Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Summary

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Abstract

Przedstawiona tutaj technika pozwala przeanalizować, na którym etapie docelowe białko, lub alternatywnie mała cząsteczka, oddziałuje ze składnikami szlaku sygnałowego. Metoda opiera się z jednej strony na indukowalnej ekspresji określonego białka w celu zainicjowania zdarzenia sygnalizacyjnego na określonym i z góry określonym kroku w wybranej kaskadzie sygnałowej. Z drugiej strony, jednoczesna ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania pozwala badaczowi ocenić, czy aktywność wyrażonego białka docelowego znajduje się przed czy za zainicjowanym zdarzeniem sygnalizacyjnym, w zależności od odczytu uzyskanego szlaku sygnałowego. W tym przypadku kaskada apoptotyczna została wybrana jako zdefiniowana ścieżka sygnałowa w celu zademonstrowania funkcjonalności protokołu. Bakterie chorobotwórcze, takie jak Coxiella burnetii, przemieszczają białka efektorowe, które zakłócają indukcję śmierci komórki gospodarza w komórce gospodarza, aby zapewnić przetrwanie bakterii w komórce i sprzyjać ich rozprzestrzenianiu się w organizmie. Białko efektorowe CaeB C. burnetii skutecznie hamuje śmierć komórek gospodarza po indukcji apoptozy światłem UV lub staurosporyną. Aby zawęzić, na którym etapie CaeB zakłóca propagację sygnału apoptotycznego, wybrane białka o dobrze scharakteryzowanej aktywności proapoptotycznej uległy ekspresji przejściowej w sposób indukowany doksycykliną. Jeśli CaeB działa przed tymi białkami, apoptoza będzie przebiegać bez przeszkód. Jeśli CaeB działa w dół, śmierć komórki zostanie zahamowana. Wybrano białka testowe: Bax, który działa na poziomie mitochondriów, oraz kaspazę 3, która jest główną proteazą egzekucyjną. CaeB zakłóca śmierć komórki indukowaną przez ekspresję Bax, ale nie przez ekspresję kaspazy 3. W ten sposób CaeB oddziałuje z kaskadą apoptotyczną między tymi dwoma białkami.

Introduction

Zjadliwość wielu patogenów bakteryjnych Gram-ujemnych zależy od wyspecjalizowanych systemów wydzielania, które przejmują kontrolę nad eukariotycznymi komórkami gospodarza. Bakterie wykorzystują te systemy wydzielania do wstrzykiwania bakteryjnych białek wirulencji (efektorów) do komórki gospodarza w celu modulowania różnych aktywności komórkowych i biochemicznych. Badania nad białkami efektorowymi dostarczyły nie tylko niezwykłego wglądu w fundamentalne aspekty interakcji gospodarz/patogen, ale także w podstawową biologię komórek eukariotycznych¹. Wykazano, że modulacja apoptozy komórek gospodarza jest ważnym mechanizmem wirulencji dla wielu patogenów wewną....

Protocol

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających interesujące białko

1. Przygotuj pożywkę, dodając inaktywowany termicznie FCS i 1% penicyliny/streptomycyny do dostępnego na rynku zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego GlutaMAX-I, pirogronianem i 4,5 g/l D-glukozy.
2. Hodować komórki HEK293 w pożywce w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .} Hoduj komórki co trzeci dzień. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 15 ml świeżej pożywki. Odpipetować 1 ml do nowej kolby^hodowlanej o średnicy 75 cm i dodać 14 ml pożywki.
3. Przeanalizuj liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
4. Wysiewaj....

Results

Po pierwsze, ustanowiono linie komórkowe HEK293 stabilnie wyrażające interesujące białko (CaeB) jako białko fuzyjne GFP. Jako kontrolę wygenerowano również linie komórkowe HEK293 stabilnie eksprymujące GFP. Ekspresję GFP i GFP-CaeB zweryfikowano za pomocą analizy immunoblot. Reprezentatywny immunoblot (ryc. 4A) wykazuje stabilną i wyraźnie wykrywalną ekspresję GFP i GFP-CaeB. Jednak ten test nie może określić, czy wszystkie komórki wyrażają GFP czy GFP-CaeB. W związku z tym stabilnie transfekowane linie .......

Discussion

Wiele bakterii chorobotwórczych posiada systemy wydzielnicze, które wydzielają lub przemieszczają bakteryjne białka efektorowe do komórki gospodarza. Te białka efektorowe mają zdolność modulowania procesów i szlaków w komórce gospodarza, umożliwiając bakteriom przetrwanie i replikację w odpowiedniej niszy wewnątrzkomórkowej. Zrozumienie aktywności biochemicznej i mechanizmów molekularnych białek efektorowych pomoże w lepszym zrozumieniu patogenności i może pomóc w opracowaniu nowych narzędzi terapeutycznych do zwalczania.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technologie życia	DMEM	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Technologie życia	pióra/paciorkowca	15140-122
Technologie życia	OptiMEM	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polietyleniny	Polyscienes	23966
Doksycyklina	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowa	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
Membrana	PVDFMillipore	IPVH00010
anty-GFP	life technologies	A6455
przeciw rozszczepieniu PARP	BD Bioscience	611038
antyaktyna	Sigma Aldrich	A2066
Mysia IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
IgG królika (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
Podłoże do blottingu ECL	Western Thermo Scientific	32106
Bufor do usuwania Western Blot Restore Plus	Thermo Scientific	46428