Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Zjadliwość wielu patogenów bakteryjnych Gram-ujemnych zależy od wyspecjalizowanych systemów wydzielania, które przejmują kontrolę nad eukariotycznymi komórkami gospodarza. Bakterie wykorzystują te systemy wydzielania do wstrzykiwania bakteryjnych białek wirulencji (efektorów) do komórki gospodarza w celu modulowania różnych aktywności komórkowych i biochemicznych. Badania nad białkami efektorowymi dostarczyły nie tylko niezwykłego wglądu w fundamentalne aspekty interakcji gospodarz/patogen, ale także w podstawową biologię komórek eukariotycznych¹. Wykazano, że modulacja apoptozy komórek gospodarza jest ważnym mechanizmem wirulencji dla wielu patogenów wewnątrzkomórkowych, a szereg białek efektorowych modulujących apoptozę zidentyfikowano^2-9. Jednak w wielu przypadkach ich dokładne molekularne mechanizmy działania pozostają nieuchwytne.

Apoptoza, forma zaprogramowanej śmierci komórki, odgrywa ważną rolę w odpowiedziach immunologicznych na infekcję¹⁰. Zidentyfikowano dwie główne ścieżki prowadzące do apoptozy: celowanie w mitochondria (apoptoza wewnętrzna) lub bezpośrednia transdukcja sygnału przez receptory śmierci komórki na błonie komórkowej (apoptoza zewnętrzna). Wewnętrzny lub zależny od mitochondriów szlak śmierci komórki jest wyzwalany przez sygnały wewnątrzkomórkowe i obejmuje aktywację Bax i Bak, dwóch proapoptotycznych członków rodziny Bcl-2. Rodzina ta składa się z pro- i antyapoptotycznych białek regulatorowych, które kontrolują śmierć komórki^11-14. Aktywacja apoptozy prowadzi do oligomeryzacji Bax i Bak, a następnie do permeabilizacji zewnętrznej błony mitochondrialnej, co powoduje uwolnienie cytochromu C do cytoplazmy. Uwalnianie cytochromu C inicjuje aktywację kaspaz efektorowych 3 i 7 poprzez aktywację kaspazy 9 w apoptosomie¹⁵. Prowadzi to do proteolizy wybranych substratów, która między innymi powoduje ekspozycję fosfatydyloseryny na powierzchnię^komórki16 i uwalnia dedykowaną DNazę, która fragmentuje chromatynę^17,18.

W celu określenia, gdzie w kaskadzie apoptozy interferuje pojedyncze białko efektorowe, zastosowano indukowalny system ekspresji¹⁹. Systemy regulacyjne do warunkowej ekspresji transgenów są nieocenionym narzędziem w analizie funkcji białka w komórce lub jego znaczenia dla rozwoju tkanek, narządów i organizmów, a także podczas inicjacji, progresji i utrzymywania choroby^20-23. Zazwyczaj indukowane systemy sterowania, takie jak zastosowany tutaj system Tet²⁴, tworzą sztuczną jednostkę transkrypcyjną (patrz rysunek 1). Jednym ze składników jest sztucznie zmodyfikowany czynnik transkrypcyjny zwany tTA (aktywator transkrypcji zależny od tetracykliny), utworzony przez fuzję bakteryjnego represora transkrypcji TetR²⁵ z domeną białka ssaków, która pośredniczy w aktywacji transkrypcji lub wyciszaniu ^24,26. Drugi składnik to promotor hybrydowy, określany jako TRE (element reagujący na tetracyklinę), składający się z eukariotycznego minimalnego promotora, zawierającego co najmniej pudełko TATA i miejsce inicjacji transkrypcji, połączone z wieloma powtórzeniami pokrewnego miejsca wiązania DNA dla TetR, tetO^24,25. Trzecim składnikiem jest naturalny ligand TetR, tetracyklina lub jedna z jej pochodnych, taka jak anhydrotetracyklina lub doksycyklina²⁵. Po dodaniu liganda do pożywki hodowlanej, TetR traci swoje powinowactwo do tetO i dysocjuje od TRE. W rezultacie transkrypcja genu docelowego zostaje zniesiona. Ekspresja transgenu może być zatem ściśle kontrolowana w sposób zależny od czasu i dawki, zarówno w hodowli komórkowej, jak i u zwierząt^20,23,24. W przypadku tTA ekspresja transgenu zachodzi konstytutywnie, z wyjątkiem obecności tetracykliny. Może to być niekorzystne w badaniach białek cytotoksycznych lub onkogennych, ponieważ tetracyklina musi najpierw zostać usunięta z systemu, zanim nastąpi ekspresja transgenu i będzie można monitorować wpływ białka docelowego na komórkę. Może to być czasochłonne i nie zawsze jest kompletne, zwłaszcza u zwierząt transgenicznych²⁷. Aby rozwiązać to ograniczenie, mutant TetR z odwrotną reakcją na obecność doksycykliny został wykorzystany do wygenerowania nowego czynnika transkrypcyjnego, rtTA (reverse tTA)²⁸. Wiąże się tylko z TRE i jednocześnie aktywuje transkrypcję w obecności doksycykliny. Szczątkowa nieszczelność systemu, tj. ekspresja transgenu przy braku czynnika transkrypcyjnego związanego z TRE, pochodząca albo (i) z efektów położenia w miejscu integracji genomowej, (ii) z samego TRE²⁹, albo (iii) z niespecyficznego wiązania tTA/rtTA²⁸, została rozwiązana poprzez wprowadzenie dodatkowego tłumika transkrypcyjnego, określanego jako tTS (tłumik transkrypcyjny zależny od tetracykliny)³⁰ do systemu. Tworzy on podwójną sieć regulatorów wraz z rtTA (patrz rysunek 1). W przypadku braku doksycykliny, tTS wiąże się z TRE i aktywnie wyłącza pozostałą transkrypcję. W obecności doksycykliny tTS dysocjuje od TRE i rtTA wiąże się jednocześnie, indukując ekspresję docelowego genu. Ta dodatkowa warstwa surowości jest często niezbędna do ekspresji wysoce aktywnych białek cytotoksycznych^31-34.

Korzystając z tego ściśle kontrolowanego systemu podwójnego regulatora, kaskada apoptozy może być zainicjowana w określonym kroku, co pozwala na analizę, czy dane białko efektorowe może zakłócać indukcję apoptozy. Metoda ta może być stosowana nie tylko do badania aktywności antyapoptotycznej bakteryjnych białek efektorowych, ale także do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających interesujące białko

1. Przygotuj pożywkę, dodając inaktywowany termicznie FCS i 1% penicyliny/streptomycyny do dostępnego na rynku zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego GlutaMAX-I, pirogronianem i 4,5 g/l D-glukozy.
2. Hodować komórki HEK293 w pożywce w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .} Hoduj komórki co trzeci dzień. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 15 ml świeżej pożywki. Odpipetować 1 ml do nowej kolby^hodowlanej o średnicy 75 cm i dodać 14 ml pożywki.
3. Przeanalizuj liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
4. Wysiewaj komórki HEK293 na 6-dołkowej płytce o gęstości 2 x 10⁵ komórek na dołek i inkubuj przez 24 godziny.
5. Do transfekcji należy użyć protokołu dostarczonego przez producenta odczynnika do transfekcji. Komórki transfekcyjne z pEGFP-C2 lub pEGFP-C2-CaeB przy użyciu odczynnika do transfekcji. Przed użyciem rozgrzej odczynnik do transfekcji i pożywkę wymaganą do RT. Użyj odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 do DNA.
   1. Szczegółowo, odpipetować 1,5 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do 50 μl pożywki DMEM bez surowicy. W celu wytworzenia kompleksu należy pobrać pipetą 0,5 μg DNA kodującego GFP lub GFP-CaeB do mieszaniny zawierającej odczynnik do transfekcji i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Transfekować komórki, dodając mieszaninę reakcyjną kroplami i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 24 godziny.
6. Dodać 1 mg/ml genetycyny w celu selekcji klonów GFP dodatnich w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
7. Po 6 dniach wyizolować pojedyncze komórki metodą cytometrii przepływowej, sortując w 96-dołkowej płytce zawierającej pożywkę i supernatant HEK293 w stosunku 1:1. Wygeneruj supernatant HEK293 z hodowanych, zlewających się komórek HEK293, które odwirowywano przez 15 minut przy 4,966 x g.
8. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą 1,5 mg/ml genetycyny. Zmieniaj media raz w tygodniu. Jeśli komórki tworzą zlewającą się monowarstwę, przenieś je na 24-dołkową płytkę. Hoduj komórki dwa razy w tygodniu w stosunku 1:5 w pożywce zawierającej 1,5 mg/ml genetycyny. Na koniec przeanalizuj procent komórek GFP-dodatnich za pomocą analizy immunoblot i cytometrii przepływowej.

2. Analiza stabilnych linii komórkowych za pomocą analizy immunoblot

1. Usunąć supernatant i przemyć przylegające komórki ciepłym PBS. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 2x buforu do próbek Laemmli, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Załaduj około 4 x 10⁴ komórek na próbkę na 12% żel SDS-PAGE. Dodatkowo załaduj 6 μl komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele w systemie elektroforezy żelowej pod stałym napięciem 180 V przez 45-60 minut z 1x buforem roboczym Laemmli.
3. Osusz białka na błonach PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut za pomocą półsuchej komórki transferowej Trans-Blot SD.
4. Zablokuj błony w 10 ml 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS/0,05% Tween 20 (MPT) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Rozcieńczyć 4 μl przeciwciała anty-GFP w 4 ml MPT i inkubować błony O/N w temperaturze 4 °C.
6. Wykonaj trzy 10-minutowe kroki mycia za pomocą 10 ml PBS/0,05% Tween 20.
7. Inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową w 4 ml MPT.
8. Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 2.6) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe.

3. Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

1. Ponowne zawieszanie komórek w PBS. Użyj komórek HEK293 jako kontroli negatywnej, aby dostosować rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), tak aby komórki były w skali. Narysuj bramę na żywych komórkach, wykluczając dublety komórek, agregaty i szczątki komórek.
2. Dostosuj wzmocnienie lampy fotopowielacza (PMT) tak, aby niebarwione komórki znajdowały się po lewej stronie histogramu kanału FL1 (laser argonowy 488 nm).
3. Aby przeanalizować intensywność fluorescencji komórek HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB, otwórz histogram kanału FL1 i uzyskaj 10 000 zdarzeń w populacji bramkowanej.
4. Analizuj dane za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy FACS.

4. Transfekcja stabilnej linii komórkowej za pomocą indukowalnego systemu wektorów ekspresyjnych

1. Nasiona komórek HEK293 stabilnie eksprymujących GFP lub GFP-CaeB w 12-dołkowej płytce o gęstości 1 x 10⁵ komórek / dołek.
2. 19 godzin po wysiewie, współtransfekuj komórki plazmidem regulatorowym i plazmidem odpowiedzi kodującym Bax lub aktywowaną kaspazę 3.
   1. Kotransfekcja stabilnych komórek HEK293 ze 100 ng plazmidu regulatorowego pWHE125-P (ryc. 2) i 100 ng plazmidów odpowiedzi pWHE655-hBax lub pWHE655-revCasp3 (ryc. 3) i 0,4 μl polietylenininy.
   2. Przygotować odczynnik do transfekcji DNA i polietyleninominy w 75 μl pożywki Opti-MEM i inkubować dokładnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W celu uzyskania złożonego tworzenia należy inkubować obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodawać kroplami roztwór polietyleniny/DNA do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .

5. Indukcja apoptozy

1. 5 godzin po transfekcji indukować ekspresję białek proapoptotycznych poprzez dodanie 1 μg / ml doksycykliny do pożywki hodowlanej. Inkubować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .

6. Analiza apoptozy komórek gospodarza za pomocą analizy immunoblot

1. Przed pobraniem należy sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy nie doszło do indukcji śmierci komórki. Komórki apoptotyczne są wykrywalne przez obecność ciał apoptotycznych otaczających umierającą komórkę.
2. Usunąć supernatant i przemyć przylegające komórki ciepłym PBS. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 2x buforu do próbek Laemmli, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Załaduj około 4 x 10⁴ komórek na próbkę na 12% żel SDS-PAGE. Dodatkowo załaduj 6 μl komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele w systemie elektroforezy żelowej pod stałym napięciem 180 V przez 45-60 minut z 1x buforem roboczym Laemmli.
4. Osusz białka na błonach PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut za pomocą półsuchej komórki transferowej Trans-Blot SD.
5. Zablokuj błony w 10 ml 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS/0,05% Tween 20 (MPT) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Rozcieńczyć 4 μl przeciwciała przeciwko rozszczepieniu polimerazy poli ADP-rybozy (PARP) w 4 ml MPT i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
7. Wykonaj trzy 10-minutowe kroki mycia za pomocą 10 ml PBS/0,05% Tween 20.
8. Inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową rozcieńczonych w 4 ml MPT.
9. Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (jak opisano w ppkt 6.7) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe.
10. Usunąć związane przeciwciała przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z 7 ml buforu do usuwania Western Blot.
11. Po trzech przemyciach PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 6.7), zbadać błony za pomocą 4 μl przeciwciała antyaktynowego w 4 ml MPT O/N w temperaturze 4 °C.
12. Po trzech etapach przemywania MPT (jak opisano w ppkt 6.7), inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową rozcieńczonych w 4 ml MPT.
13. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 6.7) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe.
    Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji przeprowadzono na wytrząsarce płytkowej przez wskazany czas i temperaturę.

Po pierwsze, ustanowiono linie komórkowe HEK293 stabilnie wyrażające interesujące białko (CaeB) jako białko fuzyjne GFP. Jako kontrolę wygenerowano również linie komórkowe HEK293 stabilnie eksprymujące GFP. Ekspresję GFP i GFP-CaeB zweryfikowano za pomocą analizy immunoblot. Reprezentatywny immunoblot (ryc. 4A) wykazuje stabilną i wyraźnie wykrywalną ekspresję GFP i GFP-CaeB. Jednak ten test nie może określić, czy wszystkie komórki wyrażają GFP czy GFP-CaeB. W związku z tym stabilnie transfekowane linie komórkowe HEK293 analizowano również za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na rysunku 4B, ponad 90% komórek w obu liniach komórkowych wyrażało GFP. W ten sposób te stabilne linie komórkowe mogą być wykorzystane do dalszej analizy funkcji CaeB. W kolejnym kroku aktywność antyapoptotyczną CaeB oznaczono za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała przeciwko rozszczepionemu PARP. Proteolityczne rozszczepienie jądrowego PARP dezaktywuje aktywność naprawczą DNA i jest typowym markerem końcowych etapów apoptozy. Rozszczepienie PARP nie jest wykrywane w komórkach HEK293-GFP lub HEK293-GFP-CaeB, co pokazuje, że ani ekspresja GFP, ani GFP-CaeB nie jest toksyczna dla komórek. Jednakże, gdy komórki były traktowane staurosporyną, silnym induktorem wewnętrznej apoptozy, wykryto rozszczepienie PARP (ryc. 5). Co ważne, komórki HEK293-GFP-CaeB wykazują zmniejszone rozszczepienie PARP, co wskazuje na aktywność antyapoptotyczną białka efektorowego układu wydzielania Coxiella burnetii typu IV CaeB7.

Aby przeanalizować, na którym etapie CaeB zakłóca szlak apoptozy, zastosowano system Tet-On. Szczegółowo, komórki HEK293-GFP lub HEK293-GFP-CaeB transfekowano plazmidem regulatorowym konstytutywnie wyrażającym konstytutywnie kontrolowaną przez doksycyklinę konfigurację podwójnego represora / aktywatora (Figura 2) i plazmidem odpowiedzi pTRE kodującym albo ludzki Bax na pełnej długości, albo aktywowaną formę ludzkiej kaspazy 3, zwaną revCasp 3 (Figura 3). System ten jest ściśle regulowany, o czym świadczy brak rozszczepienia PARP w warunkach nieindukujących (ryc. 6). Dodanie doksycykliny do transfekowanych komórek spowodowało ekspresję Bax lub revCasp 3. Jeśli CaeB zakłóca szlak apoptotyczny za Bax, wówczas sygnał apoptotyczny generowany przez ekspresję i późniejszą aktywację Bax powinien być zablokowany przez ekspresję CaeB. Rzeczywiście, komórki HEK293 stabilnie eksprymujące GFP-CaeB głęboko hamują indukcję apoptozy przez kontrolowaną przez doksycyklinę ekspresję Bax, podczas gdy komórki HEK293-GFP wykazywały oczywiste rozszczepienie PARP. Wynik ten wskazuje, że CaeB blokuje indukcję apoptozy po aktywacji Bax. Następnie przeanalizowano, czy CaeB może zakłócać aktywację kaspazy 3 – późne zdarzenie w szlaku apoptozy. Komórki HEK293-GFP, a także komórki HEK293-GFP-CaeB, wykazują rozszczepienie PARP (ryc. 6), co wskazuje, że po aktywacji kaspazy efektorowej 3 CaeB nie może zapobiec wystąpieniu apoptozy. Podsumowując, dane te pokazują, że CaeB działa między aktywacją Bax i kaspazy 3.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd systemu regulacyjnego tetracykliny. System Tet-On składa się z dwóch różnych plazmidów, plazmidów regulatorowych i odpowiedziowych. Plazmid regulatorowy koduje transtłumik reagujący na Tet (tTS; wypełniony okrąg) i reagujący na Tet transaktywator wsteczny (rtTA, otwarty okrąg). Oba białka ulegają konstytutywnej ekspresji pod kontrolą silnego, konstytutywnego czynnika wydłużenia-1 promotora alfa (PEF-1a). TTS i rtTA są chimerycznymi czynnikami transkrypcyjnymi składającymi się z eukariotycznej transkrypcyjnej domeny regulacyjnej (odpowiednio tłumika lub aktywatora) i bakteryjnego represora tetracykliny (TetR). TetR pośredniczy w wiązaniu DNA z siedmioma sekwencjami operatora tet (tetO) na plazmidzie odpowiedzi. TetO znajduje się przed indukowalnym minimalnym promotorem wirusa cytomegalii (PCMV), razem tworząc element reagujący na Tet (TRE). W warunkach nieindukujących tTS jest związany z TRE zapobiegającym ekspresji. Po dodaniu doksycykliny (Dox; diament wypełniony), rtTA oddziałuje z Dox, prowadząc do zmian konformacyjnych i aktywacji. Aktywowany rtTA zastępuje tTS na plazmidzie odpowiedzi, umożliwiając transkrypcję odpowiednich genów docelowych Bax i kaspazy 3, prowadząc w ten sposób do indukcji apoptozy i śmierci komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schematyczny przegląd plazmidu regulatorowego pWHE125. Wyświetlane są elementy niezbędne do namnażania się w bakteriach, w tym pochodzenie replikacji (ori pBR) i kaseta oporności na antybiotyki przeciwko ampicylinie (AmpR) oraz do ekspresji transregulatorów Tet, takich jak silny, konstytutywny natychmiastowy wczesny promotor/wzmacniacz ludzkiego wirusa cytomegalii (P/EhCMV), wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów wirusa polio (PV-IRES) i miejsce poliA wirusa Simian 40 (SV40 polyA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Schematyczny przegląd plazmidu odpowiedzi. Pierwiastki niezbędne do namnażania się w bakteriach, w tym pochodzenie replikacji (ori pBR) i kasety oporności na antybiotyki (AmpR), oraz do indukowanej ekspresji u eukariontów, takie jak kaseta ekspresji transgenu z zależnym od Tet minimalnym promotorem TREtight (PTREtight), gen będący przedmiotem zainteresowania człowieka Bax (hBax) i miejsce poliA wirusa małpiego 40 (SV40 polyA). Kaseta ekspresji transgenu jest otoczona tandemowymi bezpośrednimi powtórzeniami dwóch kopii sekwencji rdzenia izolatora HS4 kurczaka (rdzeń HS4). Dodatkowo występuje kaseta oporności na G418 składająca się z promotora mysiej kinazy fosfoglicerynianowej 1 (PmPGK), genu oporności na neomycynę (G418R) i miejsca poliA ludzkiej kinazy tymidynowej (TK polyA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB stabilnie eksprymują białka zielonej fluorescencji. (A) Lizaty całokomórkowe komórek HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB poddano immunobloblowizacji pod kątem GFP, aby wykazywały stabilną ekspresję. (B) Wykazano, że analiza reprezentatywnej cytometrii przepływowej (FACS) komórek HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB wykazuje intensywność ekspresji GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Wpływ ekspresji GFP-CaeB na apoptozę wywołaną przez staurosporynę. Komórki HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB traktowano staurosporyną 4 μM przez 6 godzin w celu wywołania wewnętrznej apoptozy. Apoptozę analizowano za pomocą rozszczepionej analizy immunoplam PARP. Rozszczepienie PARP było zmniejszone w komórkach HEK293-GFP-CaeB w porównaniu z komórkami HEK293-GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Wykorzystanie systemu TetOn w celu zawężenia punktu działania CaeB. (A) Apoptoza została wywołana przez ekspresję Bax w komórkach HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB. Apoptozę analizowano za pomocą rozszczepionej analizy immunoplam PARP. Rozszczepienie PARP było zmniejszone w komórkach HEK293-GFP-CaeB w porównaniu z komórkami HEK293-GFP. (B) Apoptoza została wywołana przez ekspresję revCasp 3 w komórkach HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB. Apoptozę analizowano za pomocą rozszczepionej analizy immunoplam PARP. Rozszczepienie PARP było porównywalne w komórkach HEK293-GFP-CaeB i HEK293-GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.