Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Podsumowanie

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Streszczenie

Główną przeszkodą w zrozumieniu, w jaki sposób tkanka nabłonkowa wykonuje naprawę rany, jest ograniczona dostępność modeli, w których można śledzić i manipulować reakcją rany ex vivo w środowisku, które ściśle naśladuje uszkodzenie tkanki nabłonkowej in vivo. Ten problem rozwiązano przez utworzenie klinicznie istotnego modelu naprawy uszkodzeń nabłonka ex vivo na podstawie operacji zaćmy. W tym modelu hodowli reakcję nabłonka soczewki na zranienie można śledzić na żywo w natywnym mikrośrodowisku komórek, a molekularnymi mediatorami gojenia się ran można łatwo manipulować podczas procesu naprawy. Aby przygotować hodowle, soczewki są usuwane z oka i wykonuje się małe nacięcie w przedniej części soczewki, z którego usuwa się wewnętrzną masę komórek włókien soczewki. Ta procedura tworzy okrągłą ranę na tylnej torebce soczewki, grubej błonie podstawnej otaczającej soczewkę. Ten obszar rany, do którego przyczepiono komórki włókniste, znajduje się tuż obok ciągłej monowarstwy komórek nabłonka soczewki, która pozostaje połączona z torebką soczewki podczas zabiegu chirurgicznego. Uszkodzony nabłonek, typ komórki, z której pochodzą komórki włókniste podczas rozwoju, reaguje na uraz spowodowany usunięciem komórek włóknistych, przemieszczając się zbiorczo po obszarze rany, prowadzony przez populację bogatych w wimentynę komórek naprawczych, których mezenchymalne komórki progenitorowe są endogenne w stosunku do soczewki¹. Właściwości te są typowe dla normalnej reakcji na gojenie się ran nabłonkowych. W tym modelu, podobnie jak in vivo, gojenie się ran jest zależne od sygnałów dostarczanych przez środowisko endogenne, które jest unikalnie utrzymywane w tym systemie hodowli ex vivo, co stanowi idealną okazję do odkrycia mechanizmów regulujących naprawę nabłonka po zranieniu.

Wprowadzenie

Klinicznie istotny, symulowany model leczenia ran nabłonkowych ex vivo opisany tutaj został opracowany, aby dostarczyć narzędzia do badania mechanizmów regulujących naprawę tkanek nabłonkowych w odpowiedzi na uraz. Kluczowe cechy, które miały na celu stworzenie tego modelu, obejmowały: 1) zapewnienie warunków, które ściśle odwzorowywały reakcję in vivo na zranienie w warunkach hodowli, 2) łatwość modulowania elementów regulacyjnych naprawy oraz 3) zdolność do obrazowania procesu naprawy w całości w czasie rzeczywistym. Wyzwanie polegało zatem na stworzeniu modelu hodowli, w którym możliwe było badanie i manipulowanie nabłonkowym gojeniem ran w natywnym mikrośrodowisku komórek. Dostępność tego modelu gojenia ran otwiera nowe możliwości identyfikacji endogennych sygnałów sygnalizacyjnych z białek macierzy, cytokin i chemokin, które regulują proces naprawy. Ponadto model jest idealny do zbadania, w jaki sposób nabłonek jest w stanie poruszać się jako arkusz zbiorowy w celu ponownego nabłonkowania obszaru rany ^2,3 oraz do określenia linii mezenchymalnych komórek liderowych na krawędzi rany, które działają w kierowaniu zbiorową migracją uszkodzonego nabłonka ⁴. Model ten stanowi również platformę, za pomocą której można zidentyfikować środki terapeutyczne, które mogą wspomagać skuteczne gojenie się ran i zapobiegać nieprawidłowemu gojeniu się ran⁵.

Istnieje już wiele dostępnych modeli gojenia ran, zarówno w hodowli, jak i in vivo, które dostarczyły większość tego, co obecnie wiadomo o procesie gojenia się ran. W modelach uszkodzeń zwierząt, takich jak rogówka ^6-12 i skóra^13-17, istnieje możliwość zbadania reakcji tkanki na zranienie w kontekście wszystkich mediatorów naprawy, które mogą być zaangażowane w ten proces, w tym wkładu układu naczyniowego i nerwowego. Istnieją jednak ograniczenia w manipulowaniu warunkami eksperymentalnymi in vivo i nie jest jeszcze możliwe prowadzenie badań obrazowych odpowiedzi naprawczej in vivo, w sposób ciągły w czasie. W przeciwieństwie do tego, większość modeli hodowli ran in vitro, takich jak rana po zadrapaniu, może być łatwo manipulowana i obserwowana w czasie, ale brakuje im kontekstu środowiskowego badania gojenia się ran w tkance in vivo. Podczas gdy modele ex vivo mają tę zaletę, że badają proces naprawy uszkodzeń w sposób ciągły w czasie w kontekście mikrośrodowiska komórek w połączeniu ze zdolnością do modulowania molekularnych regulatorów naprawy w dowolnym momencie procesu, istnieje niewiele modeli, które pasują do tych parametrów.

Tutaj opisana jest procedura generowania wysoce powtarzalnych kultur gojenia ran nabłonkowych ex vivo, które odtwarzają reakcję tkanki nabłonkowej na fizjologiczne zranienie. Wykorzystując soczewkę zarodka kurczątka jako źródło tkankowe, przeprowadza się pozorowaną operację zaćmy ex vivo. Soczewka jest idealną tkanką do wykorzystania w tych badaniach, ponieważ jest zamknięta w grubej torebce błony podstawnej, naczyniowa, nieunerwiona i wolna od jakiegokolwiek powiązanego zrębu^18,19. W chorobie człowieka operacja zaćmy ma na celu rozwiązanie problemu utraty wzroku spowodowanej zmętnieniem soczewki i polega na usunięciu masy komórek włókna soczewki, która stanowi większość soczewki. Po operacji zaćmy wzrok zostaje przywrócony poprzez wprowadzenie sztucznej soczewki wewnątrzgałkowej. Zabieg chirurgii zaćmy, poprzez usunięcie komórek włóknistych, wywołuje reakcję urazu w sąsiednim nabłonku soczewki, który reaguje ponownym nabłonkiem tylnej części torebki soczewki, która była zajęta przez komórki włókniste. W chirurgii zaćmy, podobnie jak w większości reakcji na gojenie się ran, czasami występuje nieprawidłowy wynik zwłóknienia reakcji gojenia się rany, związany z pojawieniem się miofibroblastów, co w soczewce jest znane jako zmętnienie tylnej torebki^20-22. Aby wygenerować model gojenia się ran po operacji zaćmy, procedura operacji zaćmy jest naśladowana w soczewkach usuniętych z oka zarodka zarodka pisklęcia w celu wywołania urazu fizjologicznego. Mikrochirurgiczne usunięcie komórek włókien soczewki skutkuje bardzo spójnym okrągłym obszarem rany otoczonym komórkami nabłonka soczewki. Ta populacja komórek pozostaje mocno przyczepiona do torebki błony podstawnej soczewki i ulega uszkodzeniu w wyniku zabiegu chirurgicznego. Komórki nabłonkowe migrują do ogołoconego obszaru endogennej błony podstawnej, aby zagoić ranę, prowadzone przez populację komórek mezenchymalnych bogatych w wimentynę, znanych w procesie naprawy jako komórki liderowe¹. Dzięki temu modelowi można łatwo zobrazować reakcję nabłonka na uraz i śledzić ją w czasie w kontekście mikrośrodowiska komórek. Komórki są łatwo dostępne dla modyfikacji ekspresji lub aktywacji cząsteczek, które mają odgrywać rolę w gojeniu się ran. Potężną cechą tego modelu jest zdolność do izolowania i badania zmian specyficznych dla migracji w ramach gojenia się ran. Kolejną zaletą tego modelu jest możliwość przygotowania do badań dużej liczby starych, dopasowanych kultur gojenia się ran ex vivo. W ten sposób ten modelowy system daje wyjątkową okazję do wyodrębnienia mechanizmów gojenia się ran i przetestowania leków pod kątem ich wpływu na proces gojenia się ran. Oczekuje się, że symulowany model operacji zaćmy ex vivo będzie miał szerokie zastosowanie, stanowiąc kluczowe źródło do badania mechanizmów naprawy urazów.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Thomasa Jeffersona oraz z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach nad widzeniem.

1. Ustawienie i przygotowanie soczewek do hodowli ran ex vivo

1. Umieść trzy szalki Petriego o średnicy 100 mm w sterylnym okapie z przepływem laminarnym. Napełnij dwie szalki Petriego do połowy buforem Tris/Dekstroza (bufor TD; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂PO₄, 5 mM D-glukozy, 8,25 mM zasady Tris, pH do 7,4 HCl) w temperaturze pokojowej, pozostawiając trzecią pustą. Wstępnie podgrzane podłoża hodowlane (pożywka 199 uzupełniona 1% L-glutaminą i 1% penicyliny/streptomycyny) do 37^oC.
   Uwaga: Standardowe podłoże hodowlane do gojenia ran nie zawiera surowicy, co ma miejsce in vivo; Jednak kultury gojące rany mogą być z powodzeniem hodowane w określonych warunkach, które obejmują surowicę lub inne czynniki.
2. Wyjmij z inkubatora płodne jajo embrionalne piskląt z dnia 15 (utrzymywane w temperaturze 37,7°C z delikatnym kołysaniem)
3. Umieść wybrane jajko w okapie z przepływem laminarnym i oczyść ze skorupy 70% etanolem z butelki do mycia. Wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu sterylnych roztworów i narzędzi.
4. Rozbij jajko i umieść jego zawartość na pustej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odetnij głowę zarodkowi za pomocą standardowych kleszczy i cienkich nożyczek. Umieścić głowę zarodka pisklęcia na szalce Petriego zawierającej bufor TD i odpowiednio usunąć pozostałą część zarodka. Opcjonalnie główki zarodków piskląt należy przechowywać w buforze TD przez krótki okres czasu, nie dłuższy niż 15 minut.
5. Umieść głowę zarodka pisklęcia na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnych kleszczy usuń soczewkę wraz z dołączonym ciałem szklistym z oka w następującej kolejności. Ściśnij tylną część oka kleszczami, aby utworzyć mały otwór w tylnej części oka.
6. Następnie chwyć ciało szkliste kleszczami i delikatnie pociągnij za ciało szkliste ruchem tocznym, ciało szkliste z przymocowaną soczewką zostanie usunięte z oka. Umieścić soczewkę/ciało szkliste na pozostałej szalce Petriego zawierającej bufor TD. Pozwól, aby soczewki pozostały w buforze TD nie dłużej niż 30 minut.
7. Przenieś soczewkę na nową pokrywę szalki Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą precyzyjnych kleszczyków ostrożnie zetrzyj wszelkie ciała rzęskowe (komórki barwnikowe), które zostały przemieszczone wraz z soczewką za pomocą krawędzi kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tkanki soczewki.
   Uwaga: Usunięcie ciała rzęskowego zapewnia, że typy komórek, które nie są endogenne w stosunku do soczewki, nie są włączane do hodowli gojącej rany.
8. Oddziel soczewkę od ciała szklistego za pomocą precyzyjnych kleszczy, ściskając ciało szkliste od jego związku z tylną torebką soczewki.
9. Za pomocą precyzyjnych kleszczyków przenieś soczewkę do małej kropli buforu TD (około 200 μl) w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm.

2. Przeprowadzanie pozorowanej operacji zaćmy

1. Ustaw soczewkę w kropli bufora TD w czaszy 35 mm przednią częścią soczewki skierowaną do góry.
   Uwaga: Przednia część soczewki jest łatwa do zidentyfikowania po obecności gęstego pierścienia w tkance, który wskazuje na granicę między przednim i równikowym obszarem nabłonka soczewki. W przeciwieństwie do tego, brak jest oznaczeń z tyłu torebki soczewki, do której przymocowane są komórki włókna soczewki.
2. Za pomocą dwóch precyzyjnych kleszczyków wykonaj małe nacięcie (około 850 μm) w środku przedniej torebki soczewki, grubej błony podstawnej otaczającej tkankę soczewki i związany z nią przedni nabłonek soczewki, chwytając tkankę jednym kleszczem w każdej ręce i delikatnie ciągnąc w przeciwnych kierunkach.
3. Usuń masę komórek włóknistych, która stanowi większość tkanki soczewki, usuwając ją z przyczepów do nabłonka soczewki i otaczającej torebki soczewki przez hydroelucję (podejście stosowane w klasycznej chirurgii zaćmy, modelowane na rycinie 1A).
4. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml końcówką igły o pojemności 27,5 g 300 μl buforu TD. Włóż końcówkę igły do nacięcia wykonanego w przedniej torebce soczewki i mniej więcej do połowy soczewki.
5. Delikatnie wciśnij strzykawkę wstrzykującą bufor TD do masy komórek włókna soczewki. Wstrzykiwać od 50 do 200 μl TD i nigdy więcej niż 300 μl. Obserwuj, jak masa komórek włóknistych rozluźnia się z nabłonka i torebki soczewki.
6. Za pomocą precyzyjnych kleszczy usuń rozluźnioną masę komórek włóknistych z soczewki przez przednie miejsce nacięcia.
   Uwaga: Ta procedura pozostawia torebkę błony podstawnej tylnej soczewki, do której przyłączono komórki włókniste, pozbawioną komórek, a uszkodzony nabłonek soczewki przylega do tego miejsca.

3. Przygotowanie zranionej soczewki do hodowli ex vivo

1. Spłaszcz torebkę torebki soczewki, która jest wynikiem operacji zaćmy opisanej powyżej, na naczyniu hodowlanym, komórką do góry, wykonując pięć nacięć w przedniej części torebki torebkowej.
2. Przeciąć prostopadle do pierwotnego miejsca nacięcia do równika soczewki. Spłaszcz powstałe pięć "płatków" kapsułki soczewki z dołączonym nabłonkiem na torebce z naczyniem hodowlanym stroną do dołu, komórką do góry. Zauważ, że uszkodzona soczewka ex vivo powinna teraz przybrać kształt gwiazdy lub kwiatu (patrz ryc. 1B).
3. Aby przymocować kapsułkę do naczynia, delikatnie dociśnij kleszczami w każdym punkcie gwiazdy. Spowoduje to małe wgłębienie na pięciu najbardziej zewnętrznych końcach eksplantatu i spowoduje trwałe przywiązanie do naczynia.
   Uwaga: Podczas tej procedury możliwe jest uszkodzenie kapsułki, dlatego ważne jest, aby przymocować kapsułkę do naczynia jak najbliżej końcówek klapek, a także wykonać jak najmniejszą liczbę punktów zabezpieczających (zwykle dwa, maksymalnie trzy na klapkę).
4. Wyjmij bufor TD z naczynia 35 mm i zastąp go 1.5 ml wstępnie podgrzanego podłoża. Przykryj naczynie o średnicy 35 mm pokrywką i umieść w inkubatorze (37°C, 5% CO₂ ).

4. Oddzielenie Centralnej Strefy Migracji (CMZ), gdzie następuje reepitelializacja uszkodzonego obszaru tylnej torebki, od Pierwotnej Strefy Przyczepu (OAZ) komórek nabłonka soczewki, w celu analizy ilościowej.

Uwaga: Komórki zaczynają natychmiast przemieszczać się do obszaru CMZ w odpowiedzi na uraz. Do pierwszego dnia w hodowli wystarczająca liczba komórek migruje przez CMZ do analizy molekularnej i biochemicznej, po oddzieleniu CMZ i OAZ przez mikropreparację²³. Protokół ten polega na usuwaniu jednego płata (OAZ) na raz z uszkodzonego obszaru kapsułki.

1. Obserwuj wyraźnie widoczne pod mikroskopem preparacyjnym rozgraniczenie między OAZ a CMZ (patrz rysunek 2A). Używając dwóch szczypiec o wysokiej precyzji, chwyć obiema kleszczami krawędź linii OAZ/CMZ, jeden tuż przylegający do drugiego, po obu stronach linii (patrz rysunek 2A, B, strzałka).
2. Używając jednej ręki/jednego kleszcza po stronie CMZ, kontynuuj trzymanie zranionej kultury, podczas gdy drugą ręką/kleszczami delikatnie przeciągnij OAZ wzdłuż linii OAZ/CMZ. CMZ łatwo oddziela się od OAZ wzdłuż tej linii. Kontynuuj wzdłuż tej linii wokół całej kultury, aż oba regiony zostaną całkowicie oddzielone.
3. Zbadaj oddzielone frakcje OAZ i CMZ do analizy molekularnej, takiej jak RNA-Seq ²⁴ lub analizy biochemicznej, takiej jak western blot lub koimmunoprecypitacja ^23,25.

Wyniki

Ex Vivo Model stworzony w celu badania procesu gojenia ran w rodzimym mikrośrodowisku komórek

Aby zbadać mechanizmy zaangażowane w regulację gojenia ran nabłonka w naturalnym mikrośrodowisku komórek, stworzono klinicznie istotny model symulowanej operacji zaćmy ex vivo. Model ten powstaje z tkanki soczewki, która oferuje wiele zalet dzięki swoim wewnętrznym właściwościom: 1) soczewka jest autonomicznym organem otoczonym grubą błoną podstawną zwaną torebką soczewki; 2) jest be...

Dyskusja

Opisano technikę przygotowania modelu hodowlanego gojenia się ran, która polega na wykonaniu operacji zaćmy ex vivo na soczewkach zarodków piskląt po ich usunięciu z oka. Nabłonek soczewki reaguje na to klinicznie istotne zranienie procesem naprawy, który ściśle naśladuje ten, który zachodzi in vivo, i ma wspólne cechy z gojeniem ran w innych tkankach nabłonkowych^2,4. Chociaż protokół jest prosty i prosty do przestrzegania, wykonanie pozorowanej operacji zaćmy za pomocą soczewek embrionalnych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Stosować przy 140 mM w buforze TD
Chlorek potasu (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Stosować przy 5 mM w buforze TD
Fosforan sodu (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Stosować przy 0,7 mM w buforze TD
D-glukoza (dekstroza)	Fisher Scientific	D16-500	Stosować przy 0,5 mM w TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Stosować przy 8,25 mM w TD Buffer
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-500	Stosować do pH buforu TD do 7,4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamina	Corning/CellGro	25-005-CI	Stosować w stężeniu 1% w Media199
Penicylina/streptomycyna	Corning/ CellGro	30-002-CI	Stosować przy 1% w Media199
Szalki Petriego 100 mm	Fisher Scientific	FB0875711Z
Jednostka filtrująca Stericup	Millipore	SCGPU01RE	Służy do filtracji sterylizacji
Kleszcze Media Dumont #5 (potrzebne 2)	Fine Science Tools	11251-20
Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip z precyzyjna igła ślizgowa	BD	309623
Drobne nożyczki	Fine Science Tools	14058-11
Standardowe kleszcze	Fine Science Tools	91100-12
Inne potrzebne przedmioty: Ogólne narzędzia preparacyjne,  płodne białe jaja kurze leghorn, sprawdź inkubator jaj (nawilżany, 37,7° C), okap z przepływem laminarnym, dwuokularowy stereowizyjny mikroskop

preparacyjny