SpOT właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych

Podsumowanie

Celem Znacznika Orientacji Próbki (SpOT) jest działanie jako narzędzie orientacyjne, które pomaga w identyfikacji poszczególnych tkanek w wielotkankowych blokach parafinowych. Protokoły te pokazują, w jaki sposób można go łatwo skonstruować z powszechnych, tanich materiałów histologicznych i służy jako niezawodny marker wizualny w blokach i przekrojach parafiny.

Streszczenie

Wielotkankowe bloki parafinowe zapewniają wysoką wydajność analizy ze zwiększoną wydajnością, jednorodnością eksperymentalną oraz zmniejszonym czasem i kosztami. Mikromacierze tkankowe stanowią większość wielotkankowych bloków parafinowych, ale coraz częściej naukowcy używają niemacierzowanych bloków zawierających większe tkanki od wielu osób, co może zapewnić wiele zalet mikromacierzy tkankowych bez znacznych inwestycji w planowanie i sprzęt. Kluczowym elementem każdej analizy wielotkankowej jest metoda orientacji stosowana do identyfikacji każdej pojedynczej tkanki. Chociaż istnieją metody pozwalające na utrzymanie prawidłowej orientacji i identyfikacji tkanek w blokach wielotkankowych, większość z nich nie nadaje się dobrze do bloków nieułożonych w układ, może zajmować cenne miejsce w matrycy i/lub jest trudna do wytworzenia w standardowym laboratorium histologicznym. Znacznik orientacji próbki (SpOT) to proste, niedrogie narzędzie orientacyjne, które jest wyraźnie widoczne w blokach parafinowych i wszystkich przekrojach tkanki, co zapewnia niezawodną identyfikację próbki w układach szykowych i nieszykowych. SpOT zapewnia przewagę nad istniejącymi metodami orientacji dla bloków bez układu, ponieważ nie wymaga żadnej bezpośredniej modyfikacji tkanki i pozwala na elastyczność w ułożeniu kawałków tkanki.

Wprowadzenie

Możliwość osadzenia próbek tkanek od wielu osób w jednym bloku parafinowym umożliwia łatwe porównywanie obok siebie zabiegów i osób, eliminuje zmienność między preparatami oraz zmniejsza koszty i nakład pracy związany z cięciem i barwieniem próbek. Te wielotkankowe bloki są zwykle produkowane jako mikromacierze tkankowe (TMA) lub bloki parafinowe zawierające tkanki od wielu osób w układzie bez macierzy. Utrzymanie tożsamości próbki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia każdej analizy wielotkankowej. Naukowcy korzystają z TMA od czasu ich opracowania, aby poprawić wydajność analizy, zmniejszyć zmienność między szkiełkami, chronić cenne zasoby tkankowe oraz skrócić czas i koszty eksperymentów¹. Prawidłowa orientacja TMA może być osiągnięta przy użyciu różnych metod, w tym pustych miejsc, rzędów lub kolumn między rdzeniami tkanek^2-4, asymetrycznego rozmieszczenia grup rdzeni^{3, 5} (np. kontrola vs. leczenie), rdzeni "beacon"⁶ i wyznaczonych rdzeni orientacyjnych znajdujących się poza matrycą TMA³. Chociaż metody te działają dobrze w przypadku TMA, większość z nich zużywa cenną przestrzeń rdzenia TMA, a TMA z przerwami i spacjami jako identyfikatorami mogą stać się mylące, ponieważ rdzenie tkanek wyczerpują się z czasem. Ponadto metody te nie są odpowiednie do stosowania w blokach wielotkankowych bez formatu tablicy, ponieważ opierają się na anomaliach w ściśle uporządkowanym wzorcu jednolitych rdzeni mikromacierzy jako identyfikatorach. Większość nieustawionych w szyku bloków wielotkankowych musi pomieścić niejednorodne tkanki i, z definicji, nie wyświetlać ustrukturyzowanej siatki tablicy, która sprawia, że te aberracje wyróżniają się jako punkty orientacyjne.

Chociaż korzystanie z TMA ma wiele zalet, jedną z największych wad jest mały rozmiar rdzeni, który nie zawsze jest reprezentatywny dla w dużej mierze heterogenicznej tkanki¹. Nieułożone bloki wielotkankowe zapewniają wiele korzyści TMA, ale zawierają większe próbki tkanek lub całe narządy z badań na zwierzętach. Mikromacierze tkankowe wykorzystujące pojedyncze rdzenie mają różną zgodność z całymi sekcjami tkanek w oparciu o białko będące przedmiotem zainteresowania, a wiele z nich wymaga wielu rdzeni w celu zwiększenia zgodności^7-11. Ze względu na złożoność i niejednorodny charakter niektórych fenotypów biomarkerów, TMA wykorzystujące nawet dużą liczbę rdzeni (>10) mogą być nadal niewystarczające i mogą wymagać do analizy metod innych niż mikromacierze⁸. Ponadto budowa TMA jest czasochłonna, wymagająca technicznie i wymaga początkowych kosztów oraz inwestycji w matrycę tkankową lub dostępu do niej. Niemacierzowane bloki wielotkankowe można wykonać w dowolnym podstawowym laboratorium przy znacznie mniejszym nakładzie czasu i wysiłku i stanowią ważną alternatywę dla badań, które wymagają większej ilości tkanki, niż pozwalają na to matryce, lub jako sposób na obniżenie kosztów i uproszczenie analizy.

Niezgrupowane bloki wielotkankowe podobnie wymagają niezawodnego znacznika orientacji do śledzenia identyfikacji próbki, jednak rozwój tych markerów został ograniczony. Znaczna część literatury opisującej orientację tkanek koncentruje się na prawidłowej orientacji fizjologicznej przy osadzaniu poszczególnych fragmentów tkanki, takich jak tatuowanie tkanki tuszem¹², wstępne zatapianie tkanek w agar-żelatynie przed przetwarzaniem¹³ i oznaczanie niektórych tkanek nacięciami¹⁴ lub szwami¹⁵. Chociaż metody te są funkcjonalne, nie są idealne jako markery w blokach wielotkankowych ze względu na ich ograniczenia. Szew zostanie szybko przecięty i może nie być widoczny w każdym przekroju. Techniki wstępnego zatapiania z użyciem agar-żelatyny mogą utrzymać tkankę we właściwej orientacji podczas przetwarzania i zatapiania, ale nie zapewniają wizualnej wskazówki do rozróżnienia wielu próbek w bloku parafinowym i szkiełkach. Nacięcia lub barwnik na tkance mogą komplikować analizę lub pomijać ważne szczegóły morfologiczne. Alternatywnie, tożsamość tkankowa w nieustawionym bloku wielotkankowym może być zachowana poprzez osadzenie fragmentów tkanki w układzie asymetrycznym, ale wymaga to 3 lub więcej fragmentów tkanki i może nie pozwolić na optymalne ułożenie tkanek do analizy.

Znacznik Orientacji Próbki (SpOT) został opracowany jako łatwa i tania metoda do wyraźnej identyfikacji tkanek w blokach wielotkankowych i oferuje wiele korzyści w porównaniu z istniejącymi metodami orientacji. SpOT to mały, kolorowy rdzeń składający się z żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylowej i barwnika do znakowania tkanek oraz infiltrowany parafiną (ryc. 2C). Rdzeń SpOT jest osadzony na końcu obok pojedynczej tkanki w wielotkankowym bloku parafinowym i pojawia się jako jaskrawo kolorowa kropka w bloku i w każdej sekcji (ryc. 1A-D), wyraźnie wskazując prawidłową orientację bloku i sekcji w celu łatwej identyfikacji tkanki.

Protokół

1. Budowa SpOT

1. Dodać 50 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 ml barwnika do znakowania tkanek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml lub probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml i wirować przez 1 minutę lub aż do całkowitego rozpuszczenia.
   Uwaga: W przypadku tego protokołu należy użyć biochemicznego BSA stopnia. Podczas gdy inne gatunki i czystości nie zostały przetestowane, oczekuje się, że klasa i czystość nie będą miały znaczącego wpływu na sukces SpOT.
2. Podgrzej 9 ml żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w kuchence mikrofalowej o mocy 30% przez 10 sekund, aż żel całkowicie się rozpuści.
3. Połączyć stopiony żel do obróbki i roztwór barwnika-BSA w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dokładnie wymieszać pipetą. Wiruj roztwór.
4. Umieść stożkową rurkę w lodówce na kilka godzin lub do zestalenia.
5. Użyj długiej, cienkiej, metalowej szpatułki lub sondy, aby delikatnie uwolnić kolorową zatyczkę żelową ze stożkowej tubki.
6. Za pomocą skalpela lub żyletki przeciąć korek żelowy poprzecznie na odcinki o grubości 5 mm. Usuń zaokrąglone końce i wyrzuć jako odpad (Rysunek 2A).
7. Umieść skrawki żelu płasko w kasetach histologicznych i przytrzymaj 70% etanolu przez 1 godzinę. Zmieniaj 70% roztwór etanolu co 2-4 godziny przez co najmniej 3 zmiany w ciągu 24 godzin.
8. Ręcznie przetworzyć skrawki żelu przez serię etanolu (po 1 godzinie: 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu (3x zmiany), a następnie oczyścić w roztworze klarującym 3x po 1 godzinie każdy (np. w tym protokole zastosowano węglowodory alifatyczne (substytut ksylenów)), dopuszczalne są również ksyleny) i naciekać stopioną parafiną (3x po 1 godzinie), ręcznie lub w procesorze tkankowym.
   Uwaga: Przed całkowitym odwodnieniem w 100% etanolu barwnik może wyciekać z korka żelowego, co może mieć wpływ na inne tkanki i płynne odczynniki w automatycznym procesorze tkanek. W związku z tym zdecydowanie zaleca się ręczne ponowne wypełnianie, jednak automatyczne przetwarzanie jest równie skuteczne.
9. Osadzanie wielu przetworzonych skrawków żelu przy użyciu standardowej metodologii zatapiania parafiny (rysunek 2B). Pozwól blokom ostygnąć i stwardnieć, a następnie osiągnij temperaturę pokojową.
10. Użyj igły do dziurkowania skórnego o pożądanym rozmiarze, aby usunąć rdzenie SpOT z osadzonych odcinków żelu, aż do wyczerpania bloku (Rysunek 2C). Pojedynczy blok może dostarczyć do 20 rdzeni x 2^mm2. Przechowuj rdzenie w chłodnym miejscu. Użyj stempla skórnego w tym protokole, patrz rysunki, 1,5 mm (rysunki 1D i 2D) lub 2 mm (rysunki 1B, 1C i 2C).

2. Używanie SpOT do orientowania bloków bez tablicy

1. Utwórz diagram orientacji tkanki, aby wskazać żądane lokalizacje i tożsamości wszystkich poszczególnych fragmentów tkanki, które mają być osadzone razem, oraz lokalizację SpOT.
   UWAGA: Diagram orientacji tkanki jest ilustrowaną mapą, która zawiera fizyczne lokalizacje wszystkich fragmentów tkanek oznaczonych identyfikatorami oraz lokalizację SpOT. Może być tworzony elektronicznie lub może być rysowany ręcznie. Diagram powinien być wykonany przy użyciu dowolnej metody, która najbardziej odpowiada technikowi i badaczowi korzystającemu z produktu końcowego. Mapa ta posłuży jako przewodnik dla badacza, dzięki czemu próbki będą mogły być łatwo zidentyfikowane podczas analizy mikroskopowej. Mapa użyta w tym protokole została narysowana ręcznie. Przedstawia blok tkankowy i szklane szkiełko mikroskopowe, przy czym każdy kawałek tkanki i SpOT są narysowane i oznaczone w tej samej pozycji, co rzeczywisty blok tkankowy i szkiełko.
2. Kawałki tkanek należy przetwarzać normalnie, upewniając się, że pozostają one prawidłowo zidentyfikowane na wszystkich etapach ubruttowiania i przetwarzania. W tym protokole przetwarzaj tkanki przez 1 godzinę każda: 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu (x3 zmiany), węglowodory alifatyczne (substytut ksylenów) (zmiany x3) i parafina infiltracyjna stopionych tkanek w temperaturze 60 °C (zmiany x3).
   UWAGA: Wszystkie tkanki powinny być przetwarzane zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi histologicznymi. Może to być zmienne w zależności od indywidualnej procedury laboratoryjnej, wielkości i rodzaju tkanki, ale nie wpłynie to na możliwość korzystania ze SpOT jako narzędzia orientacyjnego.
3. Ułóż kawałki tkanek na stacji osadzania we właściwych przypisanych miejscach zgodnie ze schematem orientacji tkanki. Użyj diagramu orientacji tkanki jako odniesienia, aby poprowadzić technika, jak ułożyć SpOT i kawałki tkanek w każdym bloku.
   UWAGA: W tym protokole technik zatapiania umieścił ręcznie narysowaną mapę orientacyjną obok stacji zatapiania i ułożył kawałki tkanek na stacji zatapiania dokładnie w takim samym układzie, jak narysowano na schemacie. Gwarantuje to, że wszystkie fragmenty tkanek pozostają prawidłowo identyfikowalne w produkcie końcowym. Jest to absolutnie niezbędne do skutecznego stosowania bloków wielotkankowych.
4. Upewnij się, że rdzeń SpOT jest wyższy niż wszystkie kawałki tkanki, które mają być osadzone w bloku.
5. Osadź kawałki tkanki, a następnie SpOT na końcu (poprzecznie) we właściwych miejscach zgodnie ze schematem orientacji tkanki przy użyciu standardowej metodologii zatapiania. W razie potrzeby trzymaj SpOT (s) pionowo za pomocą kleszczy, aż parafina zestali się na tyle, że SpOT (s) nie przewrócą się (1-2 min).
6. Przekrój i zabarwić skrawki parafiny SpOT przy użyciu standardowej metodologii.
   1. Pozostawić sekcje unoszące się na powierzchni łaźni wodnej w temperaturze 40 °C i przykleić do dodatnio naładowanego szkiełka szkiełkowego (nienaładowane szkiełka nie zostały przetestowane). Szkiełka suszyć w suszarce w temperaturze 60 °C przez co najmniej 20 minut.
   2. Umieść szkiełka w automatycznym barwieniu i przepuść przez następujące odczynniki: ksyleny (ksyleny 1-5 min, ksyleny 2 i 3-2 min, każdy), 100% etanol (2 min), 95% etanol (1 min), 80% etanol (30 sek), 70% etanol (30 sek), bieżąca woda z kranu (2 min), hematoksylina (1,5 min), bieżąca woda z kranu (3 min), kwaśny alkohol (1 min), bieżąca woda z kranu (2 min), odczynnik do niebieszczenia (1 min), bieżąca woda (2 min), 80% etanol (30 sek), eozyna (1 min), bieżąca woda (10 sek.), 80% etanol (1 min), 100% etanol (3 zmiany po 2 min), ksyleny (3 zmiany po 30 sek.).
   3. Przykryj szkiełka szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, zamontowanymi za pomocą medium montażowego.
      UWAGA: W tym protokole histotechnik podzielił bloki parafiny na mikrotomie na odcinki 5 μm. Do tego protokołu użyliśmy automatycznego barwienia, jednak takie same rezultaty można uzyskać poprzez barwienie ręczne.

3. SpOT w TMA (Ręczny zestaw TMA)

1. Należy utworzyć diagram orientacji tkanki, zgodnie z opisem w ppkt 2.1 i przypisać żądane lokalizacje SpOT.
2. Napełnij formę TMA stopioną parafiną w stacji zatapiania. Gdy forma stygnie, osadź SpOT na końcu na marginesach formy TMA w żądanych miejscach wskazanych na schemacie orientacji tkanki. W razie potrzeby trzymaj SpOT (s) pionowo za pomocą kleszczy, aż parafina zestali się na tyle, że SpOT (s) nie przewrócą się (1-2 min).
3. Zmontuj rdzenie TMA zgodnie ze wskazówkami producenta i z uwzględnieniem lokalizacji SpOT (s) na marginesach macierzy (rysunek 2D) i postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami cięcia i barwienia.
   UWAGA: Proszę zapoznać się z krokiem 2.6, aby zapoznać się z metodami cięcia i barwienia stosowanymi w tym protokole.

Wyniki

SpOT pojawia się jako okrągła, jaskrawo kolorowa kropka w bloku parafinowym (Rysunek 1A i 2D), we wszystkich sekcjach parafiny i pozostaje na szkiełku przez procedurę barwienia H&E lub IHC (Rysunki 1B-1D i 2D). Ta oczywista wskazówka wizualna pomaga zarówno histotechnikowi, jak i badaczowi w identyfikacji każdego pojedynczego fragmentu tkanki i upraszcza komunikację, ponieważ histotechnik może wykorzystać tę wizualną wskazówkę, aby w...

Dyskusja

Pomyślne przygotowanie i wykorzystanie SpOT wymaga starannego przestrzegania kilku kroków technicznych. Topienie agarozy hydroksyetylowej powinno odbywać się powoli i na małym ogniu. Szybkie topnienie w wysokiej temperaturze może spowodować pewien rozpad agarozy w celu uzyskania mniej niż optymalnych rezultatów. Podczas cięcia zatyczek obciążonych barwnikiem na kawałki do obróbki należy upewnić się, że grubość każdego kawałka jest większa niż 4,5 mm i nie przekracza 7 mm. Zaokrąglone końce są usuwane jako odpady, poniewa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Histogel Żel do przetwarzania próbek	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Trójkąt do znakowania tkanek	Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Każdy barwnik do znakowania tkanek najprawdopodobniej byłby wystarczający.
Arraymold Kit A 2 mm (60 rdzeni)	Arraymold	20015A	Każdy ręczny układ tkanek będzie działał podobnie.