Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Podsumowanie

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Streszczenie

Indukcja fosforylowanej kinazy regulowanej zewnątrzkomórkowo (pERK) jest wiarygodnym molekularnym odczytem aktywacji neuronów zależnej od uczenia się. W tym miejscu opisujemy protokół immunohistochemiczny pERK w celu zbadania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia się przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. W szczególności zastosowaliśmy barwienie immunologiczne pERK do badania aktywacji neuronów po labiryncie wodnym Morrisa (MWM, klasyczne zadanie uczenia się zależne od hipokampa) u myszy z nokautem Engrailed-2 (En2^-/-), modelu zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD). W porównaniu z kontrolami typu dzikiego (WT), myszy En2^-/- wykazywały znaczne deficyty uczenia się przestrzennego w MWM. Po MWM wykryto znaczące różnice w liczbie neuronów pERK-dodatnich w określonych subpolach hipokampa myszy En2^-/- w porównaniu ze zwierzętami WT. W ten sposób nasz protokół może solidnie wykrywać różnice w neuronach pERK-dodatnich związanych z zaburzeniami uczenia się zależnymi od hipokampa w mysim modelu ASD. Mówiąc bardziej ogólnie, nasz protokół może być zastosowany do zbadania profilu aktywacji neuronów hipokampa zarówno w genetycznych, jak i farmakologicznych modelach myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Wprowadzenie

Zaburzenia neurorozwojowe obejmują szeroką i niejednorodną grupę zaburzeń, takich jak zespół Downa, zespół łamliwego chromosomu X (FXS), zespół Retta, nerwiakowłókniakowatość, stwardnienie guzowate i ASD, w których rozwój i dojrzewanie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest zaburzone we wczesnym okresie prenatalnym¹. Te rozwojowe dysfunkcje mózgu mogą powodować głęboki, trwający całe życie wpływ na funkcje motoryczne, język, proces uczenia się i zapamiętywania. W ciągu ostatnich kilku lat w patogenezę zaburzeń neurorozwojowych zaangażowanych jest mnóstwo czynników genetycznych i środowiskowych^2,3. Nawet jeśli mechanizmy molekularne leżące u podstaw fenotypu klinicznego pozostają nieznane, wyżej wymienione odkrycia pozwoliły na opracowanie kilku mysich modeli tych zaburzeń. Deficyty uczenia się i pamięci zostały zidentyfikowane w wielu z tych modeli myszy, takich jak myszy Tsc1 ^+/-, Tsc2 ^+/-, Nf1 ^+/- i En2^{-/- 2,4-7}. Ważnym wyzwaniem w dziedzinie zaburzeń neurorozwojowych jest identyfikacja procesów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw dysfunkcji pamięci i uczenia się. Wybrane szlaki sygnałowe aktywowane podczas uczenia się lub zapamiętywania mogą indukować transkrypcję określonych genów i ostatecznie prowadzić do syntezy białek de novo. Aktywacja natychmiastowo wczesnych genów (IEG) i zależne od białka modyfikacje synaptyczne są szybko indukowane w neuronach mózgu w odpowiedzi na aktywność neuronalną i trening behawioralny^8,9.

Deficyty w szlakach sygnałowych związanych z neurofibrominą zostały związane z upośledzeniem uczenia się w zaburzeniach neurorozwojowych. Neurofibromina jest produktem genu NF1, którego mutacja powoduje nerwiakowłókniakowatość typu 1, złożony zespół genetyczny charakteryzujący się nowotworami układu nerwowego, opóźnieniami behawioralnymi i motorycznymi oraz niepełnosprawnością poznawczą¹⁰. Myszy heterozygotyczne pod względem delecji Nf1 ograniczonej do neuronów hamujących wykazują deficyty we wczesnej fazie długoterminowego wzmocnienia (LTP), a także upośledzone uczenie się przestrzenne w MWM^5,11,12. Co ciekawe, niedobór Nf1 w tym modelu myszy prowadzi do nadmiernej aktywacji sygnalizacji Ras w interneuronach hamujących podczas uczenia się, co skutkuje zwiększoną fosforylacją ERK i ostatecznie nieprawidłowym wzmocnieniem uwalniania GABA z tych neuronów⁵.

Na podstawie tych wyników, wizualizacja aktywności neuronalnej po zadaniach behawioralnych stanowi sposób na rekonstrukcję specyficznych obwodów związanych z chorobami neurorozwojowymi. Opisany tutaj protokół immunohistochemiczny ma na celu ocenę i ilościowe określenie poziomów fosforylacji ERK w hipokampie po MWM w mysim modelu ASD z deficytami poznawczymi. MWM jest szeroko stosowany do badania zależnego od hipokampa uczenia się przestrzennego i pamięci u gryzoni^13,14. Zdecydowaliśmy się użyć fosforylacji ERK jako molekularnego odczytu zależnego od zadania uczenia się hipokampa, ponieważ wykazano, że ERK odgrywa istotną rolę w uczeniu się i tworzeniu pamięci¹⁵. Co więcej, szlak ERK jest niezbędny do plastyczności zależnej od doświadczenia w rozwijającej się korze wzrokowej¹⁶. Wreszcie, myszy pozbawione jednej z dwóch izoform ERK (ERK2) w OUN wykazują wyraźne anomalie w zachowaniach poznawczych, emocjonalnych i społecznych¹⁷, co wskazuje, że sygnalizacja ERK może odgrywać kluczową rolę w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak ASD.

Użyliśmy myszy Engrailed 2 z nokautem (En2^-/-) jako modelu zaburzeń neurorozwojowych. Myszy En2^-/- wykazują cechy anatomiczne i behawioralne "podobne do ASD", w tym utratę interneuronów przodomózgowia¹⁸, zmniejszoną ekspresję genów związanych z ASD¹⁹, zmniejszoną towarzyskość i upośledzoną elastyczność poznawczą^6,7,20. Defekty uczenia się przestrzennego i pamięci, takie jak te wykryte w MWM, są szczególnie silne u myszy En2^{-/- 6,7} i mogą mieć znaczenie dla zaburzeń poznawczych obserwowanych u pacjentów z ASD²¹. Ponadto wykazaliśmy, że upośledzone uczenie się przestrzenne w MWM wiąże się ze zmniejszoną ekspresją neurofibrominy i zwiększonym poziomem pERK w wnęce En2^-/-dorosłych myszy⁷. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół immunohistochemicznej charakterystyki pERK po MWM w tym mysim modelu ASD.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Wspólnoty Europejskiej 2010/63/UE i zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia.

1. Opieka nad zwierzętami, trzymanie i leczenie

1. Wykonaj wszystkie protokoły eksperymentalne na myszach zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucji opieki nad zwierzętami.
2. Utrzymuj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z jedzeniem i wodą dostępnymi ad libitum.
3. Trzymaj myszy w grupach po 2-4 osoby, w standardowych klatkach dla myszy z poliwęglanu z trocinami i materiałem ściółkowym zmienianym co tydzień.
4. Używaj myszy dopasowanych pod względem wieku i płci, ponieważ podatność na choroby może się różnić w zależności od wieku i płci w różnych mysich modelach zaburzeń neurorozwojowych.
5. Wybierz odpowiednią liczbę zwierząt, aby osiągnąć istotność statystyczną (minimum 10 myszy na genotyp w badaniu behawioralnym i 4 myszy na genotyp w eksperymencie immunohistochemicznym).

2. Wodny labirynt Morrisa (MWM)

1. Użyj okrągłego zbiornika (średnica 100 cm, wysokość 50 cm).
   1. Umieść kilka wizualnych wskazówek na przegrodach pomieszczeń wokół zbiornika.
   2. Umieść platformę o średnicy 10 cm w zbiorniku w stałym miejscu pośrodku jednego z czterech wyimaginowanych kwadrantów. Utrzymuj ukrytą platformę w tej samej ćwiartce dla wszystkich prób we wszystkich sesjach treningowych.
   3. Napełnij basen wodą z kranu, aż platforma znajdzie się 1 cm nad powierzchnią wody. Temperatura wody w równowadze powinna być bliska 22 °C; Ten krok może potrwać kilka godzin. Dodaj gorącą wodę, aby skrócić czas potrzebny do zrównoważenia temperatury wody.
   4. Dodaj około 1,5-2 l białej, nietoksycznej farby, aby woda była nieprzezroczysta.
2. Procedura nabycia toru
   1. Skonfiguruj system śledzenia MWM ze standardowymi kamerami CCD i kartami wideo. Wybierz system śledzenia wideo, aby monitorować i analizować kilka zmiennych, takich jak długość ścieżki, opóźnienie ucieczki i czas spędzony w każdym kwadrancie.
   2. Podziel arenę na cztery ćwiartki i dostosuj ustawienia wykrywania, aby zapewnić optymalny kontrast między zwierzętami a tłem do śledzenia na żywo.
   3. Określ region platformy.
   4. Ustaw maksymalny czas próby na 60 sekund.
3. Testowanie MWM
   1. Przed testami behawioralnymi pozwól myszom na okres adaptacji trwający 20-25 minut w obszarze, w którym nie widzą basenu lub wskazówek przestrzennych.
   2. Trenuj każdą mysz przez 9 dni (dwie kolejne próby dziennie, z 20-30 minutową przerwą między nimi).
   3. Włącz komputer i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie systemu śledzenia wideo.
   4. Chwyć mysz za ogon i umieść ją w wodzie, z głową skierowaną w stronę basenu, zaczynając od jednej z czterech pozycji startowych (północ, południe, wschód, zachód). Dla każdej myszy pozycja początkowa powinna być inna i pseudolosowa we wszystkich próbach.
   5. Pozwól myszy pływać i szukać platformy przez maksymalnie 60 sekund. Gdy zwierzę dotrze do platformy, pozwól mu pozostać na platformie przez 20 sekund.
   6. Jeśli mysz nie zdoła zlokalizować platformy w tym czasie, delikatnie poprowadź mysz do platformy, trzymając ją za ogon i pozwól jej pozostać tam przez 20 sekund. Gdy zwierzę zakończy wszystkie dwie próby, osusz je ręcznikiem i włóż z powrotem do klatki.
   7. Każdego dnia okresu treningowego powtarzaj tę samą procedurę (kroki 2.3.4-2.3.6).
   8. Wykonaj test sondy w 9 dniu po ostatniej ścieżce treningowej.
   9. Usuń platformę z basenu.
   10. Pozwól myszy pływać i szukać platformy przez maksymalnie 60 sekund.
   11. Okresowo sprawdzaj temperaturę wody, aby była taka sama (22 °C) i czyść basen.

3. Przygotowanie sekcji z perfekcji zwierząt

1. Poświęć myszy na końcu MWM. Cztery myszy z każdego genotypu muszą zostać znieczulone przed eutanazją zgodnie z lokalnymi i międzynarodowymi wytycznymi.
2. Perfuzję zwierzęcia przezsercowo (przeciąć prawe małżowinę uszną nożyczkami, aby umożliwić krwawienie i wprowadzić kaniulę motylkową do lewej komory w celu perfuzji) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez 4-5 minut, a następnie 4% paraformaldehydem w PBS przez 10-15 minut²².
3. Wypreparować i utrwalić mózgi w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin.
4. Umieścić mózgi w 50 ml polistyrenowych probówkach stożkowych zawierających 15 ml 0,02% azydku sodu w 0,1 M PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to konieczne do pokrojenia.
5. Wytnij i usuń móżdżek przed cięciem wibratomem.
6. Przyklej mózg pionowo z miejscem cięcia, używając superglue, do płytki mocującej wibratomu.
7. Pokrój mózg na odcinki koronalne o grubości 20-40 μm, w kolejności szeregowej w całym grzbietowym hipokampie, na odpowiednim wibratomie.
8. Zebrać plastry wibratomu za pomocą pędzla malarskiego i przenieść na 24 płytki wielodołkowe zawierające 1 ml 0,1 M PBS na każdą studzienkę.
9. Skrawki należy przechowywać przez krótki czas w PBS lub długoterminowo w 0,02% azydku sodu w PBS w temperaturze 4 ºC (tkanka może być używana przez okres do jednego roku).

4. Immunohistochemia

1. Przenieś 3-5 grzbietowych odcinków hipokampa dla każdej myszy do 24 płytek wielodołkowych zawierających 500 μl 0,1 M PBS dla każdej studzienki.
2. Skrawki znajdujące się w każdej studzience przemyć 500 μl 0,1 M PBS (5 min, 3 razy delikatnie wstrząsając).
3. Stłumić aktywność endogennej peroksydazy przez inkubację skrawków w 1%_H2O2w PBS przez 20 minut z delikatnym mieszaniem.
4. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
5. Permeabilizacja tkanek: inkubować skrawki przez 5 minut w 0,2% Triton X-100 w PBS.
6. Podczas powyższych kroków (4.4; 4.5) należy przygotować wystarczającą ilość buforu blokującego (10% surowicy koziej i 0,1% Triton-X100 w PBS) na cały eksperyment (liczba sekcji x 100 μl x 3 kroki).
7. Uwaga: Użyj surowicy tego samego gatunku, w której wyprodukowano drugorzędowy Ab (sprzężony z biotyną).
8. Zapobiegać niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała, inkubując skrawki w buforze blokującym (100 μl/sekcję) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym mieszaniem.
9. Inkubować skrawki w pierwotnym Ab (pERK) rozcieńczone w buforze blokującym, przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
10. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
11. Inkubować z drugorzędowym Ab sprzężonym z biotyną (1:250) rozcieńczonym w buforze blokującym (takim samym, jak użytym w kroku 4.6) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
12. Przygotuj odczynnik ABC w tym samym czasie, ponieważ Avidin i biotyna wymagają co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej do stworzenia.
13. Przygotować wymaganą objętość odczynnika ABC zgodnie z protokołem producenta.
14. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
15. Inkubować sekcje przez 45 minut w temperaturze pokojowej z odczynnikiem ABC.
16. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
17. Przygotuj roztwór roboczy DAB, każdy krok związany z DAB musi być wykonany w dygestorium, ponieważ DAB jest rakotwórczy i teratogenny.
18. Przenieś roztwór DAB na nową płytkę za pomocą plastikowej pipety transferowej.
19. Umieść sekcje na płytce zawierającej roztwór roboczy DAB i powoli obracaj płytką ręcznie, aby umożliwić maksymalne narażenie na sekcje.
20. Monitoruj reakcję DAB pod mikroskopem, aż do uzyskania odpowiedniego sygnału (2-5 min).
21. Zatrzymaj reakcję przy pożądanej intensywności koloru, przemywając tkankę w 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Użyj wybielacza, aby dezaktywować pozostały roztwór substratu DAB w dygestorium na noc i zutylizować go zgodnie z wytycznymi laboratoryjnymi.
23. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną, unosząc się w PBS. Następnie susz je w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3-4 godziny.
24. Odwodnić skrawki kolejno w 50%, 70%, 95% i 100% etanolu przez 2 minuty każda, a następnie oczyścić w 100% ksylenie przez 5 minut.
25. Szkiełko nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego i pozostawić na noc w dygestorii do wyschnięcia.

5. Liczba komórek

1. Policz komórki pERK-dodatnie, na każde zwierzę należy przeanalizować od trzech do pięciu sekcji na poziomie grzbietowego hipokampa.
2. Uzyskaj wiele obrazów w jasnym polu z każdej sekcji przy 200-krotnym powiększeniu za pomocą odpowiedniego mikroskopu, a następnie zmontuj je za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
3. Wykonuj zliczanie komórek na obrazach mozaiki przekonwertowanych za pomocą formatu TIFF za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ.
4. Policz komórki barwione pERK w warstwie komórek wnęki i granulki w dwóch do trzech pudełkach liczących po 100 × 100 μm każde.
5. Gęstości komórek będą wyrażone jako liczba oznakowanych komórek w oknie zliczania (100 × 100 μm).
6. Przeprowadź analizę statystyczną, aby ocenić istotną różnicę między genotypami. Można to osiągnąć za pomocą testu Studenta lub ANOVA, a następnie odpowiedniego testu post hoc przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Ustaw poziom istotności statystycznej na p <0,05.

Wyniki

Opisany tutaj protokół został zaprojektowany do wizualizacji, za pomocą immunohistochemii, ekspresji specyficznego markera aktywności neuronów hipokampa po MWM w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych. Wszystkie dane eksperymentalne przedstawione w niniejszym dokumencie zostały zaczerpnięte z naszej ostatniej pracy⁷. Użyto samców i samic dorosłych rodzeństwa z miotu WT i En2^-/- w wieku 3-5 miesięcy; waga = 25-35 g) uzyskanych ze skojarzeń heterozygotycznych. Do MWM wykorzystano dwadzieścia dwie mysz...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół immunohistochemiczny pERK w celu ujawnienia aktywacji neuronów po MWM u myszy En2^-/- , mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych. Obniżone poziomy pERK wykryto w podpolu CA3 mutantów En2^-/- w porównaniu z WT. W przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano w podpolu CA3, ogólny wzrost neuronów pERK-dodatnich wykryto zarówno w wnęce, jak i GCL myszy En2^-/- w porównaniu z WT. Możliwe wyjaśnienie tego przeciwnego trendu w poziomach fosforylacji ERK może opierać ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		Ta platforma oprogramowania nie jest wymagana – na rynku dostępnych jest wiele innych programów behawioralnych.
Farba temperowa	Giotto - Fila Group Company		Biała i płynna, nietoksyczna. Służy do przygotowania nieprzezroczystej wody w labiryncie wodnym Morrisa.
Vibratome	Leica	VT1200	Można używać równoważnych modeli innych firm.
Płytka 24-dołkowa	Sigma	CLS3524
100% etanol	Fisher Scientific	A406-20	Służy do wytwarzania gradientu etanolu w celu odwodnienia przed montażem na szkiełku.
Ksylen	VWR	66004-950	Toxic - do stosowania pod maską. Zmieniaj ksylen co miesiąc w zależności od zastosowania.
Azydek sodu	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009-100ML
Normalna surowica kozia	Abcam	G9023-10ML
Zestaw ABC Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Dodać do objętości 5 ml PBS 2 krople odczynnika A, wymieszać, a następnie dodać 2 krople odczynnika B i wymieszać.
Substrat peroksydazy DAB	Vector Laboratories	SK-4100	Dodać objętość 5 ml ddH2O: 2 krople buforowego roztworu podstawowego i wymieszać; 4 krople DAB i wymieszać; 2 krople H2O2 i wymieszać.
[nagłówek]
przeciwciał pERK		4370	Rozcieńczenie 1:500
Biotynylowane kozie przeciwciała anty-królicze IgG	Vector Laboratories	BA-1000	Rozcieńczenie 1:250
Zjeżdżalnie SuperFrost	Carl Roth	1879
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma 317616		Medium montażowe do szkiełek. Można użyć równoważnego medium montażowego.
Mikroskop	Zeiss	użyć mikroskopu równoważnego	Axio Imager.M2
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		Do składania obrazów.
Oprogramowanie ImageJ	National Institute of Health		Bezpłatne oprogramowanie można pobrać ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Można korzystać z równoważnego oprogramowania do analizy statystycznej.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Można korzystać z równoważnego oprogramowania do analizy statystycznej.