Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

24.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52933

⸱

19 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Streszczenie

Neutrofile, najliczniejsze ze wszystkich białych krwinek w ludzkim krążeniu, odgrywają ważną rolę w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami. Ponadto neutrofile odgrywają kluczową rolę w nadzorze immunologicznym komórek nowotworowych. Mają zdolność rozpoznawania komórek nowotworowych i indukowania śmierci komórek nowotworowych albo poprzez mechanizm zależny od kontaktu komórkowego z udziałem nadtlenku wodoru, albo poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Neutrofile o działaniu przeciwnowotworowym można wyizolować z krwi obwodowej pacjentów z rakiem i myszy z nowotworem. Te neutrofile są nazywane neutrofilami indukowanymi przez nowotwór (TEN), aby odróżnić je od neutrofili zdrowych osób lub naiwnych myszy, które nie wykazują znaczącej aktywności cytotoksycznej guza. W porównaniu z innymi białymi krwinkami, neutrofile wykazują różną wyporność, co umożliwia uzyskanie > 98% czystej populacji neutrofili po poddaniu gradientowi gęstości. Jednak oprócz normalnej populacji neutrofili o dużej gęstości (HDN), u pacjentów z rakiem, u myszy z guzem, a także w przewlekłych stanach zapalnych, w krążeniu pojawiają się wyraźne populacje neutrofili o niskiej gęstości (LDN). LDN oczyszcza się jednocześnie z frakcją jednojądrzastą i może być oddzielany od komórek jednojądrzastych przy użyciu strategii selekcji dodatniej lub negatywnej. Po określeniu czystości wyizolowanych neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej można je wykorzystać do testów funkcjonalnych in vitro i in vivo. Opisujemy techniki monitorowania aktywności przeciwnowotworowej neutrofili, ich zdolności do migracji i wytwarzania reaktywnych form tlenu, a także monitorowania ich zdolności fagocytarnej ex vivo. Dalej opisujemy techniki znakowania neutrofili do śledzenia in vivo i określania ich zdolności przeciwprzerzutowej in vivo. Wszystkie te techniki są niezbędne do zrozumienia, jak uzyskać i scharakteryzować neutrofile o funkcji przeciwnowotworowej.

Wprowadzenie

Neutrofile początkowo były charakteryzowane jako wrodzone komórki odpornościowe, które służą jako pierwsza linia obrony przed atakującymi mikroorganizmami. Obecnie wiadomo, że neutrofile pełnią bardziej dalekosiężne funkcje, biorąc udział w narastaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko obcym antygenom1,2, regulacji hematopoezy3, angiogenezie4i gojeniu się ran5. Ponadto neutrofile mogą wpływać na wzrost guza i progresję przerzutów ze względu na swoje działanie pro- i przeciwnowotworowe6,7. Neutrofile charakteryzują się polimorficznym segmentowanym jądrem (stąd nazywanym leukocytami wielojądrzastymi (PMN)) i zawierają co najmniej trzy odrębne podklasy granulek, a także pęcherzyki wydzielnicze8 (ryc. 1A-C).

Neutrofile mają wysoką zdolność fagocytarną i wysoką aktywność oksydazy NADPH, krytyczną dla eliminacji drobnoustrojów, a także wydzielają szeroki zakres chemokin ważnych dla przyciągania dodatkowych neutrofili i innych komórek odpornościowych do miejsca zapalenia8,9. Neutrofile charakteryzują się ekspresją dużej ilości receptorów powierzchniowych, w tym receptorów Toll-podobnych (TLR), receptorów lektyny typu C (CLR), receptora dopełniacza 3 (CD11b/CD18) i innych cząsteczek adhezyjnych (np. L-selektyny, LFA-1, VLA-4 i cząsteczki adhezyjnej komórek związanych z antygenem rakotwórczym 3 (CEACAM3/CD66b)), receptorów chemokiny (np. CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), receptorów chemoatraktantu (np. PAFR, LTB4R i C5aR), receptory cytokin (np. G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), receptory peptydowe formylu (np. FPR1-3) i receptory Fc (np. CD16 (FcγRIII), CD32 (FcγRII) i CD64 (FcγRI)10. U myszy neutrofile są zwykle identyfikowane jako CD11b + Ly6G +, podczas gdy neutrofile ludzkie są identyfikowane za pomocą markerów leukocytów CD11b, CD15, CD16 i CD66b. Ogólnie przyjmuje się również barwienie białek ziarnistych, mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE) w celu wykrycia neutrofili w tkankach.

Nadal nie jest jasne, czy różne funkcje neutrofili są pośredniczone przez tę samą komórkę, czy przez różne subpopulacje komórek. Coraz więcej danych wskazuje na obecność heterogenicznej populacji neutrofili, która wykazuje wysoki stopień plastyczności, na który wpływ mają bodźce prozapalne i mikrośrodowisko11,12. Fridlender i wsp.13 z grubsza podzieliło neutrofile w raku na dwie główne subpopulacje określane jako N1 o właściwościach przeciwnowotworowych i N2 o właściwościach pronowotworowych. W raku, a także w przewlekłym zapaleniu, istnieje dodatkowa subpopulacja złożona z granulocytarnych komórek supresorowych pochodzących z mieloidu (G-MDSC), które hamują odpowiedzi limfocytów T14. G-MDSC są uważane za niedojrzałe komórki szpikowe charakteryzujące się fenotypem CD11b + Ly6Co niskimpoziomie Ly6Ghi u myszy15, podczas gdy mająniski fenotyp CD15 + / CD16 u człowieka16. G-MDSC wyrażają wyższe poziomy arginazy i mieloperoksydazy, podczas gdy niższe poziomy cytokin i chemokin niż normalne krążące neutrofile. Są mniej fagocytarne i migrujące, ale wytwarzają wyższe poziomy ROS15,17,18. W niniejszej pracy przedstawimy podstawowe metodologie izolacji i charakterystyki neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych.

Podczas gdy neutrofile stanowią największą populację wszystkich białych krwinek w ludzkim krążeniu (45 - 70%; 1,800 - 6,000/μl), u myszy, w normalnych warunkach, są one raczej rzadkie (10 - 15%; 300 - 500/μl). Liczba granulocytów obojętnochłonnych wzrasta stopniowo po wystąpieniu stanu zapalnego, a czasami w przypadku raka, który reprezentuje stan przewlekłego stanu zapalnego7. Neutrofile rozwijają się z multipotencjalnych komórek prekursorowych szpiku (CMP) w szpiku kostnym w procesie różnicowania, przechodząc przez etapy mieloblastów (MB), promielocytów (PM), mielocytów (MC), metamielocytów (MM) i komórek pasmowych (BC)8. Dojrzałe, postmitotyczne neutrofile mogą pozostawać w szpiku kostnym przez 4 - 7 dni, zanim zostaną uwolnione do krążenia8. Obrót neutrofili we krwi jest zwykle szybki ze średnim okresem półtrwania wynoszącym 6 - 12 godzin, który może się wydłużyć w stanach zapalnych. Niestymulowane neutrofile mają ograniczoną aktywność przeciwnowotworową, cechę, którą można nabyć poprzez wystawienie naiwnych neutrofili na działanie chemokin IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 i CXCL56,19 lub sztucznie, poprzez wystawienie ich na działanie estru forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA)6.

Krótki okres półtrwania neutrofili we krwi wraz z niską liczbą neutrofili (~ 3 - 5 x 105) osiągniętą z 1 ml krwi naiwnej myszy w wieku 6 - 8 tygodni, utrudniły zbadanie funkcji krążących neutrofili myszy in vitro. Aby przezwyciężyć tę trudność, wykorzystano inne źródła. Na przykład dużą liczbę neutrofili można uzyskać ze szpiku kostnego20 lub otrzewnej po indukcji jałowego stanu zapalnego (np. po dootrzewnowym wstrzyknięciu bulionu tioglikolanowego lub Zymosanu A). Należy zauważyć, że neutrofile uzyskane z jamy otrzewnej nie wykazują żadnej aktywności przeciwnowotworowej (obserwacja niepublikowana).

Granot et al. 6 zaobserwowało, że myszy BALB / c zaszczepione ortotopowo mysią linią komórkową raka piersi 4T1 rozwijają neutrofilię, która pogarsza się wraz z progresją guza6 (Figura 2A), tak że 20 - 40 milionów neutrofili krwi można łatwo wyizolować z 1 ml krwi 3-4 tygodnie po inokulacji guza. Te neutrofile uzyskały działanie przeciwnowotworowe i w związku z tym zostały ukute jako neutrofile indukowane przez guz (TEN), w celu odróżnienia ich od naiwnych neutrofili6 (Figura 2B). Podczas gdy neutrofile o dużej gęstości (HDN, Figura 1A) są wysoce przeciwnowotworowe, neutrofile o niskiej gęstości (LDN, Figura 1B) generowane w kontekście raka nie są21. Również neutrofile o dużej gęstości ze szpiku kostnego i śledziony myszy z guzem mają działanie przeciwnowotworowe (dane niepublikowane). Należy zauważyć, że wraz z postępem guza śledziona ulega stopniowemu powiększeniu (splenomegalia), wraz ze wzrostem ilości neutrofili.

Należy zauważyć, że TEN jest również generowany w innych modelach raka, w tym zarówno spontanicznych (MMTV-PyMT i MMTV-Wnt1 guzy sutka oraz nowotwory płuc napędzane przez k-Ras), jak i wstrzykiwanych (komórki raka piersi AT-3 (MMTV-PyMT) i E0771, komórki raka płuc Lewisa LLC i komórki czerniaka B16-F10). Jednak zakres mobilizacji neutrofili w tych modelach nowotworowych jest znacznie mniejszy niż u myszy zaszczepionych 4T1, osiągając 5 - 10 x 106 neutrofili w 1 ml krwi po 3 tygodniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta: 5-7 tygodniowe myszy BALB/c są kupowane w Harlan (Izrael). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego (IACUC). Próbki ludzkie: Pobieranie krwi od pacjentów z rakiem i zdrowych ochotników zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Centrum Medycznego Hadassah (IRB).  

1. Indukcja neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych in vivo przy użyciu mysiego modelu raka piersi.

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane przy użyciu sterylnych roztworów w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza (LAF).

  1. Wysiew 5 x 105 komórek 4T1 na 100 mm płytce do hodowli tkankowej w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 4,5 g/l D-glukozy uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM D-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml siarczanu streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% CO2 przez 3 do 4 dni. Upewnij się, że komórki są w 50 - 100% zlewające się w dniu eksperymentu.
  2. Aby odłączyć komórki nowotworowe od płytki do hodowli tkankowej, należy odessać pożywkę hodowlaną, przemyć komórki 5 ml PBS, odessać PBS i dodać 3 ml roztworu trypsyny o stężeniu 2,5 g/l. Inkubować komórki przez 2 - 3 minuty z trypsyną w temperaturze 37 °C.
  3. Dodaj 10 ml pożywki zawierającej surowicę, aby zneutralizować trypsynę i pipetuj w górę iw dół, aż wszystkie komórki zostaną odłączone. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę, pozostawiając 200 μl pożywki powyżej osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości i dodać 10 ml PBS. Odwróć probówkę 2-3 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek i wyjmij 10 μl, aby policzyć komórki w hemocytometrze. Użyj błękitu trypanowego, aby odróżnić żywe i martwe komórki.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i ponownie zawiesić komórki w PBS w końcowym stężeniu 2 x 106 komórek/ml. Upewnij się, że zawiesina pojedynczej komórki nie ma zbrylania.
  6. Wstrzyknąć 1 x 106 komórek 4T1 lub komórki 4T1 wykazujące ekspresję lucyferazy w 50 μl PBS ortotopowo do lewej pachwinowej poduszeczki tłuszczowej sutka samic myszy BALB/c za pomocą strzykawki o pojemności 0,3 ml z igłą 30G x 8mm.
    1. Przed wstrzyknięciem znieczulij myszy w komorze indukcyjnej, otrzymując powolny przepływ izofluranu (3 - 5%) w 100% tlenu.
    2. Połóż mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej i upewnij się, że głowa jest prawidłowo umieszczona w stożku nosowym z izofluranem. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc łapę. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Ogolić włosy wokół miejsca wstrzyknięcia i zdezynfekować 70% EtOH.
    3. Za pomocą sterylnego zestawu narzędzi chirurgicznych wykonać małe poziome nacięcie (5 mm) mniej więcej w połowie odległości między sutkami pachwinowymi i brzusznymi, odsłonić poduszeczkę tłuszczową i wstrzyknąć 1 x 106 komórek 4T1 w 50 μl. Zamknij nacięcia klipsami 9 mm, które należy usunąć tydzień później. Wstrzyknięcie komórek wykazujących ekspresję lucyferazy umożliwia monitorowanie wielkości guza i przerzutów za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.
      UWAGA: Ta małoinwazyjna procedura nie wymaga żadnego leczenia pooperacyjnego, a wstrzyknięte myszy wracają do zdrowia w ciągu 2 - 3 minut.
    4. Monitoruj myszy, aż odzyskają przytomność i upewnij się, że odzyskają pełną przytomność, zanim dołączą do towarzystwa innych myszy.
  7. Po 3-4 tygodniach, gdy guz pierwotny osiągnie objętość 2cm3, poświęć myszy przez powolny strumień CO2 i natychmiast po ostatnim oddechu pobierz krew przez nakłucie serca za pomocą igły 25G x 5/8' połączonej ze strzykawką tuberkulinową o pojemności 1 ml wstępnie potraktowaną heparyną. Podczas wprowadzania strzykawki w pozycji poziomej przez przeponę w kierunku serca należy trzymać wylot igły skierowany do góry, a następnie powoli i stopniowo pobierać krew, unikając nadmiernego ciśnienia (ryc. 3).

2. Izolacja neutrofili

  1. Izolacja cytotoksycznych neutrofili z krwi myszy z nowotworem.
    1. Rozcieńczyć 1 ml krwi pobranej od myszy z nowotworem (patrz Protokół 1.11) w PBS zawierającym 0,5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do końcowej objętości 6 ml.
    2. Frakcjonowanie rozcieńczonej krwi na świeżo przygotowanym nieciągłym gradiencie sacharozy:
      1. Dodać 3 ml sterylnie przefiltrowanej sacharozy w ilości 1,119 g/ml na dno stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 15 ml.
      2. Powoli i ostrożnie nałożyć 3 ml sterylnie przefiltrowanej sacharozy 1,077 g/ml na warstwę 1,119 g/ml. Następnie powoli i ostrożnie dodać 6 ml rozcieńczonej krwi (protokół 2.1.1) na wierzch warstwy 1,077 g/ml (rysunek 4A). Zaleca się trzymanie probówki przechylonej i dodawanie różnych składników powolnym, ale ciągłym przepływem, utrzymując wylot pipety w kierunku dolnej ścianki probówki, tak aby nie powstawały turbulencje.
    3. Odwirować probówkę zawierającą rozcieńczoną krew na gradieniu sacharozy przy 700 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.
    4. Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, nie powodując żadnych turbulencji. Większość erytrocytów będzie znajdować się na dnie rurki. Neutrofile o dużej gęstości (HDN) znajdują się jako pierścień od białego do czerwonego na granicy między warstwami 1,119 g/ml i 1,077 g/ml (około znaku 3 ml), podczas gdy leukocyty o niskiej gęstości znajdują się w białym pierścieniu na granicy między warstwą 1,077 g/ml a PBS zawierającym BSA (wokół znaku 6 ml, patrz rysunek 4B).
    5. Odessać PBS + 0,5% BSA, aż osiągnie 5 mm powyżej warstwy komórek o niskiej gęstości. Odpipetować komórki o małej gęstości przez powolne odsysanie do końcówki o pojemności 1 ml, powoli wirując wokół komórek. Przenieść komórki do 30 ml PBS z 0,5% BSA.
    6. Zassać górną warstwę w tej samej rurce gradientowej, aż osiągnie 5 mm powyżej pasma komórek o dużej gęstości. Odpipetować komórki o dużej gęstości, które w większości są neutrofilami o dużej gęstości, i przenieść komórki do 30 ml PBS zawierającego 0,5% BSA.
    7. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać supernatant i lizować erytrocyty poprzez ponowne zawieszenie komórek w 36 ml sterylnej wody klasy HPLC na 30 sekund. Izotoniczność należy przywrócić, dodając 9 ml 5x stężonego PBS uzupełnionego 2,5% (w/v) BSA.
    9. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w PBS-BSA. Policz liczbę neutrofili w hemocytometrze i użyj błękitu trypanowego, aby odróżnić żywe i martwe komórki.
    11. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić neutrofile w żądanej pożywce inkubacyjnej do końcowej gęstości komórek. Neutrofile należy natychmiast zużyć.
    12. Następnie, po kolejnym odwirowaniu, ponownie zawiesić neutrofile w pożywce inkubacyjnej do końcowej gęstości komórek. Neutrofile należy natychmiast zużyć.
  2. Izolacja krążących neutrofili od pacjentów z rakiem.
    1. Zmieszać 10 ml heparynizowanej (20 j./ml) krwi ludzkiej z równą objętością 3% dekstranu T500 w roztworze soli fizjologicznej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas tej inkubacji erytrocyty ulegną osadowi.
    2. Przygotować stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml z 10 ml sacharozy o sacharozie 1,077 g/ml i powoli nakładać supernatant bogaty w leukocyty na warstwę sacharozy o gramaturze 1,077 g/ml (ryc. 4C).
    3. Wirować przy 400 x g przez 30 min przy RT bez hamulca. W powrocie pojawią się neutrofile o dużej gęstości (HDN). Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) oczyszczają się jednocześnie z monocytami i limfocytami na granicy faz między warstwą sacharozy o sacharozie 1,077 g / ml a osoczem (Figura 4D).
    4. Ponownie zawiesić neutrofile w 10 ml 0,2% NaCl na 30 sekund, aby zlizować zanieczyszczające erytrocyty i przywrócić izotoniczność poprzez dodanie 10 ml 1,6% NaCl i jednokrotne odwrócenie.
    5. Odwirować przez 5 minut przy 160 x g w temperaturze pokojowej i przemyć trzykrotnie w 20 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa. Odwirować po każdym przemyciu i odessać supernatant.
    6. Policz neutrofile i ponownie zawieś komórki w RPMI-1640 uzupełnionym 2% FBS przy 2 x 106 neutrofilach/ml lub według uznania.

3. Wzbogacanie neutrofili krwi za pomocą kulek magnetycznych

  1. Selekcja pozytywna
    1. Pobrać 1 ml krwi od myszy, jak opisano w Protokole 1.8, za pomocą strzykawki z heparyną.
    2. Odwirować krew w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać supernatant lub zachować osocze krwi do dalszych badań.
    4. Poddać lizie erytrocyty, ponownie zawieszając komórki w 8 ml wody klasy HPLC. Po 30 sekundach przywrócić izotoniczność poprzez dodanie 2 ml 5x stężonego PBS zawierającego 2,5% BSA. Policz komórki.
    5. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS zawierającym 0,5% BSA i 2 mM EDTA na 10-8 komórek.
    7. Dodać 50 μl biotynylowanego przeciwciała anty-Ly6G. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w lodówce (nie na lodzie).
    8. Dodać 150 μl zimnego PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
    9. Wirować roztwór podstawowy mikrokulek magnetycznych pokryty antybiotyną. Przenieść 100 μl do zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w lodówce (nie na lodzie).
    10. Przemyć komórki, dodając 10 ml PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA, a następnie odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl zimnego PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
    12. Włóż magnetyczną kolumnę separacyjną do uchwytu magnetycznego, który jest przymocowany do stojaka magnetycznego i przepłucz ją 500 μl zimnego PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
    13. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę. Przepływ zawiera nieznakowane komórki LyG6-ujemne.
    14. Przepłukać kolumnę 500 μl PBS zawierającym 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Dodatkowe nieoznakowane komórki będą znajdować się w przepływie.
    15. Powtórzyć etap płukania z kolejnymi 500 μl PBS zawierającymi 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
    16. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją na probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA i wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Przepływ zawiera neutrofile Ly6G+.
  2. Selekcja negatywna
    1. Przygotować leukocyty krwi zgodnie z krokami od 3.1.1 do 3.1.5.
    2. Zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml PBS zawierającym 0,5% BSA i 2 mM EDTA w 5 ml polistyrenowej probówce okrągłodennej.
    3. Dodaj 50 μl normalnej surowicy dla szczurów.
    4. Dodać 50 μl koktajlu wzbogacającego w neutrofile (zawierającego biotynylowane przeciwciała specyficzne dla białych krwinek niebędących neutrofilami), dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w lodówce.
    5. Umyć komórki, dodając 4 ml PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA, i odwirować 400 x g przez 10 min.
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS zawierającym 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
    7. Dodać 50 μl tetramerycznych kompleksów przeciwciał skierowanych przeciwko biotynie i dekstranowi. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w lodówce.
    8. Dobrze wymieszać probówkę zawierającą kulki magnetyczne pokryte dekstranem przed dodaniem 150 μl do zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj 10 minut w lodówce.
    9. Doprowadzić zawiesinę komórek do całkowitej objętości 2,5 ml przez dodanie PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
    10. Włóż rurkę (bez nakrętki) do magnesu i odstaw na 3 minuty.
    11. Odwróć magnes rurką jednym ciągłym ruchem, tak aby niezwiązane komórki w płynie zostały przeniesione do nowej probówki. Pozostaw magnes i rurkę odwrócone na 2-3 sekundy, a następnie wróć do pozycji pionowej. Znakowane magnetycznie niechciane komórki pozostaną związane ze ścianką oryginalnej probówki, podczas gdy niezwiązane neutrofile będą znajdować się w przenoszonym płynie.

4. Barwienie cytologiczne neutrofili

  1. Zawiesić 1x105 neutrofili w 50 μl PBS i przenieść zawiesinę komórkową do cienkowarstwowego adaptera do przygotowania komórek, takiego jak cytospina. Odwirować adapter przy 150 x g przez 5 minut. Oddziel wstępnie oznaczone szklane szkiełko od adaptera.
  2. Utrwalić komórki, zanurzając szkiełka podstawowe w 70% etanolu na 2 minuty. Pozostawić preparaty z adaptera (patrz krok 4.1) do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed barwieniem. Zanurz szkiełka 5 - 6 razy w wodzie destylowanej.
  3. Barwienie 1 - 2 minuty w roztworze hematoksyliny Mayera. Płukanie przez 1 minutę w wodzie z kranu. Zabarwić na 10 sekund roztworem Eozyny Y. Umyć w wodzie z kranu. Odwodnić poprzez płukanie szkiełek w rosnących stężeniach etanolu (70%, 96% i 100%). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na krótko i sprawdź je pod mikroskopem świetlnym.
    UWAGA: Hematoksylina ma głęboki niebiesko-fioletowy kolor i barwi kwasy nukleinowe, podczas gdy eozyna jest różowa i niespecyficznie barwi białka. Granulki cytoplazmatyczne neutrofili pozostają niezabarwione barwnikami kwaśnymi lub zasadowymi, stąd nazwa "uwielbiać być neutralnym". Podczas gdy granulocyty zasadochłonne barwią się na ciemnoniebiesko z hematoksyliną i eozyną, a granulocyty eozynofilowe na jaskrawoczerwono, granulocyty obojętno-czerwone wydają się neutralnie różowe (patrz ryc. 1A). Dojrzałe neutrofile charakteryzują się jądrem wielojądrzastym, które jest na ogół duże z 2 - 5 płatami "segmentowanych neutrofili" (ryc. 1A i 1C). Niedojrzałe neutrofile charakteryzują się jednopłatkowym, zakrzywionym lub pierścieniowym jądrem (ryc. 1B).

5. Oznaczanie czystości neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej.

  1. Ponownie zawiesić1x10 6 komórek w 100 μl buforu FACS (PBS zawierający 0,5% BSA, 2 mM EDTA i 0,02% NaN3). W przypadku próbek krwi pełnej przed barwieniem wymagana jest hemoliza (kroki 3.1.1 do 3.1.5). Dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR przez 5 minut.
  2. Dodać 0,5 μg znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała o swoistości dla Ly-6G dla neutrofili myszy lub dla CD11b i CD66b dla neutrofili ludzkich, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dostosuj objętość do 500 μl za pomocą PBS zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA i przeanalizuj barwienie za pomocą cytometrii przepływowej.

6. Podążaj za bramą neutrofili in vivo

  1. Znakowanie in vivo BrdU neutrofili
    1. Wstrzyknąć 100 μl roztworu bromodeoksyurydyny (BrdU) 10 mg/ml do sterylnego PBS dootrzewnowo myszom z nowotworem.
    2. Wyizolować neutrofile krwi 48 godzin po wstrzyknięciu zgodnie z Protokołem 2.1. Wybarwić neutrofile znakowane BrdU za pomocą zestawu przepływowego BrdU.
  2. Znakowanie CFSE neutrofili
    1. Ponownie zawiesić10-7 neutrofili w 1 ml wstępnie podgrzanego PBS.
    2. Dodać 2 μl 5 mM roztworu podstawowego CFSE do zawieszonych neutrofili do końcowego stężenia 10 μM. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. 5 mM CFSE przygotowuje się przez rozpuszczenie 2,8 mg CFSE (dioctanu 5-(i 6-)-karboksyfluoresceiny, estru sukcynimidylu) w 1 ml DMSO. Podzielić na 10 μl porcji w sterylnych probówkach o pojemności 200 μl i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
    3. Zneutralizuj nadmiar CFSE, dodając równą objętość RPMI-1640 zawierającą 10% FBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować neutrofile w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć neutrofile dwukrotnie w 10 ml RPMI-1640 zawierającego 10% FBS.
    4. Wirować przy 400 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości PBS. Neutrofile (np. 1 x 107 komórek) mogą być teraz wstrzykiwane dożylnie lub w postaci wstrzyknięcia serca myszom biorcom.

7. Test lucyferazy in vitro do monitorowania aktywności przeciwnowotworowej izolowanych neutrofili.

  1. Hoduj komórki nowotworowe znakowane lucyferazy, jak opisano dla komórek 4T1 w Protokole 1.1-1.5, ale ponownie zawieś komórki zdysocjowane trypsyną w zoptymalizowanej pożywce o zredukowanej surowicy uzupełnionej 2% FBS. Dostosuj gęstość komórek do 5 x 104 komórek na ml.
  2. Wysiewaj 5,000 komórek nowotworowych znakowanych lucyferazą w 100 μl zoptymalizowanej zredukowanej pożywki surowicy zawierającej 0,5% FBS w każdym dołku białej płytki dołka z 96 płaskodennymi kulturami tkankowymi.
  3. 4 godziny po wysianiu komórek nowotworowych dodać 1 x 105 neutrofili w 50 μl zoptymalizowanej zredukowanej pożywki surowicy zawierającej 0,5% FBS i inkubować O/N. Przygotować zawiesinę komórek obojętnochłonnych o gęstości 2 x 106 komórek/ml. Studzienki kontrolne powinny uzyskać pożywkę 50 μl bez neutrofili. Wykonaj wiele powtórzeń każdego ustawienia eksperymentalnego.
  4. Następnego ranka delikatnie odessać supernatant i przemyć każdy studzienek 200 μl PBS. Odessać PBS i dodać 50 μl pasywnego buforu do lizy. W przypadku łatwo odłączających się komórek (takich jak komórki AT-3), nie należy myć PBS i dodawać bufor do lizy hodowli komórkowych natychmiast po zassaniu pożywki wzrostowej.
  5. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj ją na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych. Wstrzyknąć dobrze dobrze 50 μl roztworu testowego lucyferazy i czytać chemiluminescencję przez 10 sekund na studzienkę.
  7. Obliczyć % lizy guza według następującego wzoru: % lizy guza = (1-[luminescencja próbek z neutrofilami]/[luminescencja próbek w pożywce]) x 100%.

UWAGA: Aby ocenić udział neutrofili w wysiewie przerzutów, neutrofile mogą być zubożone, jak opisano w protokole 8.1. W celu skutecznego wyczerpania należy podawać przeciwciała zubożające neutrofile począwszy od 7 dnia po wszczepieniu guza

.

8. Aktywność przeciwprzerzutowa neutrofili w mysim modelu raka piersi.

  1. Zubożenie granulocytów obojętnochłonnych in vivo.
    1. Świeżo przygotować 12,5 μg szczurzego przeciwciała anty-Ly6G (przeciwciało zubożające neutrofile) lub szczurzego przeciwciała kontrolnego izotypu (IgG2a, Κ) w soli fizjologicznej w końcowej objętości 100 μl na mysz.
    2. Począwszy od 3 dnia po wszczepieniu nowotworu, należy wstrzykiwać codziennie dootrzewnową dawkę 12,5 μg szczurzego przeciwciała anty-Ly6G (100 μl). Wstrzyknąć myszom kontrolnym lub 12,5 μg (100 μl) szczurzego przeciwciała kontrolnego izotypu (IgG2a, Κ).
    3. Począwszy od 14 dnia, podawaj przeciwciała dwa razy dziennie, ponieważ tempo produkcji neutrofili dramatycznie wzrasta wraz ze wzrostem guza 4T1.
    4. Co drugi dzień pobieraj próbkę krwi (2 - 3 krople), nacinając boczną żyłę ogonową. Zebrać krew do probówki zawierającej antykoagulant (heparynę, cytrynian lub EDTA).
    5. Sprawdzić zubożenie granulocytów obojętnochłonnych za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w Protokole 5.
  2. Test neutralizacji guza (zmodyfikowany test Winna)
    1. Wyizoluj neutrofile od myszy z nowotworem. Wymieszaj 1 x 106 komórek nowotworowych i 3 x 106 neutrofili w 50 μl soli fizjologicznej (na mysz).
    2. Wstrzyknij komórki podskórnie w bok 6-8 tygodniowych myszy naiwnych BALB/c. Ogol bok przed wszczepieniem guza, aby umożliwić dokładne pomiary wielkości guza. Mierz wielkość guza codziennie, począwszy od 5 dnia po wszczepieniu.
  3. Transfer adopcyjny neutrofili
    1. Wstrzyknąć 2 x 104 komórki nowotworowe wykazujące ekspresję lucyferazy w 200 μl PBS do żyły ogonowej.
    2. Transfer neutrofili należy wykonać 4 godziny po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. W związku z tym należy rozpocząć oczyszczanie HDN z myszy z nowotworem (protokół 2.1) na około 2 godziny przed planowanym transferem in vivo. Zawiesić neutrofile w PBS w końcowym stężeniu 2,5 x 107 komórek/ml.
    3. 4 godziny po wprowadzeniu komórek nowotworowych umieść myszy pod lampą grzewczą na 5 minut. Umieść myszy w uwięzieniu i wstrzyknij 5 x 106 HDN (200 μl) przez żyłę ogonową. Myszom kontrolnym wstrzykuje się nośnik (PBS).
    4. Monitoruj powstawanie przerzutów do płuc w różnych punktach czasowych za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo lub immunohistochemii.
  4. Test wysiewu z przerzutami do płuc
    1. Wstrzyknąć ortotopowo 0,5 - 1 x 106 rodzicielskich komórek 4T1 do lewej pachwinowej poduszeczki tłuszczowej sutka zgodnie z opisem w Protokole 1.
    2. W 10 dniu ponownie zawieś komórki 4T1 wykazujące ekspresję GFP w PBS w końcowym stężeniu 5 x 105 komórek/ml. Umieść myszy pod lampą grzewczą na 5 minut.
    3. Umieść myszy w uwięzieniu i wstrzyknij dożylnie 1x105 komórek 4T1 z ekspresją GFP (200 μl) myszom z guzem 4T1 lub myszom wcześniej nieleczonym.
    4. Następnego dnia należy poddać myszy eutanazji i wykonać perfuzję płuc za pomocą 20 ml PBS, aby usunąć pozostałe krwinki czerwone.
    5. Wyciąć płuca w celu analizy komórek GFP-dodatnich za pomocą immunohistochemii.
      UWAGA: Aby ocenić udział neutrofili w wysiewie przerzutów, neutrofile mogą być zubożone, jak opisano w protokole 8.1. W celu skutecznego wyczerpania należy podawać przeciwciała zubożające neutrofile począwszy od 7 dnia po wszczepieniu guza
      6. .

9. Tłumienie proliferacji limfocytów T przez neutrofile u myszy z nowotworem.

  1. Usuń śledzionę z uśpionej wcześniej myszy BALB/c i umieść w 10 ml PBS.
  2. Umieść śledzionę na sitku komórkowym o wielkości 40 μm, które jest dopasowane do szalki Petriego wypełnionej RPMI-1640. Używając końcówki strzykawki z tłokiem, rozetrzyj śledzionę przez sitko do komórek na szalce Petriego. Przepłucz sitko do komórek za pomocą 5 ml RPMI. Wyrzuć sitko.
  3. Przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować 400 x g przez 10 minut.
  4. Odrzucić supernatant i poddać lizie erytrocyty, zawieszając komórki w 36 ml czystej wody na 20 sekund, a następnie dostosować do izotoniczności, dodając 4 ml PBS o stężeniu x 10. Alternatywnie, poddać erytrocyty lizie, zawieszając komórki w 5 ml buforu do lizy erytrocytów (ACK) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zneutralizować ACK, dodając 10 ml pożywki RPMI-1640. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS i policzyć komórki.
  5. Zawiesić splenocyty w PBS do końcowej gęstości 4 × 107komórek/2 ml w probówce o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml roztworu CFSE o stężeniu 2,5 μM w PBS. Szybko odwrócić probówkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, z okazjonalnym mieszaniem (co 2 minuty), chroniąc przed światłem.
  6. Ugasić nadmiar CFSE dodając 4 ml wstępnie podgrzanego FBS (100%) i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Dodać 3 ml PBS i wirować przy 400 x g przez 10 min.
  7. Przemyć komórki 30 ml PBS i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.
  8. Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i ponownie przemyć PBS.
  9. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS do końcowej gęstości 2 x 107 komórek/ml.
  10. Wysiew 2 x 106 baseników (200 μl) w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  11. Stymuluj komórki, dodając 1 μg oczyszczonego przeciwciała anty-mysiego CD3ε chomika ormiańskiego w 500 μl RPMI-1640 z 10% FBS.
  12. Dodać 2 x 106 HDN lub LDN w 300 μl RPMI-1640 z 10% FBS do splenocytów znakowanych CFSE i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C. Studzienki bez neutrofili powinny otrzymać 300 μl pożywki. Całkowita objętość w każdej studzience powinna wynosić 1 ml.
  13. Zbierz komórki i przygotuj je do cytometrii przepływowej. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS (protokół 5) i dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Dodać 1 μl przeciwciała anty-CD8α sprzężonego z APC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Określ intensywność fluorescencji CFSE na limfocytach T CD8 + za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 5). Intensywność CFSE zmniejsza się o połowę przy każdym podziale komórki. W ten sposób liczbę podziałów komórkowych można określić na podstawie intensywności barwienia CFSE.

10. Test migracji neutrofili

  1. Wysiew, 5x10,5 komórek 4T1 w 7 ml zoptymalizowanej pożywki o zredukowanej surowicy, uzupełnionej 0,5% FBS, w kolbie do hodowli tkankowej o średnicy 25cm2 i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Przenieść 800 μl supernatantu do dolnej komory płytki migracyjnej o wielkości porów 5 μm.
  3. Zawiesić 2 x 105 neutrofili w 400 μl zoptymalizowanej zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej 0,5% FBS. Nanieść zawiesinę komórkową na górną komorę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Pod koniec inkubacji wyjmij górną komorę i policz liczbę neutrofili, które migrowały do dolnej komory.

11. Monitorowanie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) przez neutrofile.

  1. Przygotuj 1,1 x 106 neutrofili/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanka bez czerwieni fenolowej. Płytka 180 μl zawierająca 2 x 105 neutrofili w każdym dołku z białej płytki z 96-dołkiem płaskodennym.
  2. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych. Dodać 20 μl 500 μM roztworu luminolu w PBS do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM. Odczytaj podstawową chemiluminescencję przez 1 sekundę w ciągu 5 minut w odstępach 10 sekund.
  3. Dodać stymulant (np. PMA o stężeniu 10 nM lub 100 nM lub fMLP o stężeniu 10 μM). Przygotować 10-krotnie stężony roztwór każdego środka w zrównoważonym roztworze soli Hanka bez czerwieni fenolowej i dodać 22 μl do odpowiednich studzienek. Do studzienek kontrolnych należy dodać 22 μl nośnika.
  4. Zmierz chemiluminescencję w czytniku płytkowym. Wykonaj zarówno krótki (co 10 sekund przez 5 minut), jak i długi (co minutę przez 1 godzinę) kurs czasowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niedawnym badaniu zidentyfikowaliśmy antymetastatyczną funkcję neutrofili6. Neutrofile z myszy z nowotworem nabywają fenotypu cytotoksycznego i wykazują zdolność do zabijania komórek nowotworowych6. Jest to przeciwieństwo neutrofili z myszy naiwnych, które nie wykazują istotnego efektu przeciwnowotworowego6. Kilka technik opisanych w sekcji protokołu zostało wykorzystanych do badania przeciwnowotworowej funkcji neutrofili in vitro oraz in vivo6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neutrofile są najliczniejsze ze wszystkich białych krwinek i są pierwszymi osobami reagującymi w przypadku infekcji i stanu zapalnego. W związku z tym są bardzo wrażliwe na sygnały zewnętrzne i można je łatwo aktywować. Ponadto neutrofile mają bardzo krótki okres półtrwania i szybki obrót. Łącznie cechy te stwarzają szereg trudności w pracy z neutrofilami, tak że wymagane są unikalne strategie eksperymentalne. Na przykład istnieje kilka strategii oczyszczania neutrofili, z których każda ma swoje zalety i wady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

ZG jest wspierane przez granty z programu I-CORE Izraelskiej Fundacji Nauki (grant nr 41/11), Fundacji Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Izraelskiej Fundacji Badań nad Rakiem (ICRF - Research Career Development Award) oraz fundacji CONCERN. ZGF jest wspierany przez granty Izraelskiej Fundacji Badań nad Rakiem (ICRF - Research Career Development Award), Głównego Naukowca Ministerstwa Zdrowia Izraela oraz Izraelskiego Towarzystwa Chorób Płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LINIE KOMÓRKOWE
Mysie komórki raka piersi 4T1ADCCCRL-2539Pożywka wzrostowa: DMEM + 10% inaktywowane termicznie FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej Falcon353047Sterylna
płytka do hodowli tkankowej 100 mm Corning430167Sterylne
25 cm2 Kolba do hodowli tkankowychNunc156340Sterylne
90 mm naczynie do hodowli bakteryjnych Miniplast, Ein Shemer, Izrael20090-01-017Sterylna
15 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowa Miniplast, Ein Shemer, Izrael835015-40-111Sterylna
sterylna stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml Miniplast, Ein Shemer, Izrael835050-21-111Sterylna
rurka polistyrenowa Falcon 12 x 75 mm z okrągłym dnem Becton Dickinson352058Sterylna
płytka migracyjna Millicell 24 o wielkości porów 5μ m Merck MilliporePSMT010R1Sterylna
biała 96-płaska płytka studzienna Costar3917Sterylny
sitko do komórek (40 mm) BD Falcon352340Sterylna
igła 20G x 1,5" BDMicrolance 3 301300Sterylna
igła 23G x 1" BD Microlance 4300800Sterylna
igła 25G x 5/8" BD Microlance 5300600Sterylna
strzykawka 0,3 ml z igłą 30G x 8mmBD Micro-Fine Plus Demi320829Sterylne
klipsy 9 mm BD, AutoClip 427631Sterylny
magnes EasySep STEMCELL Technologies18000
MACS LS Miltenyi Biotech130-042-201Sterylny
magnes separatora MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
Szkiełko mikroskopowe Menzel-Glä ser Superfrost  WytrząsarkaThermo J1800AMNZ
 Sky line, czytnik płytek ELMIS-3.02.10L
 TECANInfiniteF200Pro
POWDER Albumina
surowicy bydlęcej (BSA), frakcja VSigmaA7906
Bromodeoksyurydyna (BrdU) BD Pharmingen550891Sterylny
CFSE (dioctan 5-(i 6-)-karboksyfluoresceiny, ester sukcynimidylu)Sondy molekularneC1157
Dekstran T500Sigma31392
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń SigmaH3149
Azydek sodu (NaN3)SigmaS8032Wysoce toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie
Tioglikolan w proszku Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
MEDIA I SUPLEMENTY
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)SigmaD5796Sterylne
Opti-MEM® Zmniejszyłem pożywkę w surowicy Life Technologies31985062Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758Sterylna
płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznieSigmaF9665Sterylna
L-glutaminaBiological Industries, Beth HaEmek, Izrael03-020-1ASterylny
pirogronian soduBiological Industries, Beth HaEmek, Izrael03-042-1BSterylna
penicylina Streptomycyna x 1000 roztwórBiological Industries, Beth HaEmek, Izrael03-031-5Sterylna
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez Mg2+ i Ca2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael02-023-1Sterylny
PBS x 10 bez Ca2+ i Mg2+ Przemysł biologiczny, Beth HaEmek, Izrael02-023-5ASterylna
woda klasy HPLC J.T. Baker4218-03Autoklaw
ROZWIĄZANIA ACK
– Technologie życia chlorku amonu i potasu A10492-01
Roztwór bromodeoksyurydyny (BrdU) (10 mg/ml) w PBSRozpuścić 10 mg BrdU w 1 ml PBS i sterylnym filtrze.
CFSE, 5 mM w DMSORozpuść 2,8 mg CFSE w 1 ml DMSO. Podzielić na 10 ml porcji w sterylnych probówkach o pojemności 200 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze -20oC.
Roztwór eozyny YSigmaHT110-2-32
Zbilansowany roztwór soli HanksaBiological Industries, Beth HaEmek, Izrael02-016-1ASterylna
heparyna, 20 mg/ml w PBSRozpuść 100 mg heparyny w 5 ml sterylnego PBS i sterylny filtr przez filtr 0,2 mm. 
Histopaque-1119 Sigma11191Sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.
Histopaque-1077 Sigma10771Sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.
Bufor do lizy hodowli komórek lucyferazy x5PromegaE153ARozcieńczyć w stosunku 1:5 w sterylnej wodzie tuż przed użyciem.
Roztwór do oznaczania lucyferazyPromegaE1501Zawiera proszek substratu do oznaczania lucyferazy (E151A) i bufor do oznaczania lucyferazy (E152A)
Roztwór hematoksyliny Mayera SigmaMHS-32
PBS + 0,5% BSARozpuścić 2,5 g BSA w 500 ml PBS i sterylnie przefiltrować przez filtr 0,2 mm.
PBS + 1% BSARozpuść 1 g BSA w 100 ml PBS i przefiltruj sterylnie przez filtr 0,2 mm.
5x PBS z 2,5% BSARozpuść 12,5 g BSA w mieszaninie 250 ml sterylnej wody klasy HPLC i 250 ml PBSx10, a następnie przefiltruj sterylnie przez filtr 0,2 mm.
PBS zawierający 0,5% BSA i 2 mM EDTARozpuścić 250 mg BSA w 50 ml sterylnego PBS i dodać 200 ml 0,5M EDTA pH 8,0, sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.
Bufor FACS (PBS zawierający 0,5% BSA, 2 mM EDTA i 0,02% NaN3)Rozpuścić 250 mg BSA w 50 ml sterylnego PBS i dodać 200 ml 0,5M EDTA pH 8,0 i 500 ml 2% NaN3, sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.
Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)Rozpuścić 9 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw
0,2% roztworuRozpuść 2 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw
1,6% roztworzeRozpuść 16 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw
2 % Azydeksodu Rozpuścić 1 g azydku sodu w 50 ml sterylnego DDW, przechowywać w temperaturze 4oC. Wysoce toksyczny.
3% roztwór                                                                            Rozpuścić 3 g proszku tioglikolanu w 100 ml ddw.                                                                              Gotować, aż roztwór stanie się żółty i autoklawować.
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)SigmaT8154Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w PBS, aby uzyskać 0,04% roztwór.
Roztwór trypsyny B Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael03-046-1Sterylne
1 mg / ml Zymosan AZawiesić 1 mg Zymosanu A w 1 ml sterylnego PBS w probówce Eppendorfa. Energicznie wirować i inkubować probówkę w temperaturze 37 oC przez 30 minut. Nie sterylizować w autoklawie. Przygotuj roztwór na świeżo przed użyciem.
Zestaw selekcyjny EasySep PESTEMCELL Technologies18557
Koktajl selekcyjny EasySep PE STEMCELL Technologies18151
nanocząstki magnetyczne EasySep STEMCELL Technologies18150
Mysz Anti-Ly6G Zestaw MicroBeadMiltenyi Biotec130-092-332
Zestaw do wzbogacania neutrofili myszy EasySepSTEMCELL Technologies19762
Zestaw do wzbogacania ludzkich neutrofili EasySepSTEMCELL Technologies19257
Zestaw przepływu FITC BrdUBD Pharmingen 
Zestaw do izolacji neutrofili MACSMiltenyi Biotec130-097-658
Zestaw do oznaczania fagocytozy Firma chemiczna Kajmanów 500290
PRZECIWCIAŁA
Przeciwciało blokujące FcR Biolegend101302
Oczyszczone szczurze przeciwciało anty-Ly6G BD Pharmingen 551459Klon 1A8
PE sprzężone ze szczurem przeciwciało anty-mysie Ly6G Biolegend127608Clone 1A8
Szczur anty-mysi Ly6GBD Pharmingen 551460Klon 1A8
PerCP-Cy5.5 szczur anty-myszy Ly6G TONBO Biosciences65-1276Klon 1A8
fioletowyFluor 450-sprzężony szczur anty-mysz Ly6G TONBO Biosciences75-1276Klon 1A8
Szczur anty-mysi CD11b sprzężony z FITCPharmingen 553310Clone M1/70
Szczurzy anty-mysi anty-6G i Ly-6C (GR-1) sprzężony z FITCPharmingen 553127Clone RB6-8C5
Szczurzy anty-mysi CD45BD Pharmingen 553081Clone 30-F11
Szczur anty-mysi sprzężony z FITC F4/80 Abcamab60343Klon BM8
Mysz anty-ludzka skojarzona z FITC CD66b Biolegend305103Clone G10F5
Oczyszczone przeciwciało kontrolne izotypu szczura (IgG2a, k) BD Pharmingen 553927Klon R35-95
LIŚĆ oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD3e chomika ormiańskiegoBioLegend100314Klon 145-2C11
Kolumna separacyjna orbitalna Plus NaCl NaCl tioglikolanuZESTAWY559619

Bibliografia

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613(2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524(2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja neutrofiligradient g sto cineutrofile zwi zane z guzemneutrofile o niskiej g sto cineutrofile o wysokiej g sto cicytometria przep ywowatest lucyferazycytotoksyczno kom rkowareaktywne formy tlenuzdolno fagocytarna
Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.