po badaniu ciąży myszy42.

2. Dysocjacja tkanki macicznej, dziesiętnej i łożyskowej

  1. Oznaczyć kilka sterylnych probówek stożkowych o pojemności 2 ml odpowiednią nazwą tkanki i umieścić fiolkę z 1 000 μl roztworu enzymatycznego na lodzie.
  2. Z szalki Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS przenieść dwa kawałki (100 - 150 mg) tkanek macicy, liściastych lub łożyska do znakowanej probówki stożkowej o pojemności 2 ml.
  3. Dodać 500 μl zimnego roztworu enzymatycznego do każdej stożkowej probówki o pojemności 2 ml.
  4. Za pomocą cienkich sterylnych nożyczek zacznij dysocjować tkankę zanurzoną w roztworze enzymatycznym, aż zostanie drobno zmielona. Z biegiem czasu zawiesina nabierze mlecznego wyglądu. Etap ten nie powinien trwać dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec nadmiernej manipulacji próbką.
  5. Po dysocjacji tkanki dodać dodatkowe 500 μl zimnego roztworu enzymatycznego do stożkowej probówki o pojemności 2 ml.
  6. Umieść stożkową probówkę o pojemności 2 ml na lodzie.
  7. Powtarzać kroki od 2.2 do 2.6 z każdą pojedynczą tkanką, aż wszystkie tkanki zostaną przetworzone.
  8. Przenieść wszystkie stożkowe probówki o pojemności 2 ml z homogenizowanymi próbkami tkanek (tkanka mielona + roztwór enzymatyczny) z lodu do inkubatora w temperaturze 37 °C i przeprowadzić delikatne mieszanie orbitalne (80 obr./min). Inkubować przez 30 - 35 minut. Upewnij się, że temperatura inkubatora jest ustabilizowana przed rozpoczęciem inkubacji.
  9. Po inkubacji należy wyjąć z inkubatora stożkowe probówki o pojemności 2 ml ze zdysocjowanymi tkankami i umieścić je na lodzie, aby zapobiec dalszemu trawieniu.
  10. Oznacz sterylne probówki stożkowe o pojemności 50 ml w zależności od rodzaju tkanki. Zdejmij pokrywki i zastąp je sterylnym sitkiem do komórek (wielkość porów 100 μm).
  11. Przelać zdysocjowane tkanki z 2 ml stożkowych probówek przez sitko do komórek, używając ~20 ml 1x roztworu PBS. Fragmenty tkanki pozostaną w sitku komórkowym, a zawiesina komórek przejdzie przez nie.
  12. Przemyć zdysocjowane tkanki w sitku do komórek 2 - 3 razy 20 ml 1x roztworu PBS za pomocą pipety transferowej.
  13. Przepłukać puste probówki stożkowe o pojemności 2 ml roztworem 1x PBS (1 ml) i przelać zawartość przez sitka do komórek.
  14. Wyjmij sitka z probówek stożkowych o pojemności 50 ml i załóż pokrywki. Odwirować probówki o sile 1,250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Osad komórkowy zawiera izolowane leukocyty i komórki zrębu.
  16. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Delikatnie wymieszaj. Nie używaj wiru.
  17. Dodaj 500 μl czystego FBS do 5 ml plastikowej probówki z polistyrenu i powoli nakładaj zawiesinę komórek.
  18. Wirować przez 10 minut przy 1 100 x g bez hamulca w temperaturze pokojowej w celu osadzania żywych komórek, podczas gdy resztki komórkowe są zatrzymywane na granicy faz PBS/FBS.
  19. Odessać supernatant bez dotykania osadu komórkowego. Osad komórkowy zawiera głównie żywe komórki.
  20. Opcjonalnie: Aby zagęścić komórki jednojądrzaste, użyj 20% nasyconego roztworu polisacharydów, jak opisano poniżej.
    1. Zawiesić osad komórkowy w 1,000 μl pożywki hodowlanej RPMI bez FBS.
    2. Dodaj 1 ml 20% nasyconego roztworu polisacharydów do 5 ml plastikowej probówki z polistyrenu i powoli nakładaj zawiesinę komórek na ten roztwór, zgodnie z instrukcjami producenta. Podczas nakładania warstw próbki należy unikać mieszania 20% nasyconego roztworu polisacharydów z zawiesiną komórkową.
    3. Wirówka z odchylanym wirnikiem o sile 500 x g przez 30 min przy suchej smołce bez hamulca. Bardzo ważne jest, aby wyłączyć hamulec, aby uniknąć mieszania się komórek i utraty gradientu. Komórki jednojądrzaste znajdą się na granicy faz między 20% nasyconym roztworem polisacharydów a roztworem 1x PBS.
    4. Odessać i wyrzucić supernatant. Osad komórkowy zawiera głównie komórki jednojądrzaste.
      Uwaga: Aby wykonać barwienie żywotności i barwienie wewnątrzkomórkowe, patrz krok 3. Aby przeprowadzić immunofenotypowanie, patrz krok 4. Aby wykonać barwienie żywotności i barwienie zewnątrzkomórkowe, patrz krok 5. Aby przeprowadzić hodowlę komórkową izolowanych leukocytów, patrz krok 6. Aby przeprowadzić sortowanie komórek magnetycznych, patrz krok 7.

3. Barwienie żywotności komórek nadających się do naprawy

  1. Zawiesić osad komórkowy w 1 100 μl roztworu 1x PBS. Delikatnie wymieszaj za pomocą mikropipety.
  2. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Dodać 400 μl 1x roztworu PBS do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml. Ta probówka jest kontrolą autofluorescencji tkanek. Przechowywać w temperaturze 4 ºC do kroku 3.5.
  3. Przenieść pozostałe 1 000 μl zawiesiny komórek do nowej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Dodać 1 μl barwnika żywotności i delikatnie homogenizować. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. Po inkubacji dodać 1,000 μl 1x PBS roztworu. Delikatnie wymieszaj ręcznie.
  5. Odwirować obie probówki z tworzywa sztucznego polistyrenu o pojemności 5 ml (kroki 3.2 i 3.3) przy 1250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant.
    Uwaga: Osad komórkowy (krok 3.3) zostanie użyty w kroku 4. Osad komórkowy (krok 3.2) będzie służył jako kontrola autofluorescencji tkanek.

4. Immunofenotypowanie

  1. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl anty-mysiego CD16/CD32 (rozcieńczony 1:100 w buforze FACS [0,1% BSA, 0,05% azydku sodu, 1x roztwór PBS, ph 7,4]). Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Nie używaj wiru.
  2. Inkubować zawiesinę komórkową w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Po inkubacji dodać 50 μl każdego przeciwciała monoklonalnego przeciwko leukocytom reagującego z zewnątrzkomórkowymi markerami powierzchniowymi komórek lub przeciwciałem kontrolnym dopasowanym izotypowo (rozcieńczenia przeciwciał muszą być zwalidowane). Na przykład, aby przeanalizować subpopulacje leukocytów, użyj przeciwciał przeciw mysim reagującym z następującymi markerami powierzchniowymi komórek leukocytów: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4 i CD8 (Tabela 1).
  4. Po dodaniu przeciwciał przeciwko markerom zewnątrzkomórkowym do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu, delikatnie wymieszaj. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Podczas tej inkubacji przygotować i wstępnie ogrzać roztwór buforowy utrwalający (rozcieńczony wodą dejonizowaną w stosunku 1:5) do temperatury 37 °C, jeśli jest to wymagane. Przechowywać bufor w temperaturze 37 °C w ciemności do czasu, gdy konieczne będzie jego użycie.
  6. Po 30 minutach inkubacji dodać 500 μl buforu FACS do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml i delikatnie wymieszać. Ten krok jest potrzebny do umycia komórek i usunięcia nadmiaru niezwiązanego przeciwciała.
  7. Odwirować próbki w temperaturze 1 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odessać i wyrzucić supernatant.
    Uwaga: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, patrz krok 5. Jeśli wymagane jest barwienie wewnątrzkomórkowe, należy tutaj przeprowadzić przepuszczalność i barwienie wewnątrzkomórkowe, a następnie przystąpić do utrwalania (krok 4.8).
  8. Dodać 500 μl wstępnie ogrzanego roztworu buforowego utrwalającego do osadu komórkowego i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Dozować 500 μl buforu FACS do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Delikatnie wymieszaj.
  10. Odwirować próbki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odsysać i odrzucać supernatant.
  11. Dodać 500 μl buforu FACS do każdej próbki. Próbki te można teraz analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy natychmiast pobrać próbki.

5. Barwienie żywotności dla komórek niemożliwych do naprawienia

  1. Po immunofenotypowaniu zewnątrzkomórkowym ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu FACS.
  2. Dodać 1 μl dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, 200 μg/ml) bezpośrednio przed pobraniem próbki.
  3. Wizualizacja próbek w ciągu 1-2 minut po dodaniu DAPI za pomocą cytometru przepływowego.

6. Hodowla komórkowa

  1. Przygotuj stanowisko pracy pod sterylnym wyciągiem. Podgrzej pożywkę do hodowli RPMI do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 1000 μl buforu FACS w celu zliczenia komórek.
  3. Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zapisz całkowitą liczbę komórek na żywo.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu usunięcia buforu FACS.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej RPMI, delikatnie pipetując 2 do 3 razy.
  6. Umieścić żądaną liczbę komórek na sterylnej 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C. Czas inkubacji zostanie określony przez pytanie badawcze.

7. Magnetyczne sortowanie komórek

  1. Skonfiguruj czystą stację roboczą z następujących materiałów: kolumny MS, magnetyczny separator komórek, stożkowe probówki o pojemności 15 ml, filtry do wstępnej separacji 30 μm i wielostanowiskowy.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MACS (0,5% BSA, 2mM EDTA, 1x roztwór PBS, pH 7,2).
  3. Używając automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, policz i zapisz całkowitą liczbę żywych komórek.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odsysać i odrzucać supernatant. Dodaj kolejne 500 μl buforu MACS.
  5. Przystąp do przeprowadzenia separacji magnetycznej zgodnie z zaleceniami producenta.
  6. Określić czystość za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Preparatyka tkanek mysich z interfejsu matka-płód została przedstawiona na Rysunku 1; procedura ta obejmuje otwarcie jamy otrzewnej (Rysunek 1A,B), rogów macicy (Rysunek 1C) w tym miejsc implantacji (Rysunek 1D), a także pobranie tkanek macicy (Rysunek 1E), łożyska (Rysunek 1F) oraz tkanek decydualnych (Rysunek 1G) w 16,5 dpc. Rysunek 2 przedstawia morfologię wyizolowanych makrofagów (F4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Gromadzenie spójnych danych, które rejestrują obfitość i cechy fenotypowe naciekających leukocytów na granicy matczyno-płodowej, jest niezbędne do zrozumienia patogenezy powikłań związanych z ciążą. Opisano kilka technik, które ułatwiają izolację naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej przez cały okres ciąży31,38,39,43-46. Jednak każda technika jest inna, wykorzystuje różne enzymy lub kombinacje enzymów, wymaga różnych czasów dysocjacji, nie określa ilości tkanki i, co najważniejsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

NGL był wspierany przez Wayne State University Perinatal Initiative in Maternal, Perinatal and Child Health. Wyrażamy wdzięczność Maureen McGerty i Amy E. Furcron (Wayne State University) za ich krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Magentic Cell Separation
MS ColumnsMilitenyi Biotec130-042-201
Separator komórekMilitenyi Biotec130-042-102
30 μ m filtry do wstępnejseparacji Militenyi Biotec130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
15 ml probówki stożkoweThermo Fisher339650
MACS BufferMilitenyi BiotecPreparat laboratoryjny(0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2mM EDTA i 1x PBS, pH 7,2)
Odczynniki
Roztwór enzymatyczny AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Anty-mysie CD16/CD32BD Biosciences533142
Przeciwciała zewnątrzkomórkowe przeciw myszomBD Bioscences/eBiosciencesTabela1
Azydek soduFisherS227-500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
ŻYWY/MARTWY barwnik żywotnościLife TechnologiesL23105
Roztwór buforowy do utrwalaniaBD Biosciences558049
FACS BuforBD BiosciencesPreparat laboratoryjny0,1% BSA, 0,05% azydek sodu, 1x PBS, pH 7,4
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%BIO-RAD145-0013
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies16000-044
Dodatkowe instrumenty
Inkubator z wytrząsarkąThermo ScientificMaxQ 4450
Cytometr przepływowyBD LSRFortessa
WirówkaThermo ScientificLegend LXTR
Systemzbudowany laboratoryjnie
InkubatorTermo Inkubator Naukowy3307
Łaźnia wodnaPrecyzyjna51221035
Licznik komórekBIO-RADTC20 Automatyczny licznik
Mikroskopy optyczne i fluorescencyjneZeiss i OlympusZeiss LSM780 i Olympus CKX41
próżniowy komórek

Bibliografia

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja leukocytówtrawienie enzymatycznedysocjacja mechanicznagradient z płodowej surowicy bydlęcejimmunofenotypowaniesortowanie komórekhodowla komórkowacytometria przepływowa
Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.