Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośredni model kostnienia heterotopowego urazu/oparzenia myszy

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52880

⸱

6 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry

W tym artykule

Podsumowanie

Model heterotopowego kostnienia tenotomii Achillesa i oparzeń pozwala na wiarygodne badanie ektopowego formowania się kości wywołanego urazem bez stosowania czynników egzogennych.

Streszczenie

Kostnienie heterotopowe (HO) to tworzenie się kości poza szkieletem, która powstaje po poważnych urazach, oparzeniach i ortopedycznych zabiegach chirurgicznych. Większość modeli zwierzęcych wykorzystywanych do badania HO opiera się na zastosowaniu substancji egzogennych, takich jak białko morfogenetyczne kości (BMP), egzogenne konstrukty komórkowe lub mutacje genetyczne w sygnalizacji BMP. Chociaż modele te są przydatne, nie odtwarzają dokładnie stanów zapalnych, które powodują większość przypadków HO. W tym miejscu opisujemy model oparzenia/tenotomii u myszy, który niezawodnie wytwarza skoncentrowane HO. Protokół ten polega na wytworzeniu 30% całkowitej powierzchni ciała, częściowej grubości oparzenia kontaktowego na skórze grzbietowej, a także podziale ścięgna Achillesa w jego punkcie środkowym. Opieranie się wyłącznie na urazie urazowym w celu wywołania HO w przewidywalnym miejscu pozwala na badanie w czasie endochrzęstnego heterotopowego tworzenia kości wyłącznie na podstawie wewnętrznych procesów fizjologicznych i środowiska. Metoda ta może okazać się pomocna w zrozumieniu szlaków zapalnych i osteogennych zaangażowanych w HO wywołane urazem. Ponadto, ponieważ HO rozwija się w tym modelu w przewidywalnym miejscu i czasie, pozwala to na badania mające na celu ulepszenie wczesnych strategii obrazowania i metod leczenia w celu zapobiegania powstawaniu HO.

Wprowadzenie

Kostnienie heterotopowe (HO) to tworzenie się kości ektopowej, w której komórki osteo-silne są nieprawidłowo indukowane, tworząc kość śródchrzęstną poza szkieletem. Chociaż szczegóły szlaku tworzenia HO są nadal w dużej mierze nieznane, przyjęty paradygmat obejmuje trzy kluczowe czynniki: incydent wywołujący stan zapalny, permisywną niszę i mezenchymalne komórki macierzyste zdolne do tworzenia kości. 1-3 HO jest powszechną chorobą współistniejącą, która komplikuje ponad 60% poważnych oparzeń, 65% urazów związanych z walką i 10% przypadków inwazyjnych operacji ortopedycznych. 4,5 Jednak często trudno jest przewidzieć, gdzie HO się uformuje, ponieważ może wystąpić w miejscach lokalnego uszkodzenia lub w odległych miejscach, które w przeciwnym razie mogą być nieuszkodzone. Ta zmienność lokalizacji utrudnia profilaktyczną interwencję w celu zapobieżenia reaktywnemu tworzeniu się kości w sposób miejscowo ukierunkowany. Istnieją również wrodzone formy HO, takie jak fibrodysplazja kostna (FOP), w której pacjenci są podatni na rozwój silnego HO w odpowiedzi na niewielki uraz lub uraz zapalny. Potężne modele zwierzęce wykorzystujące myszy transgeniczne odtworzyły ten fenotyp i dostarczyły informacji na temat szlaków molekularnych, które mogą być również ważne w HO wywołanym traumą.6-9 W badaniach translacyjnych nad patogenezą niewrodzonego HO wykorzystano szeroką gamę konstruktów, od samego urazu po implantację egzogennych materiałów i/lub komórek osteoindukcyjnych. 10-13

W naszej poprzedniej pracy sprawdziliśmy prosty i niezawodny model powstawania HO u myszy, który nie wymaga podawania żadnego materiału egzogennego. 14-17 Model ten stworzył dwa kluczowe warunki do zainicjowania HO: miejscowy uraz i globalny stan zapalny. Udało się to osiągnąć dzięki zastosowaniu tenotomii Achillesa (uraz miejscowy) połączonej z odległym oparzeniem (stan zapalny globalny). Myszy otrzymywały oba zabiegi jednocześnie i stwierdzono, że rozwijają się solidna ilość HO, którą można analizować za pomocą środków histologicznych, radiologicznych i molekularnych. Co ciekawe, równoczesne oparzenia znacznie zwiększyły ilość powstającego HO i przyspieszyły jego przebieg rozwoju w czasie. 14-16 HO rozwinął się w przewidywalnych miejscach wokół kości piętowej, stawu skokowego i kości piszczelowej/strzałkowej kończyny, która otrzymała tenotomię. Wiarygodność rozwoju HO w znanej lokalizacji pozwoliła na ukierunkowane badanie cech molekularnych i histologicznych we wczesnych stadiach kostnienia ektopowego. 14,17 Do tej pory u 100% myszy (ponad 50 zwierząt) z tenotomią i współistniejącymi oparzeniami rozwinęło się HO. Dodatkowo przeprowadzono podłużne obrazowanie 2D i 3D oraz analizę spektroskopową w celu zbadania wzorca wzrostu i składu biochemicznego HO.15,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z dobrymi praktykami na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku po Użytkowaniu i Opiece nad Zwierzętami Laboratoryjnymi: Wydanie Ósme Instytutu Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (ILAR, 2011) i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan (PRO0001553).

1. Zabiegi chirurgiczne na myszach

UWAGA: Użyj 8-10 tygodniowych myszy C57BL/6. Inne grupy wiekowe, pochodzenie i szczepy myszy mogą być również wykorzystywane do testowania różnych warunków lub składu genetycznego. W przypadku części procedury dotyczącej tenotomii utrzymuj sterylne warunki, używając maski na twarz, czepka do włosów i sterylnego fartuchu, rękawiczek i narzędzi. Miejsca operacyjne powinny być sterylnie przygotowane z powidonem i sterylnym obłożeniem. Unikaj hipotermii, używając weterynaryjnej poduszki grzewczej i roztworów do resuscytacji podgrzewających do 37 °C przed podaniem.

  1. Znieczulij mysz za pomocą 2,5% wziewnego izofluranu. Użyj stożka nosowego, aby zapewnić łatwy dostęp do grzbietu i kończyn tylnych. Dostosuj szybkość podawania izofluranu, aby utrzymać odpowiednią częstość oddechów i zabarwienie błon śluzowych oraz zapewnić znieczulenie, sprawdzając napięcie mięśniowe, szczypanie palców u nóg i odruch rogówki. Nałóż mdłą maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniom suchego oka podczas zabiegu. Utrzymuj odpowiednią temperaturę ciała za pomocą weterynaryjnej poduszki grzewczej lub cyrkulatora ciepłej wody pod polem operacyjnym.
  2. Buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg mc. podaje się podskórnie bezpośrednio przed zabiegiem chirurgicznym w celu znieczulenia.
  3. Dokładnie ogol miejsce operacji na lewej tylnej łapie za pomocą maszynki do strzyżenia od pięty do kolana.
  4. Dokładnie ogol grzbiet myszy, zaczynając od kręgosłupa i rozciągając ogolony obszar na lewo od grzbietowej linii środkowej, oczyszczając obszar o wymiarach co najmniej 2 cm x 3 cm, aby pomieścić oparzenie.
  5. Przygotuj miejsce operacji, w tym tylną łapę do kolana, używając 3 naprzemiennych peelingów powidonowo-jodowych.
  6. Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż przyśrodkowej części lewego ścięgna Achillesa. Przedłuż nacięcie, aby można było łatwo uwidocznić ścięgno Achillesa; około 0,5 cm.
  7. Wykonaj tenotomię Achillesa z ostrym rozcięciem ścięgna w punkcie środkowym za pomocą ostrych nożyczek do tkanek. Włóż jedno ostrze nożyczek do tkanek w płaszczyznę tkanki pod ścięgnem i przeprowadź sekcję wzdłuż płaszczyzny, aż ostrze znajdzie się w środku ścięgna. Zamknij ostrza nożyczek, aby ostro przeciąć ścięgno.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie ścięgna tylne, w tym ścięgna mięśnia brzuchatego łydki, płaszczkowatego i podeszwowego.
  8. Osiągnij hemostazę, uciskając sterylną gazą (krwawienie powinno być minimalne) i zamknij nacięcie skóry szwem vicryl 5-0.
  9. Wykonać oparzenie częściowej grubości grzbietowej za pomocą aluminiowego bloku o wadze 35 g o przybliżonych wymiarach 2 cm x 2 cm x 3 cm podgrzanego do 60 °C w łaźni wodnej nałożonej na ogolony grzbiet myszy przez 17 sek.
    UWAGA: Osiągnij odpowiednią głębokość spalania, opierając blok na znieczulonej myszy, upewniając się, że cała powierzchnia bloku styka się z myszą, jednak unikaj wywierania dodatkowego nacisku na blok, tj. pozwól, aby grawitacja była jedyną siłą utrzymującą blok w miejscu. Cienki plastikowy uchwyt przymocowany po jednej stronie bloku jest wygodny do manipulacji, stabilizacji i wyjmowania z gorącej kąpieli wodnej. Spowoduje to około 30% całkowitego oparzenia powierzchni ciała w 8-10-tygodniowej myszy C57BL/6. To oparzenie kontaktowe zostało wybrane zamiast innych metod (oparzenie płomieniem lub oparzeniem) ze względu na równomierność głębokości oparzenia na ranie i powtarzalność między zwierzętami.
  10. Osusz miejsce oparzenia gazą i nałóż opatrunek tegaderm.
  11. Podawać podgrzane płyny resuscytacyjne: Lleczany roztwór Ringera 1 ml iniekcja dootrzewnowa i 0,5 ml iniekcja podskórna. To jednorazowe przeprowadzenie resuscytacji jest wystarczające do powrotu do zdrowia po oparzeniu i tenotomii.
    UWAGA: Nie należy wracać znieczulonych myszy do klatek z innymi myszami, trzymać je pojedynczo w czystych klatkach pod monitorowaniem, dopóki myszy nie zostaną w pełni wyleczone. Typowa rekonwalescencja następuje w ciągu 1-6 godzin. Miejsca oparzeń zazwyczaj goją się w ciągu 2-4 tygodni i rzadko są powikłane infekcją rany, jeśli są przechowywane w czystych pomieszczeniach mieszkalnych.
  12. Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,1 mg/kg we wstrzyknięciu podskórnym co 12 godzin przez 3 dni po zabiegu. Monitoruj wzrost HO za pomocą seryjnych skanów μCT w odpowiednich odstępach czasu. Ektopowy wzrost kości jest po raz pierwszy widoczny około 3 tygodnie po operacji przez μCT.
    UWAGA: Większość prac nad HO jest gotowa do 9 tygodni po operacji. Nie zaobserwowaliśmy różnicy w objętości lub lokalizacji HO przy powtarzanych skanach μCT co dwa tygodnie przez 15 tygodni w porównaniu z pojedynczym końcowym skanem μCT po 15 tygodniach. Pod koniec eksperymentów należy poddać eutanazji wszystkie myszy z wdychaniem CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zweryfikować śmierć z zwichnięciem szyjki macicy po 10 minutach.

2. Akwizycja i analiza μCT

  1. Zamocuj znieczuloną mysz na łóżku skanera w pozycji leżącej. Przyklej tylne kończyny bezpiecznie do łóżka, aby zapobiec artefaktowi ruchu oddechowego. Uwzględnij powietrze, wodę i fantom zawierający hydroksyapatyt pod myszą w celu kalibracji obrazu.
  2. Otwórz oprogramowanie do analizy kości i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje obie kończyny tylne od stawu biodrowego proksymalnie do dystalnie czubka tylnej łapy. Uzyskaj obraz przy użyciu następujących parametrów: 80 kV, 500 μA i ekspozycja 1 300 ms, rozmiar woksela 48 μm. 14,15
  3. Skalibruj obraz do jednostek Hounsfielda (HU), rysując zwrot z inwestycji w każdej z trzech komór fantomowych i wprowadzając średnią gęstość do odpowiednich pól w oprogramowaniu.
  4. Korzystając z narzędzia "grabber" w oprogramowaniu, zmień orientację obrazu tak, aby kość piszczelowa lewej kończyny tylnej była równoległa wzdłuż osi Z, aby umożliwić najwyraźniejszy widok anatomiczny dla nakreślenia ortotopowych struktur kostnych kory i HO.
  5. Zaczynając od kolana, przewijaj dystalnie przez wycinki obrazu, aż napotkasz HO. Korzystając z ręcznego narzędzia do splinezwania, wykonaj ROI wokół kości ektopowej na co 5plasterku, kontynuując dystalnie przez łapę lub do momentu przekroczenia HO. Użyj narzędzia do ekstrapolacji, aby rozszerzyć i zszyć ROI w jeden ROI, który zawiera wszystkie HO.
  6. Dokonaj zwrotu z inwestycji w 3D i wybierz menu analizy. Oblicz objętość kości, ustawiając dolną i górną wartość progową, która najlepiej pokazuje okno kości. Użyj tych samych stałych wartości progowych dla wszystkich skanowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu opisano protokół dla wcześniej opublikowanego modelu mysiego kostnienia heterotopicznego (HO) indukowanego urazem/oparzeniem.14-17 Procedura ta polega na jednoczesnym wywołaniu miejscowego urazu układu mięśniowo-szkieletowego poprzez tenotomię ścięgna Achillesa oraz ogólnoustrojowego stanu zapalnego poprzez oparzenie o częściowej grubości skóry. Prowadzi to do powtarzalnego tworzenia się kości reaktywnej w miejscu tenotomii, co można monitorować za pomocą seryjnych obrazowań. Do tej pory u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kostnienie heterotopowe stanowi poważne upośledzenie funkcjonalne, z którym borykają się pacjenci, którzy doznali urazów, oparzeń i inwazyjnych zabiegów mięśniowo-szkieletowych. Najbardziej zagrożoną populacją są żołnierze biorący udział we współczesnych konfliktach, którzy odnieśli poważne obrażenia od wybuchu w wyniku użycia improwizowanych urządzeń wybuchowych (IED). 18 Ulepszone kamizelki kuloodporne i jednostki medyczne ustawione z przodu pozwalają na lepsze przeżywanie poważnych urazów kończyn. Po wst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Dziękujemy Amandzie Fair, CMI, oraz Kathy Sweet i ORL na UM za pomoc w obrazowaniu i analizie μCT. Finansowanie: BL ufundowane przez 1K08GM109105-01 i Plastic Surgery Foundation National Endowment Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/6 myszyJackson Laboratory6648-10 tygodniowy
izofluran – FlurisoVET one, Boise, IDV1 501017
Buprenorfina – BuprenexReckitt Benckiser HealthcareNDC 12496-0757-10,3 mg/ml roztwór
BetadineOwens and Minor, Mechanicsville, VA2047PVP202
5-0 Nici VicrylEthicon, Summerville, NJJ493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm3M1624WPrzeciąć na pół, aby prawidłowo pokryć miejsce oparzenia
&mikro; CT - GE eXplore Locus SPGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londyn, ON, Kanada
Microview 2.2 Zaawansowana aplikacja do analizy kościGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londyn, ON, Kanada

Bibliografia

  1. Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
  2. Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
  3. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  4. Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
  5. Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
  6. Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
  7. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  8. Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
  9. Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
  10. Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
  11. Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
  12. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  13. Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
  14. Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).
  15. Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
  16. Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
  17. Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  18. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
  19. Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
  20. Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
  21. Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeci cie ci gna Achillesaoparzenie o cz ciowej grubo cimysi model urazuobrazowanie mikro tomograficzne micro CTektopowe kostnienieurazowo indukowana osteogeneza heterotopowa HOmodel oparzeniabadanie przebiegu czasowegotestowanie terapeutyczne
Bezpośredni model kostnienia heterotopowego urazu/oparzenia myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.