Artykuł metodologiczny

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52893

⸱

24 września 2015

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Streszczenie

Ograniczenia rozdzielczości optycznej i wyzwanie związane z identyfikacją określonych populacji białek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej były przeszkodami w biologii komórki. Wielu zjawisk nie da się wyjaśnić za pomocą analizy in vitro w systemach uproszczonych i aby można je było w pełni zrozumieć, potrzebne są dodatkowe informacje strukturalne in situ, szczególnie w zakresie od 1 nm do 0,1 μm. W tym przypadku obrazowanie spektroskopowe elektronów, technika transmisyjnej mikroskopii elektronowej, która umożliwia jednoczesne mapowanie rozmieszczenia białek i kwasów nukleinowych, oraz znacznik ekspresji, miniSOG, są połączone w celu zbadania struktury i organizacji ognisk naprawy pęknięć dwuniciowych DNA.

Wprowadzenie

Pomimo znacznego postępu w mikroskopii świetlnej w ostatnich latach1, biolodzy komórkowi nadal cierpią z powodu luki w rozdzielczości. Ogranicza to zrozumienie zależności struktura-funkcja w podstawowych procesach komórkowych, które obejmują skoordynowane oddziaływanie między kompleksami makromolekularnymi (np. w przebudowie chromatyny, naprawie DNA, transkrypcji RNA i replikacji DNA). Chociaż transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) zapewniają wymaganą rozdzielczość, strukturalne zdefiniowanie tych procesów było wyzwaniem ze względu na niemożność znakowania określonych białek, a jednocześnie możliwość określenia składu biochemicznego wizualizowanych struktur. Ze względu na brak wewnętrznych błon pomagających w różnicowaniu struktur jądrowych, jądro było szczególnie trudne. Obrazowanie metodą spektroskopii elektronów (ESI) rozwiązuje niektóre z tych ograniczeń, umożliwiając jednoczesne wykrywanie i różnicowanie struktur jądrowych DNA, RNA i białek2-5.

Obrazowanie spektroskopowe elektronów:

Aby odwzorować rozkłady pierwiastków z wysoką czułością i rozdzielczością w mikroskopie elektronowym, można użyć spektrometru obrazowania, który wybiera elektrony, które zostały nieelastycznie rozproszone w wyniku oddziaływań z elektronami powłoki wewnętrznej pierwiastka w próbce6. Ponieważ specyficzne dla pierwiastka ilości energii są tracone w wyniku jonizacji atomów w próbce, elektrony te można oddzielić i uwidocznić za pomocą spektrometru, który jest dołączony do mikroskopu elektronowego. Tak więc analiza widma elektronów, które oddziaływały z próbką, ujawnia jakościowe i ilościowe informacje o składzie pierwiastkowym próbki7. Elektrony, które nie tracą energii podczas przechodzenia przez próbkę, znajdują się w "piku zerowej straty" widma strat energii elektronów. Obfitość tych elektronów jest związana z masą, gęstością i grubością próbki i składa się z elektronów, które przechodzą przez próbkę bez zderzenia z próbką lub utraty energii podczas przechodzenia przez próbkę. Informacje te mogą być przydatne do bezwzględnej kwantyfikacji liczby atomów określonego pierwiastka obecnego w próbce8.

Ponieważ próbki biologiczne składają się głównie z lekkich pierwiastków, które słabo odchylają elektrony w padającej wiązce TEM, metody barwienia przy użyciu soli metali ciężkich muszą być stosowane w celu wytworzenia kontrastu w próbce. Brak swoistości większości tych kontrastujących czynników i niemożność wizualizacji więcej niż jednej plamy tam, gdzie możliwa jest specyficzność, ograniczył wartość konwencjonalnej mikroskopii elektronowej w badaniu jądra. ESI ma znaczące zalety w porównaniu z konwencjonalnym TEM, szczególnie w badaniu struktur jądra komórkowego. Możliwe jest wykorzystanie bogatej w fosfor natury kompleksów makromolekularnych zawierających DNA i RNA w celu odróżnienia kompleksów nukleoproteinowych od kompleksów białkowych i rozdzielenia różnych kompleksów nukleoprotein na podstawie ich gęstości kwasów nukleinowych. Pozostały materiał biologiczny można obrazować na podstawie obfitości azotu. Mapowanie tylko tych dwóch pierwiastków oraz analiza ich rozmieszczenia i względnej liczebności w różnych strukturach anatomicznych dostarcza nam wielu informacji o jądrze. Na przykład łatwo jest zidentyfikować chromatynę i rybosomy na mapie reprezentujące obfitość fosforu. Z drugiej strony przestrzeń międzychromatynowa, kompleksy porów jądrowych i ciała jądrowe można łatwo wykryć na obrazie mapy azotu.

Mini system generatora tlenu singlet (miniSOG)

Chociaż ESI stanowi potężną technikę do badania struktury chromatyny in situ, ponieważ wykorzystuje charakterystyczne proporcje w składzie pierwiastkowym między fosforem a azotem, skład pierwiastkowy nie może być normalnie używany do rozróżniania różnych populacji kompleksów białkowych. Przeciwciała znakowane małymi cząstkami złota w zakresie nanometrów są szeroko stosowane do mapowania lokalizacji poszczególnych cząsteczek. Ponieważ cząsteczka złota jest zwykle przyłączona do przeciwciała drugorzędowego, pojawi się w obwodzie około 20 nm wokół epitopu wykrytego przez przeciwciało pierwszorzędowe. W próbkach po osadzeniu przeciwciała mogą wykryć tylko epitopy, które są odsłonięte na powierzchni skrawków. Chociaż możliwe jest udowodnienie obecności antygenu i powiązanie go z określoną strukturą anatomiczną komórki, uzyskane informacje są niekompletne, ponieważ większość epitopów jest przesłonięta żywicą. Techniki wstępnego zatapiania, które wykorzystują protokoły podobne do tych stosowanych w mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiają dostęp do antygenów na całej głębokości próbki, ale etapy przepuszczalności, które są wymagane, aby przeciwciało mogło przeniknąć do komórki, zwykle wymagają usunięcia błon lipidowych i usunięcia składników, których nie można związać aldehydami. Co więcej, preferowany utrwalacz aldehydu do zachowania ultrastruktury, aldehyd glutarowy, zwykle niszczy epitopy, w związku z czym zwykle wymagany jest paraformaldehyd. Jest to mniej skuteczne w sieciowaniu białko-białko. Inną wadą przeciwciał znakowanych nanocząstką złota jest to, że złoto jest materiałem o dużej gęstości elektronów, który tworzy silny kontrast, który może przesłaniać interesujące szczegóły strukturalne próbki, która ma słabszy kontrast.

Pojawienie się białka zielonej fluorescencji (GFP) jako znacznika białka wyrażonego zmieniło sposób wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej do odpowiadania na pytania w biologii komórki. Znakowanie białka małą domeną fluorescencyjną umożliwia mapowanie jego rozmieszczenia in vivo bez konieczności przeprowadzania procedur przepuszczalności, które mogą zmienić strukturę. Aby przełożyć elegancką zasadę wykorzystania znaczników białkowych do mapowania rozkładu białek w komórce na mikroskopię elektronową, potrzebny był system, który jest w stanie wytworzyć sygnał zbliżony do struktury będącej przedmiotem zainteresowania i wygenerować kontrast w TEM. Spolimeryzowana diaminobenzydyna jest barwnikiem, który jest często używany w histologii do wykrywania wiązania przeciwciał. Plama ta jest zwykle osadzana za pomocą peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z przeciwciałem drugorzędowym. Chociaż reakcja daje wiarygodny wynik, HRP nie jest katalitycznie aktywny w cytozolu komórek9. Produkty reakcji HRP mogą również dyfundować z dala od miejsca powstania, przez co ich rozdzielczość jest gorsza niż w przypadku metody nanozłota10. Aby ominąć te problemy, opracowano system FlAsH/ReAsH11. Składa się z rekombinowanych białek fuzyjnych, które posiadają motyw tetracysteiny. Motyw ten pozwala na wiązanie dwuarszenicznego fluoroforu. Po wzbudzeniu związany FlAsH lub ReAsH jest w stanie wytworzyć wysoce reaktywny tlen singletowy, a tym samym fotoprzekształcić diaminobenzydynę (DAB) w polimer, który wytrąca się natychmiast w miejscu znakowanych białek. Polimer DAB może być barwiony tetratlenkiem osmu, który ma gęstość elektronów, a zatem może być używany do mapowania rozmieszczenia rekombinowanego białka fuzyjnego w TEM.

W 2011 roku Shu i wsp.10 zaprezentowało system miniSOG, który składa się z małego znacznika fuzyjnego 106 aminokwasów pochodzących z flawoproteiny Arabidopsis, która jest fluorescencyjna i zdolna do tworzenia wielu singletowych rodników tlenowych po wzbudzeniu niebieskim światłem o długości 448 nm. Te singletowe rodniki tlenowe mogą być wykorzystywane do fotoutleniania diaminobenzydyny w celu wytworzenia polimerów na i w pobliżu powierzchni znakowanego białka, które jest znacznie bliższe niż przeciwciała znakowane immunozłotem11. Podczas gdy system FlAsH/ReAsH wymaga wprowadzenia fluorochromu i diaminobenzydyny do komórek przed wykonaniem fotokonwersji, system miniSOG wymaga tylko diaminobenzydyny i światła, a ponadto jest około dwa razy skuteczniejszy w polimeryzacji diaminobenzydyny. W tym przypadku miniSOG jest stosowany w połączeniu z ESI w celu zmapowania ultrastruktury ognisk naprawy DNA.

Ogniska naprawy DNA (DRF)

Nienaprawione pęknięcia podwójnej nici DNA stanowią poważne zagrożenie dla komórki, ponieważ mogą prowadzić do translokacji i utraty informacji genetycznej. To z kolei może prowadzić do starzenia się, raka i śmierci komórek. Wiele białek, które biorą udział w naprawie pęknięć podwójnej nici DNA, gromadzi się w ogniskach, które gromadzą się wokół pęknięcia podwójnej nici DNA12-14. Chociaż ich funkcja nie jest znana, reprezentują one miejsce w jądrze, które zawiera pęknięcie podwójnej nici DNA i jest miejscem naprawy pęknięcia podwójnej nici DNA.

Ogniska naprawy DNA (DRF) zostały scharakteryzowane przez mikroskopię fluorescencyjną i służą jako biomarkery uszkodzeń DNA12,15. Są one masywne w stosunku do wielkości pęknięcia dwuniciowego i były uważane za stosunkowo jednorodne, dopóki ostatnie badania mikroskopowe w superrozdzielczości nie ujawniły pewnych dowodów na podpodział cząsteczek w każdym ognisku16. Aby zrozumieć, w jaki sposób te miejsca są zorganizowane, konieczne jest zobrazowanie wszystkich podstawowych struktur biologicznych względem siebie. Nie można tego osiągnąć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, ale jest to możliwe za pomocą mikroskopii elektronowej17,18. W tym miejscu opisano metodę, która łączy obrazowanie spektroskopowe elektronów z metodą miniSOG, aby zilustrować potencjał tego połączonego podejścia do badania ultrastruktury naprawy pęknięć dwuniciowych DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generacja linii komórkowych miniSOG

  1. Hoduj komórki U2OS (ludzkiego kostniakomięsaka) w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, które jest uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% atmosferąCO2
    2. .
  2. Transfekcję komórek, gdy są one w 80% zlewające się przez lipofekcję, z oczyszczonymi konstruktami plazmidowymi o jakości transfekcji (stosunek A269/280 1,8-2,0) zawierającymi sekwencje białek naprawczych znakowanych miniSOG i mCherry zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji19. Plazmidy ekspresyjne miniSOG można zamówić w Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. Posortuj komórki wyrażające rekombinowane białko za pomocą znacznika miniSOG i mCherry przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją dwa dni po transfekcji. Zbierz komórki o średniej intensywności fluorescencji, aby uniknąć komórek o nadekspresji20.
  4. Hodować komórki dodatnie na 10 cm szalce w 10 ml pożywki DMEM, którą uzupełnia się 10 % FBS i 0,6 μg/ml środka selekcyjnego G418 (Geneticin).
  5. Po pojawieniu się widocznych kolonii na płytkach, przebadaj pod kątem kolonii mCherry dodatnich za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i narysuj wokół nich (na spodzie płytki) kółka markerem permanentnym. Użyj soczewki obiektywu powietrznego o małym powiększeniu (np. 10x) i wybierz klony za pomocą sterylnej techniki, ostrożnie zdrapując kolonie i powoli zasysając je do sterylnej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl.
  6. Rozwiń wybrane kolonie i zamroź ich części za pomocą pożywki opisanej w kroku 1.1 uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem. Przetestuj komórki pod kątem tworzenia DRF, hodując je na sterylnych szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 18 x 18mm2 i wystawiając je na działanie promieniowania 2 Gy. Napromieniowane komórki stabilnie eksprymujące białko naprawcze oznaczone miniSOG mCherry muszą wykazywać typowy wzór ogniskowy charakterystyczny dla DSB podczas wizualizacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu zestawu filtrów do obrazowania mCherry.

2. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek U2OS stabilnie eksprymujących białka naprawcze znakowane miniSOG i mCherry w warunkach opisanych w kroku 1.1. Hoduj komórki do 80% konfluencji w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierającym 2 ml DMEM. Upewnij się, że klej mocujący szkiełko nakrywkowe do plastiku i zużytego tworzywa sztucznego jest odporny na roztwory wodne i alkoholowe oraz odporny na użytą żywicę!
  2. Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy nakreślić mały obszar o wielkości około 1mm2, który zawiera komórki wyrażające białka ektopowe, poprzez drapanie sterylnym pisakiem diamentowym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania obszaru zainteresowania. Alternatywnie można użyć naczynia ze szklanym dnem, które zawiera szkiełko nakrywkowe z wstępnie wytrawionym systemem siatki wbudowanym w szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: W przypadku korzystania z wysokiej jakości mikroskopii korelacyjnej łączącej ESI i obrazy mikroskopu fluorescencyjnego21, upewnij się, że grubość szkiełka nakrywkowego jest zgodna z obiektywami zanurzeniowymi w olejku. Powinien mieć grubość nr 1,5 (0,16-0,18 mm). Wybierz obszar blisko środka naczynia dla obszaru, który ma być badany w TEM, aby uniknąć problemów z polimeryzacją żywicy, które mogą wystąpić w pobliżu krawędzi (patrz punkt 4.10-4.13).

3. Indukcja uszkodzeń DNA

  1. Napromienić komórki promieniowaniem gamma, użyć leku radiomimetycznego lub wywołać uszkodzenie za pomocą mikropromieniowania laserowego pod mikroskopem konfokalnym (np. zgodnie z opisem w18, 22 lub 23).
  2. W tym przykładzie należy napromienić komórki promieniowaniem gamma 2 i 6 Gy w źródle promieniowania cezowego-137 lub napromieniować laserowo za pomocą lasera na ciele stałym 405 nm mikroskopu konfokalnego po uwrażliwieniu komórek przez 20 minut 0,5 μg/ml Hoechst.

4. Przygotowanie próbki

  1. Utrwalić komórki za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu UWAGA w 0,1 M buforze kakodylanu sodu lub w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Paraformaldehyd i kakodylan sodu są toksyczne! Nosić rękawice i odpowiednio zutylizować substancje toksyczne.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie 4 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu o pH 7,4 lub buforu fosforanowego o pH 7,4.
  3. Utrwalone komórki należy potraktować 2 ml 50 mM glicyny, 5 mM aminotriazolu i 10 mM cyjanku potasu UWAGA w 0,1 M buforze kakodylanu sodu lub 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4) (sprawdzić pH!) przez 30 minut w celu zablokowania nieprzereagowanych grup aldehydowych i stłumienia reaktywnych form tlenu wytwarzanych przez grupy hemowe, co może zwiększyć tło.
    UWAGA: Cyjanek potasu jest niezwykle toksyczny! Nosić rękawice, pracować pod kapturem i odpowiednio zutylizować substancje toksyczne. Reakcja jest bardzo wrażliwa na pH, dlatego ważne jest, aby pH było zweryfikowane i dokładne.
  4. Zapisz obszar, który został wybrany w kroku 2.2 w 2D lub 3D na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, jeśli wymagana jest mikroskopia korelacyjna.
  5. Przygotować roztwór chlorowodorku diaminoferydyny o stężeniu 1 mg/ml, umieszczając tabletkę 10 mg chlorowodorku diaminoferydyny w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Dodać 980 μl destylowanegoH2Oi 20 μl stężonego kwasu solnego (11,65 M) i mieszać, aż roztwór stanie się jasnobrązowy i przezroczysty. Rozcieńczyć ten roztwór w 0,1 M fosforanie lub 0,1 M buforze kakodylanu sodu do końcowego stężenia 1 mg/ml, dostosowując pH wodorotlenkiem sodu do pH między 7,0 a 7,6 (zalecane pH 7,4).
    UWAGA: Diaminobenzydyna jest toksyczna! Nosić rękawice i odpowiednio zutylizować substancje toksyczne.
  6. W celu fotoutleniania zastąpić bufor 2 ml roztworu chlorowodorku diaminobenzydyny o stężeniu 1 mg/ml w 0,1 M buforze kakodylanu sodu lub buforze fosforanowym. Chronić ten roztwór przed światłem i schłodzić go na lodzie do 4 oC w celu zwiększenia rozpuszczalności tlenu. Nasycić roztwór tlenem, przepuszczając tlen przez roztwór (użyć węża, który jest włożony do roztworu i podłączony do butli z tlenem). Sprawdź ponownie pH i dostosuj w razie potrzeby.
    UWAGA: Kluczowe znaczenie dla reakcji fotooksydacji ma to, aby pH mieściło się w przedziale od pH 7,0 do pH 7,6.
  7. Ostrożnie zamontuj naczynie z nieruchomymi komórkami na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w 40-krotną soczewkę obiektywową z olejkiem i przesuń ją w obszar zainteresowania. Wzbudz znacznik miniSOG niebieskim światłem, używając kostek filtrujących do GFP lub CFP. MiniSOG ma maksimum wzbudzenia przy 448 nm z ramieniem przy 473 nm10.
  8. Kontynuuj oświetlenie nawet po całkowitym zniknięciu zielonej fluorescencji miniSOG i do momentu, gdy w kanale światła przechodzącego pojawi się brązowy produkt fotoutleniania spolimeryzowanej diaminobenzydyny. Gdy produkt utleniania jest widoczny w większości komórek, wyłącz oświetlenie fluorescencyjne, aby zatrzymać fotoutlenianie.
    UWAGA: Fotoutlenianie może trwać do kilku minut w zależności od soczewki obiektywu, długości fal transmisji filtra i wydajności oraz źródła oświetlenia.
  9. Po utrwaleniu komórek 1 ml 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 lub buforze fosforanowym o pH 7,4 przez 30 min.
  10. Utrwalić błony komórek za pomocą 0,1%-0,5% tetratlenku osmu przez 20 minut w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 lub w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4,
    UWAGA: Zaleca się stosowanie najniższego możliwego stężenia tetratlenku osmu wymaganego do stabilizacji membran. Ponieważ spolimeryzowane osady DAB mają wysoką gęstość azotu, która może być wykryta bezpośrednio przez ESI, silne barwienie osmem nie jest konieczne do identyfikacji białka znakowanego miniSOG i może być szkodliwe dla ESI. Tetrtlenek osmu jest bardzo toksyczny! Pracuj pod wyciągiem i odpowiednio zutylizuj toksyczne odpady.
  11. Odwodnić komórki przez serię etanolu przy użyciu 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanolu (co 5 minut). Następnie inkubuj komórki w mieszance 1:1 100% etanolu i żywicy akrylowej (LR White) i umieść naczynie na wytrząsarce na 4 godziny, aby ułatwić infiltrację do komórek przed inkubacją komórek przez co najmniej kolejne 4 godziny w 100% żywicy akrylowej (LR White).
  12. W celu polimeryzacji żywicy należy odciąć pokrywkę oznakowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml za pomocą żyletki i pokryć krawędź akceleratorem żywicy akrylowej. Upewnij się, że akcelerator zakrywa tylko obręcz i nie wpływa do rury. Następnie ostrożnie napełnij probówkę w około dwóch trzecich żywicą LR White za pomocą pipety Pasteura. Uważaj, aby żywica nie stykała się z akceleratorem na feldze!
  13. Usuń żywicę, która przeniknęła do komórek w naczyniu i umieść naczynie do góry nogami na pionowo stojącej probówce do mikrowirówki, tak aby szerokość probówki prawie całkowicie wypełniła zaszklone okienko obserwacyjne naczynia.
  14. Odczekaj 1 do 2 minut, aż akcelerator uszczelni rurkę i szkiełko nakrywkowe, a następnie odwróć rurkę tak, aby żywica w tubie pokryła teraz komórki.
  15. Naczynie z rurką wstawiamy do piekarnika w temperaturze 60 °C i utwardzamy przez 12 godzin.
  16. Po utwardzeniu bloku wyjmij naczynie z dołączoną rurką wirówkową wypełnioną żywicą z piekarnika i oddziel probówkę mikrowirówki od naczynia. Ułatw separację poprzez cykle zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie i gorącej wodzie.
  17. Wyrzuć naczynie ze szklanym dnem i ostrożnie rozetnij probówkę mikrowirówki żyletką w celu usunięcia bloku.
  18. Oznacz blok trwałym markerem.
  19. Użyj żyletki, aby przyciąć blok tak, aby nie pozostało nic poza obszarem 1 mm2, który zawiera obszar wcześniej oznaczony pisakiem diamentowym lub wolframowym (lub zawiera obszar z interesującymi komórkami).
  20. Zamontuj blok w ultramikrotomie, przytnij blok nożem do przycinania i wytnij ultracienkie odcinki o długości około 50 nm za pomocą noża diamentowego.
  21. Podnieś sekcje na siatkach 300 mesh o wysokiej transmisji. Siatki te mają bardzo małe paski siatki, dzięki czemu obejmują mniej komórek w obszarze zainteresowania.
  22. Pokryj sekcje na siatkach około 0,2-0,4 nm węgla za pomocą powlekarki węglowej, aby pomóc ustabilizować je pod wiązką elektronów TEM.

5. Mikroskopia elektronowa

  1. Załaduj siatki do TEM, który jest wyposażony w filtr energii. Po dostrojeniu mikroskopu i filtra energetycznego zgodnie z instrukcjami producenta, należy sprawdzić ogniwa na sekcjach w trybie małego powiększenia (normalna transmisja) i w razie potrzeby porównać je z danymi fluorescencji (uzyskanymi w kroku 4.4).
  2. Po znalezieniu jądra o interesujących cechach (ślad uszkodzenia DNA lub ogniska naprawy DNA) przełącz się w tryb filtrowania energii i zapisz mapę grubości.
    UWAGA: Ta procedura obejmuje nagrywanie obrazu bez strat i bez filtrowania. Grubości do 0,3 średniej drogi swobodnej (30% elektronów padającej wiązki zostaje rozproszonych przez próbkę) są wystarczająco cienkie, aby wygenerować dobre mapy pierwiastków.
  3. Zapisuj mapy proporcji pierwiastków fosforu i azotu za pomocą oprogramowania sterującego filtrem energii używanego mikroskopu. Rejestruj obrazy krawędzi słupa mapy fosforu przy utracie energii 175 eV przy szerokości szczeliny 20 eV i obrazach przed krawędzią przy utracie energii 120 eV, również przy szerokości szczeliny 20 eV. W przypadku map azotu należy rejestrować obrazy krawędzi słupków przy 447 eV przy szerokości szczeliny 35 eV i obrazy przed krawędzią przy 358 eV, również przy szerokości szczeliny 35 eV.
    UWAGA: Ponieważ zawartość obrazowanych pierwiastków (fosforu i azotu) jest stosunkowo niska (ok. 1%), wybierz "Ratio Image" (jakościowa mapa elementarna) zamiast "metody 3 okien" (ilościowa mapa elementarna), aby wygenerować obrazy o lepszym stosunku sygnału do szumu.

6. Przetwarzanie obrazu

  1. Otwórz mapy proporcji pierwiastkowych w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, które obsługuje format pliku uzyskanych obrazów (np. Mikrografia cyfrowa). Skopiuj mapę azotu do kanału czerwonego, a mapę fosforu do kanału zielonego obrazu RGB, a następnie nałóż i wyrównaj mapy.
  2. Wyeksportuj obraz kompozytowy jako plik w formacie TIFF (Tagged Image File Format). Otwórz obraz w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, które może używać warstw (np. Photoshop).
  3. Dostosuj zakres dynamiki każdego kanału, przeskalowując minimalne i maksymalne wartości obrazu do 8-bitowego zestawu danych (od 0 do 255).
  4. Odejmij zawartość fosforu od mapy azotu (za pomocą okna "Warstwy"), aby wygenerować mapę jakościową, która pokazuje rozmieszczenie białka.
  5. Przekonwertuj mapy kwasu nukleinowego (fosforu) i białka (azotu) utworzone w poprzednim kroku na "kolor indeksowany" i utwórz żółtą tabelę przeglądową w przestrzeni kolorów CMYK dla mapy przedstawiającej rozkład kwasów nukleinowych oraz niebieskozieloną tabelę przeglądową, aby pokazać mapę nienukleoproteinową. Kolory są dobierane tak, aby generować maksymalny kontrast między dwiema mapami żywiołów.
  6. Utwórz nowy obraz i zaimportuj mapy przedstawiające rozkład fosforu i białka w różnych warstwach. Użyj trybu przezroczystości "ekranu", aby zobaczyć obie warstwy nałożone na siebie.
  7. Otwórz obraz bez strat uzyskany w kroku 5.2. Ten obraz przedstawia obraz zarejestrowanego obszaru, który wygląda jak konwencjonalny obraz TEM, ale zawiera tylko elektrony, które przeszły przez próbkę bez kolizji z próbką. Wyeksportuj ten obraz jako obraz TIFF.
  8. Otwórz wyeksportowany obraz o zerowej stracie w edytorze zdjęć i skopiuj go do najwyższej warstwy obrazu przedstawiającej mapę żywiołów. Wyrównaj obraz w trybie przezroczystości "ekran".
  9. Opcjonalnie proguj obraz bez strat, aby podzielić sygnał pochodzący z miniSOG. Dodaj wynikowy obraz jako osobną warstwę, jak opisano powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ESI

Porównanie obrazów ESI jądra komórkowego (Rycina 1) z konwencjonalnymi obrazami TEM (np. Rycina 7-1) wykazuje gwałtowny wzrost liczby struktur anatomicznych, które można łatwo rozróżnić. Grzebienie chromatyny pojawiają się w kolorze żółtym, a w komórkach myszy całkiem łatwo jest zidentyfikować centra chromatyny. Jąderka można łatwo odróżnić od chromatyny po ich okrągłej strukturze i innym kolorze, ponieważ wstępnie zmontowane rybo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

ESI może służyć jako doskonałe narzędzie do badania różnych stanów chromatyny i rybonukleoprotein w jądrze, ponieważ jest w stanie specyficznie mapować obszary bogate w fosfor. Znacznie zwiększa ilość szczegółów, które można uzyskać za pomocą mikroskopu elektronowego i nie jest zależny od niespecyficznych metod kontrastowania. Jedną z wad ESI jest to, że wymaga cieńszych sekcji niż konwencjonalny TEM przy tym samym napięciu przyspieszania. Można temu zaradzić, pracując z sekcjami seryjnymi lub stosując metody tomograficz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Rogerowi Tsienowi za dostarczenie nam konstrukcji miniSOG. Dr. Xuejun Sun za pomoc przy TEM. Lisa Lem i Peter Shipple z Cross Cancer Institute za dostarczenie tlenu. Hilmar Strickfaden jest stypendystą stażu podoktorskiego Fundacji Alberta Cancer Foundation i był wspierany przez Bayrische Forschungsallianz. Prace te były wspierane przez granty z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem i Alberta Cancer Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia ze szklanym dnem 35 mmMatTekP35G-1.5-14-C
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm z kratkąMatTekP35G-2-14-CGRD Nie jest przeznaczony do celów immersyjnych
LR Biały: żywica akrylowaemsdiasum14381
LR Biały akceleratoremsdiasum14385
3,3&--diaminobenzydyny tetrachlorowodorek 10 mg tabletkiSigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
Tungsten-Point Lab Penemsdiasum41148
Tetratlenek osmuemsdiasum19100
Carbon Coater 208 carbonCressington
Ultra mikrotom Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobemoże nawet działać ze starszymi wersjami
Digital Micrograph V.2.30Gatanmoże nawet działać ze starszymi wersjami
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cezium 137 źródło promieniowania "ZNAK 1" ( J.L. Shepherd & Powiązany)
ImageJ/FiJiopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
2 ml probówki EppendorfFisherbrand05-408-146
Nóż diamentowy ultra 35°Diatome
ultratrimDiatome
Kakodylan sodu trójwodnyemsdiasum12300Uwaga Toksyczny!
Aldehyd glutarowy EM Grade 8%emsdiasum16020Uwaga Toksyczny!
Fosforan sodu dwuzasadowyemsdiasum21180
Fosforan sodu jednozasadowyemsdiasum21190
Paraformaldehydemsdiasum19202
Tetratlenek osmu 4% roztwóremsdiasum19150
Mikoskop odwróconej fluorescencji Axiovert 200MKwas
FisherbrandA142-212
Roztwór wodorotlenku sodu 10MFluka72068
OxygenMedigas
3-amino-1,2,4-triazoleSigmaA8056
Cyjanek potasuSigma207810Uwaga Toksyczny!
Etanolemsdiasum15058Uwaga Toksyczny!
Żyletka Jednokrawędziowa stal węglowaemsdiasum71960Uwaga Ostra!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
Transmisyjny mikroskop elektronowy 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Filtr energiiGatan
Nóż do przycinania solny Zeiss

Bibliografia

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041(2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135(2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

znacznik miniSOGtransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia fluorescencyjnamikroirradiacja laserowamapowanie fosforumapowanie azotuultrastruktura chromatynyp kni cie obu nici DNA

Powiązane artykuły