Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Podsumowanie

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD). IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami. Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Streszczenie

Dopasowania białek są powszechnie używane do oceny podobieństwa reszt białkowych, a uzyskana sekwencja konsensusu służy do identyfikacji jednostek funkcjonalnych (np. domen). Tradycyjne modele budowania konsensusu nie uwzględniają zależności interpozycyjnych – funkcjonalnie wymaganej współzmienności reszt, które mają tendencję do pojawiania się jednocześnie w trakcie ewolucji i w całym drzewie filogenetycznym. Zależności te mogą ujawnić ważne wskazówki na temat procesów fałdowania białek, termostabilności i tworzenia funkcjonalnych miejsc, które z kolei mogą być wykorzystane do informowania o inżynierii białek syntetycznych. Niestety, relacje te zasadniczo tworzą podmotywy, których nie można przewidzieć za pomocą prostej "reguły większości" lub nawet modeli konsensusu opartych na HMM, a wynikiem może być biologicznie nieprawidłowy "konsensus", który nie tylko nigdy nie występuje w naturze, ale jest mniej żywotny niż jakiekolwiek istniejące białko. Opracowaliśmy narzędzie do analizy wizualnej, StickWRLD, które tworzy interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek i wyraźnie wyświetla współbieżne reszty. Użytkownik ma możliwość przesuwania i powiększania, a także dynamicznej zmiany progu statystycznego leżącego u podstaw identyfikacji kowariantów. StickWRLD był wcześniej z powodzeniem stosowany do identyfikacji funkcjonalnie wymaganych kozmiennych reszt w białkach, takich jak kinaza adenylanowa, oraz w sekwencjach DNA, takich jak miejsca docelowe endonukleazy.

Wprowadzenie

Dopasowania białek od dawna są używane do oceny podobieństwa reszt w rodzinie białek. Często najciekawsze cechy białka (np. katalityczne lub inne miejsca wiązania) są wynikiem fałdowania białek, które stykają się z dystalnymi regionami sekwencji liniowej, w wyniku czego te pozornie niepowiązane regiony w dopasowaniu mają tendencję do ewolucji i zmian w skoordynowany sposób. W innych przypadkach funkcja białka może być zależna od jego sygnatury elektrostatycznej, a mutacje, które wpływają na dipol elektronowy, są kompensowane przez zmiany odległych naładowanych reszt. Efekty allosteryczne mogą również indukować długodystansowe zależności sekwencyjne i przestrzenne między tożsamościami pozostałości. Niezależnie od ich pochodzenia, te funkcjonalnie wymagane współzmienności reszt - zależności międzypozycyjne (IPD) - mogą nie być oczywiste przy wizualnym badaniu wyrównania (Rysunek 1). Identyfikacja IChP - jak również tego, które określone reszty w tych pozycjach mają tendencję do współzmienności jako jednostka - może dostarczyć ważnych wskazówek na temat procesów fałdowania białek i tworzenia miejsc funkcjonalnych. Informacje te można następnie wykorzystać do optymalizacji białek syntetycznych (inżynieryjnych) pod względem termostabilności i aktywności. Od dawna wiadomo, że nie wszystkie mutacje punktowe w kierunku konsensusu zapewniają lepszą stabilność lub aktywność. Ostatnio wykazano, że białka zaprojektowane tak, aby wykorzystywać znane IChP w swojej sekwencji, powodują większą aktywność niż to samo białko zaprojektowane wyłącznie na podstawie konsensusu^1,2 (manuskrypt w przygotowaniu), podobnie jak w przypadku idei stabilizacji mutacji punktowych³.

Niestety, tradycyjne modele budowania konsensusu (np. zasada większości) przechwytują IPD tylko przez przypadek. Metody Consensus i Position Specific Scoring Matrix ignorują IPD i tylko "poprawnie" uwzględniają je w modelach, podczas gdy reszty zależne są również najpopularniejszymi pozostałościami dla tych pozycji w rodzinie. Modele łańcucha Markowa mogą przechwytywać IPD, gdy są one sekwencyjnie proksymalne, ale ich typowa implementacja ignoruje wszystko poza bezpośrednimi sekwencyjnymi sąsiadami, a nawet w najlepszym przypadku obliczenia ukrytego modelu Markowa (patrz rysunek 2) stają się nierozwiązywalne, gdy zależności są oddzielone w sekwencji o więcej niż kilkanaście pozycji⁴. Ponieważ te IPD zasadniczo tworzą "podmotywy", których nie można przewidzieć za pomocą prostej "reguły większości" lub nawet modeli konsensusu opartych na^HMM5,6, wynikiem może być biologicznie nieprawidłowy "konsensus", który nie tylko nigdy nie występuje w naturze, ale jest mniej żywotny niż jakiekolwiek istniejące białko. Systemy oparte na polach losowych Markowa, takie jak GREMLIN⁷, próbują przezwyciężyć te problemy. Ponadto, podczas gdy zaawansowane techniki biologiczne/biochemiczne, takie jak nieciągła rekombinacja^3,8, mogą być stosowane do identyfikacji niezbędnych elementów białkowych według regionów, wymagają one znacznego czasu i pracy laboratoryjnej, aby można było osiągnąć precyzję pojedynczej pary zasad.

StickWRLD⁹ to program oparty na Pythonie, który tworzy interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek, dzięki czemu IPD są jasne i łatwe do zrozumienia. Każda pozycja w wyrównaniu jest reprezentowana jako kolumna na wyświetlaczu, gdzie każda kolumna składa się ze stosu kulek, po jednej dla każdego z 20 aminokwasów, które mogą być obecne w tej pozycji w wyrównaniu. Rozmiar kuli zależy od częstotliwości występowania aminokwasu, tak że użytkownik może natychmiast zebrać resztę konsensusu lub względny rozkład aminokwasów w tej pozycji, po prostu patrząc na rozmiar kulek. Kolumny reprezentujące każdą pozycję są zawijane wokół walca. Daje to każdej sferze reprezentującej możliwy aminokwas w każdej pozycji w wyrównaniu, wyraźną "linię wzroku" do każdej innej możliwości aminokwasu w każdej innej pozycji. Przed wizualizacją StickWRLD oblicza siłę korelacji między wszystkimi możliwymi kombinacjami pozostałości w celu identyfikacji IPD⁹. Aby przedstawić IPD, narysowane są linie między pozostałościami, które współewoluują w wyższym lub niższym tempie, niż można by się spodziewać, gdyby pozostałości obecne w tych pozycjach były niezależne (IPD).

Ta wizualizacja nie tylko pokazuje, które pozycje sekwencji oddziałują na siebie ewolucyjnie, ale ponieważ linie krawędziowe IPD są rysowane między sferami aminokwasów w każdej kolumnie, użytkownik może szybko określić, które konkretne aminokwasy mają tendencję do współewolucji w każdej pozycji. Użytkownik ma możliwość obracania i eksploracji wizualizowanej struktury IPD, a także dynamicznej zmiany progów statystycznych kontrolujących wyświetlanie korelacji, dzięki czemu StickWRLD jest potężnym narzędziem do wykrywania IPD.

Aplikacje takie jak GREMLIN⁷ podobnie wyświetlają złożone informacje relacyjne między pozostałościami - ale te relacje są obliczane za pomocą bardziej tradycyjnych modeli Markowa, które nie są zaprojektowane do określania jakichkolwiek relacji warunkowych. W związku z tym można je wyświetlać jako projekcje 2D. W przeciwieństwie do tego, StickWRLD może obliczać i wyświetlać wielowęzłowe zależności warunkowe, które mogą być zaciemnione, jeśli są renderowane jako wykres 2D (zjawisko znane jako okluzja krawędziowa).

Widok 3D StickWRLD ma również kilka innych zalet. Umożliwiając użytkownikom manipulowanie obrazem – przesuwanie, obracanie i powiększanie – funkcje, które mogą być zaciemnione lub nieintuicyjne w reprezentacji 2D, można łatwiej dostrzec w cylindrze 3D StickWRLD. StickWRLD jest zasadniczo narzędziem do analizy wizualnej, wykorzystującym moc zdolności ludzkiego mózgu do rozpoznawania wzorców w celu dostrzegania wzorców i trendów, a także zdolność do eksplorowania danych z różnych perspektyw.

Protokół

1. Pobieranie i instalacja oprogramowania

1. Użyj komputera z procesorem Intel i5 lub lepszym z co najmniej 4 GB pamięci RAM i systemem operacyjnym Mac OS X lub GNU/Linux (np. Ubuntu). Ponadto wymagane są biblioteki Pythona 2.7.6¹⁰ i wxPython 2.8¹¹, SciPy¹² i PyOpenGL¹³ Pythona — pobierz i zainstaluj każdą z nich z odpowiednich repozytoriów.
2. Pobierz StickWRLD jako archiwum zip zawierające wszystkie odpowiednie skrypty Pythona. Pobierz skrypt "fasta2stick.sh" do konwersji standardowych dopasowań sekwencji DNA/białka FASTA do formatu StickWRLD.
3. Rozpakuj archiwum i umieść wynikowy folder StickWRLD na pulpicie. Umieść również skrypt "fasta2stick.sh" na pulpicie.

2. Przygotuj wyrównanie

1. Utwórz wyrównanie sekwencji białek za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do wyrównywania (np. ClustalX¹⁴). Zapisz wyrównanie na pulpicie w formacie FASTA.
2. Otwórz aplikację terminala na komputerze Mac lub GNU/Linux i przejdź do pulpitu (lokalizacja skryptu powłoki "fasta2stick.sh"), wpisując cd ~/Desktop i naciskając Return. Wykonaj skrypt "fasta2stick.sh", wpisując ./fasta2stick.sh w terminalu. Jeśli skrypt nie zostanie wykonany, upewnij się, że jest on wykonywalny – w terminalu wpisz chmod +x fasta2stick.sh, aby skrypt był wykonywalny.
3. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w skrypcie, aby określić nazwę pliku wejściowego (plik utworzony w wersji 1.2 powyżej) i żądaną nazwę wyjściową. Zapisz plik wyjściowy (który jest teraz w formacie odpowiednim dla StickWRLD) na pulpicie.

3. Uruchamianie StickWRLD

1. Przejdź do folderu plików wykonywalnych StickWRLD za pomocą aplikacji terminalowej komputera Mac lub GNU/Linux. Na przykład, jeśli folder StickWRLD znajduje się na pulpicie, wpisz cd ~/Desktop/StickWRLD/exec w terminalu.
2. Uruchom StickWRLD, wpisując python-32 stickwrld_demo.py w terminalu.
3. Sprawdź, czy panel StickWRLD Data Loader jest widoczny na ekranie (Rysunek 3).

4. Wczytywanie danych

1. Załaduj przekonwertowane wyrównanie sekwencji białka, naciskając przycisk "Załaduj białko...".
2. Wybierz plik utworzony w kroku 3 powyżej i naciśnij "Otwórz". StickWRLD otworzy kilka nowych okien, w tym "StickWRLD Control" (Rysunek 4) i "StickWRLD - OpenGL" (Rysunek 5).
3. Wybierz okno "StickWRLD – OpenGL". Wybierz "Resetuj widok" z menu "OpenGL", aby wyświetlić domyślną wizualizację StickWRLD w widoku "z góry na dół" przez cylinder reprezentujący dane w oknach OpenGL o zmiennym rozmiarze.

5. Opcje widoku

1. Zaznacz pola "Etykiety kolumn" i "Etykiety kulek" w okienku "Sterowanie StickWRLD" (Rysunek 4), aby wyświetlić wartości kolumn i kulek.
2. Usuń zaznaczenie pola "Krawędzie kolumny" w panelu "Sterowanie StickWRLD", aby ukryć linie krawędzi kolumny.
3. Ustaw "Grubość kolumny" na 0,1 w panelu "Sterowanie StickWRLD", aby narysować cienką linię przez kolumny, co ułatwi nawigację po widoku 3D. Naciśnij Return, aby zaakceptować zmianę.
4. Zresetuj widok w oknie "StickWRLD – OpenGL" jak w kroku 5.3 powyżej, a następnie naciśnij przycisk "pełny ekran", aby zmaksymalizować widok.

6. Nawigacja

1. Obróć wyświetlacz 3D StickWRLD, przytrzymując lewy przycisk myszy podczas przesuwania myszy w dowolnym kierunku.
2. Powiększ ekran 3D StickWRLD, przytrzymując prawy przycisk myszy podczas przesuwania myszy w górę lub w dół.

7. Znajdowanie zależności interpozycyjnych (IPD)

1. Przeglądaj widok, przesuwając i powiększając zgodnie z opisem w kroku 6. Współewoluujące pozostałości przekraczające wymagania progowe zarówno p, jak i reszty są połączone liniami krawędziowymi, jak pokazano na rysunku 6. Jeśli jest zbyt wiele lub zbyt mało krawędzi łączących pozostałości, zmień próg resztkowy (w panelu "Kontrola StickWRLD"), aby wyświetlić mniej lub więcej krawędzi.
2. Zwiększ próg rezydualny w panelu sterowania StickWRLD, aż nie zostaną wyświetlone żadne linie krawędzi IPD, a następnie powoli zmniejszaj, aż pojawią się relacje. Kontynuuj zwiększanie reszty, aż uzyskasz wystarczającą liczbę relacji do zbadania.
3. Zidentyfikuj relacje, które obejmują albo reszty o znanym znaczeniu (np. w motywie lub miejscu wiązania/funkcjonalnego), albo pozostałości, które są dystalne względem siebie w obrębie wyrównania (co sugeruje, że są proksymalne w pofałdowanym białku)

8. Wybieranie i zapisywanie wyników

1. Za pomocą polecenia + kliknij lewym przyciskiem myszy dowolne krawędzie zainteresowania. Panel kontrolny StickWRLD wskaże kolumny i połączy określone pozostałości, np. "(124|G) (136|h)" (Rysunek 7). Linie ciągłe reprezentują pozytywne skojarzenia; Linie przerywane reprezentują negatywne skojarzenia.
2. Naciśnij przycisk "Output Edges" na panelu "StickWRLD Control", aby zapisać plik w formacie zwykłego tekstu (edge_residual.csv) wszystkich widocznych krawędzi, w tym połączonych pozostałości i ich rzeczywistych wartości resztkowych, w katalogu /StickWRLD/exec/.

Wyniki

Program StickWRLD był wcześniej wykorzystywany do wykrywania zależności międzypozycyjnych (IPDs) między resztami w dopasowaniach zarówno DNA³, jak i białek^15-17. Te współewoluujące reszty, choć często oddalone od siebie w dopasowaniu sekwencji, są zazwyczaj blisko siebie w sfałdowanym białku. StickWRLD umożliwia szybkie odkrywanie specyficznego dla reszt współwystępowania w takich miejscach, np., alanina w pozycji „x” jest silnie skorelowana z treoniną w pozycji „y”. Takie korelacje mogą wskazywać na możliwe do udowodnienia zależności strukturalne i zazwyczaj dotyczą miejsc, które z konieczności współewoluują. StickWRLD jest w stanie wykryć te zależności nawet wtedy, gdy bardziej „tradycyjne” podejścia wykorzystujące HMM do opisu motywów zawodzą. Na przykład analiza dopasowania PFAM domeny pokrywy ADK za pomocą StickWRLD ujawnia silną dodatnią korelację między cysteinami (C) w pozycjach 4 i 8 a skoordynowaną parą C w pozycjach 35 i 38. Jednocześnie StickWRLD wykazał podobną silną dodatnią zależność między histydyną (H) a seryną (S) w pozycjach 4 i 8, silną ujemną zależność między nimi a kwartetem C w pozycjach 4, 8, 35 i 38, oraz silną dodatnią zależność z kwasem asparaginowym (D) i treoniną (T) odpowiednio w pozycjach 35 i 38. Dodatkowe IPDs występują między motywem H,S,D,T a T i G w pozycjach **** 10 i 29 u b subtilis ****, co podkreśla warunkowy charakter tych IPDs – motyw tetracysteiny nie „zależy” od tożsamości reszt w tych dwóch pozycjach, podczas gdy hydrofilowa triada H,S,D,T wymaga w tych pozycjach konkretnych reszt niemal absolutnie. Te dwa całkowicie różne, zależne od pozycji motywy reszt mogą pełnić tę samą rolę w pokrywie ADK. Jak widać na Rysunku 6, na pierwszym planie widoczny jest duży klaster IPDs, w tym powiązanie 3 węzłów między G (glicyną) w pozycji 132, Y (tyrozyną) w pozycji 135 a P (proliną) w pozycji 141 (Rysunek 6A). Na Rysunku 6B widok został przesunięty tak, aby użytkownik znajdował się nieco powyżej cylindra, co ujawniło IPD między H (histydyną) w pozycji 136 a M (metioniną) w pozycji 29, oddalonymi o 107 reszt. Tymczasem motyw domeny pochodzący z PFAM HMM (Rysunek 2) nie tylko nie wykrywa ich jako specyficznie współwystępujących wariantów motywu, ale również definiuje ogólne grupowania według schematu niepopartego biologicznie¹⁶.

Rysunek 1. Reprezentacja typu „mapa metra” struktury domeny Lid kinazy adenozyny (ADK) z B. subtilis. Strzałki wskazują IPD zidentyfikowane przez StickWRLD w dopasowaniu PFAM domeny Lid ADK. StickWRLD jest w stanie prawidłowo zidentyfikować IPD w obrębie klastra reszt, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie w sfałdowanym białku. Szczególne zainteresowanie budzi para T i G w pozycjach 9 i 29, która tworzy IPD tylko wtedy, gdy tetrada reszt w pozycjach 4, 7, 24 i 27 nie jest C,C,C,C). Wyświetlone numery reszt reprezentują pozycje w B. subtilis, a nie pozycje w dopasowaniu PFAM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Logo sekwencji ukrytego modelu Markowa (HMM) Skylign¹⁸ dla domeny pokrywy ADK. Chociaż modele HMM są potężnymi narzędziami do wyznaczania prawdopodobieństw w każdej pozycji, a także wkładu każdego miejsca w ogólny model, niezależność pozycyjna HMM sprawia, że nie nadają się one do wykrywania IPD. Model ten nie wskazuje żadnej z zależności zaobserwowanych w reprezentacjach StickWRLD (Rysunek 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Ładowarka danych StickWRLD. Użytkownicy mogą wybrać istniejące dane demonstracyjne lub wczytać własne dane w formie dopasowań sekwencji DNA lub białek.

Rycina 4. Okno sterowania StickWRLD. Panel sterowania umożliwia użytkownikowi zmianę różnych właściwości widoku, a także regulację progów kontrolujących wyświetlanie linii krawędzi wskazujących relacje między resztami (IPDs). Czerwonym kółkiem zaznaczono wartości domyślne, które zazwyczaj wymagają dostosowania dla najlepszego podglądu dowolnego zestawu danych. Wartość Residual ustawia próg (obserwowane-oczekiwane), dla którego rysowane są linie łączące/asocjacyjne. Sterowniki etykiet Column i Ball kontrolują, czy wyświetlana jest pozycja kolumny oraz wartości reszt (np. „A” dla argininy). Sterownik Column Edge Line włącza i wyłącza wyświetlanie linii krawędzi łączących kolumny – w przypadku gęstych zestawów danych lepiej jest go wyłączyć. Column Thickness kontroluje, czy sama kolumna jest wyświetlana – ustawienie tej wartości na bardzo małą (np. 0.1) narysuje linię przechodzącą przez sfery w kolumnie, co ułatwia odróżnienie kolumn od siebie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 5. Widok początkowy okna StickWRLD OpenGL z załadowanym zestawem danych białka domeny pokrywy kinazy adenylanowej. Początkowa perspektywa ukazuje widok „z góry” przez cylinder składający się z pozycji dopasowania sekwencji. Użytkownik może obracać cylinder, przeciągając lewym przyciskiem myszy, oraz przybliżać i oddalać widok, przeciągając prawym przyciskiem myszy. Widok początkowy jest dość gęsty, ponieważ domyślne ustawienie wyświetla nawet niewielkie wskaźniki koewolucji. Dla wielu białek przy tych ustawieniach można wykryć wyraźne moduły, jednak nawet w białkach o gęstej koewolucji widok można szybko i interaktywnie uprościć za pomocą interfejsu StickWRLD, aby zidentyfikować najważniejsze IPD. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 6. Powiększony widok wizualizacji StickWRLD białka domeny pokrywy kinazy adenylanowej. Tutaj zmieniono domyślną wartość Residual na 0,2. Zwiększa to próg wyświetlania krawędzi międzyresztkowych, co skutkuje pokazaniem mniejszej liczby krawędzi. Pozostałe krawędzie wskazują silnie powiązane IPD. Dodatkowo widok został obrócony i przybliżony, aby ułatwić obserwację krawędzi. (A) Na pierwszym planie widoczny jest duży klaster IPD, obejmujący powiązanie trzech węzłów między G (glicyną) w pozycji 132, Y (tyrozyną) w pozycji 135 i P (proliną) w pozycji 141. (B) Perspektywę przesunięto tak, aby użytkownik znajdował się nieco powyżej cylindra, co ujawnia IPD między H (histydyną) w pozycji 136 a M (metioniną) w pozycji 29, oddalonymi od siebie o 107 reszt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7. Widok informacji w prawym dolnym rogu okna sterowania StickWRLD. Kliknięcie lewym przyciskiem myszy z wciśniętym klawiszem CTRL na obiekcie (np. sferze lub krawędzi) w oknie OpenGL wyświetla informacje o tym obiekcie w prawym dolnym rogu okna sterowania StickWLRD. Tutaj widoczne są informacje dla krawędzi IPD pomiędzy metioniną w pozycji 29 a histydyną w pozycji 136.

Dyskusja

StickWRLD został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji takich IPD w domenie¹⁶ kinazy adenylanowej, a także powiązanych zasad DNA w terminatorach zależnych od rho⁹ oraz nowej specyficzności splicingowej w miejscach docelowych endonukleazy intronowej⁶ archeonów tRNA. Te IPD nie były wykrywalne poprzez bezpośrednie badanie wyrównania.

StickWRLD wyświetla każdą pozycję wyrównania jako kolumnę 20 "kul", gdzie każda kula reprezentuje jedną z 20 reszt aminokwasowych, a rozmiar kuli wskazuje częstotliwość występowania tej konkretnej reszty w tej kolumnie (rysunek 4). Kolumny są ułożone w walcu, z liniami krawędzi łączącymi pozostałości w różnych kolumnach (wskazującymi na IPD). Te linie graniczne są rysowane tylko wtedy, gdy odpowiadające im reszty współzmieniają się z częstotliwością przekraczającą zarówno wartość p (istotność), jak i resztki (oczekiwane - obserwowane) progi.

Wykrywanie współwystępujących współzależnych reszt lub IPD w dystalnych regionach wyrównania sekwencji DNA lub białka jest trudne przy użyciu standardowych narzędzi do dopasowywania sekwencji⁶. Podczas gdy takie narzędzia generują konsensus lub sekwencję motywów, konsensus ten jest w wielu przypadkach zwykłym uśrednianiem reguły większości i nie przekazuje relacji współzmienności, które mogą tworzyć jeden lub więcej podmotywów – grup reszt, które mają tendencję do współewolucji. Nawet modele HMM, które są w stanie wykryć sąsiednie zależności, nie są w stanie dokładnie modelować motywów sekwencji za pomocą dystalnych IPD⁵. Rezultat jest taki, że obliczony konsensus może być w rzeczywistości "syntetyczną" sekwencją, której nie ma w naturze – a zmodyfikowane białka oparte na takim konsensusie obliczeniowym mogą w rzeczywistości nie być optymalne. W rzeczywistości Pfam HMM dla ADK sugerowałby, że chimeryczne białko zawierające połowę motywu tetracysteiny i połowę motywu H,S,D,T, jest funkcjonalnie tak samo akceptowalne, jak każdy faktycznie istniejący ADK. Tak nie jest, ponieważ takie chimery (i wiele innych mieszanek tych motywów) są katalitycznie martwe^4,19.

Szukając korelacji, bardzo ważne jest, aby próg resztkowy został dostosowany tak, aby umożliwić wykrycie odpowiednich korelacji poprzez ustawienie progu powyżej poziomu, przy którym widoczne są wszelkie krawędzie, a następnie stopniowe zmniejszanie progu. Gwarantuje to, że początkowo brane są pod uwagę tylko najważniejsze krawędzie.

Alternatywnym podejściem jest rozpoczęcie od bardzo niskiego progu rezydualnego. Powoduje to wyświetlenie wszystkich istotnych krawędzi. Od tego momentu próg resztkowy może być powoli zwiększany, co pozwala na wypadanie krawędzi, aż pojawią się wzory. Chociaż takie podejście jest mniej przydatne, gdy szuka się włączenia określonych węzłów (np. zastosowanie wiedzy o domenie), pozwala na odkrywanie nieoczekiwanych relacji za pomocą StickWRLD jako wizualnego narzędzia analitycznego do odkrywania pojawiających się wzorców w wizualizacji danych.

StickWRLD jest ograniczony przede wszystkim dostępną pamięcią systemu, na którym jest uruchomiony, a także rozdzielczością urządzenia wyświetlającego. Chociaż nie ma teoretycznego limitu liczby punktów danych, które StickWRLD może zbadać, a sekwencje do 20 000 pozycji zostały przetestowane, w praktyce StickWRLD działa najlepiej z sekwencjami do około 1 000 pozycji.

Podstawową zaletą StickWRLD jest jego zdolność do identyfikowania grup pozostałości, które są ze sobą zgodne. Jest to znacząca przewaga nad tradycyjnym podejściem do statystycznej sekwencji konsensusu, która jest prostym uśrednianiem statystycznym i nie uwzględnia koewolucji. Podczas gdy w niektórych przypadkach współzmienne reszty mogą być po prostu artefaktem filogenezy, nawet te reszty przetrwały "test selekcji" i jako takie jest mało prawdopodobne, aby umniejszały funkcjonalność jakiegokolwiek białka zmodyfikowanego tak, aby je zawierało.

Chociaż użycie StickWRLD do identyfikacji IPD w kanonicznym konsensusie/motywie sekwencji DNA lub białka przed inżynierią syntetycznych wariantów zmniejszy ryzyko błędu i wesprze szybką optymalizację funkcji, należy zauważyć, że StickWRLD może być używany jako uogólnione narzędzie do identyfikacji korelacji i nie ogranicza się wyłącznie do danych dotyczących białek. StickWRLD może być używany do wizualnego odkrywania współwystępowania dowolnych zmiennych w dowolnym prawidłowo zakodowanym zestawie danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komputer Mac lub Ubuntu OS	Różne		Dowolny komputer Mac lub GNU/Linux (np. Ubuntu) zdolny do uruchamiania Pythona i powiązanych skryptów powłoki
Język programowania Python	python.org		Python w wersji 2.7.6 lub nowszej Zalecana
biblioteka wxPython	wxpython.org		Najnowsza wersja zalecana
biblioteka	SciPy		Zalecana najnowsza wersja
Biblioteka PyOpenGL	pyopengl.sourceforge.net		Zalecana najnowsza wersja
StickWRLD Skrypty Pythona	NCH BCCM		Dostępne pod adresem http://www.stickwrld.org
fasta2stick.sh konwerter plików	NCH BCCM		Dostępne pod adresem http://www.stickwrld.org
Dane sekwencji			Próbki dostępne pod adresem http://www.stickwrld.org

scipy.org białek i/lub DNA