Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.
Artykuł metodologiczny
Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie konstruktów kostnych inżynierii tkankowej jest atrakcyjną strategią przezwyciężania wad autoprzeszczepów w leczeniu masywnych wad kostnych. Jako organizm modelowy, mysz była już szeroko wykorzystywana w badaniach związanych z kośćmi. Duże modele ubytków kostnych trzonu u myszy są jednak rzadkie i często wykorzystują fiksację kostną, która wypełnia jamę szpiku kostnego i nie zapewnia optymalnej stabilności mechanicznej. Celem obecnego badania było rozwinięcie krytycznej wielkości, segmentowej wady kości udowej u nagich myszy. Wykonano 3,5-milimetrową ostektomię kości udowej środkowej trzonu kości udowej (około 25% długości kości udowej) za pomocą dedykowanego przyrządu i stabilizowano ją za pomocą umieszczonej z przodu płytki blokującej i 4 blokujących. Ubytek kostny pozostawiono następnie pustym lub wypełniono substytutem kości (syngeniczny przeszczep kostny lub rusztowanie koralowe). Gojenie się kości monitorowano nieinwazyjnie za pomocą radiografii i mikrotomografii komputerowej in vivo, a następnie oceniano za pomocą mikrotomografii komputerowej ex vivo i nieodwapnionej histologii po uśmierceniu zwierząt, 10 tygodni po operacji. Rekonwalescencja u wszystkich myszy była doskonała, w ciągu jednego dnia po zabiegu chirurgicznym zaobserwowano pełne obciążenie. Ponadto u wszystkich zwierząt badanych w trakcie badania uzyskano stabilne unieruchomienie kości i konsekwentne utrwalenie wszczepionych materiałów. Kiedy ubytki kostne pozostały puste, konsekwentnie uzyskiwano brak zrostu. Natomiast gdy ubytki kostne były wypełniane syngenicznymi przeszczepami kostnymi, zawsze obserwowano zrost kostny. Gdy ubytki kostne zostały wypełnione rusztowaniami koralowymi, nowo powstałą kość obserwowano na granicy między krawędziami resekcji kości a rusztowaniem, a także w niewielkiej odległości w obrębie rusztowania.
Obecny model opisuje powtarzalny krytyczny rozmiar ubytku kości udowej stabilizowany przez osteosyntezę płytkową z niską zachorowalnością u myszy. Nowy nośny model segmentowego ubytku kości może być przydatny do badania mechanizmów leżących u podstaw regeneracji kości związanych z zastosowaniami ortopedycznymi.
Wprowadzenie
Masywne ubytki kości trzonu są wielkim wyzwaniem dla chirurga ortopedy. Zastąpienie kości autologicznym przeszczepem kostnym, obecnie uważane za złoty standard leczenia, jest dostępne w ograniczonej liczbie i wiąże się z chorobowością związaną z pobraniem. Z tych powodów inżynieria tkankowa konstruktów kostnych łączących mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego z rusztowaniami osteokondukcyjnymi została zbadana jako alternatywa dla autoprzeszczepów w chirurgii ortopedycznej.
Do tej pory większość badań przeprowadzono na klinicznie istotnych modelach zwierzęcych, takich jak psy, świnie i owce1-3, ale wstępna ocena tych konstruktów w ortotopowych, segmentowych, krytycznych rozmiarach wad kostnych w modelach małych zwierząt (takich jak myszy) może mieć kilka zalet: (i) niskie koszty, (ii) duża liczba zwierząt może być operowana; (iii) w przeciwieństwie do dużych modeli zwierzęcych, jednorodność szczepów myszy ogranicza indywidualne różnice w resorpcji rusztowania i tworzeniu kości; (iv) Co najważniejsze, dostępność specyficznych przeciwciał i zwierząt ukierunkowanych na geny umożliwia ocenę procesu biologicznego związanego z gojeniem się kości. Wreszcie, co nie mniej ważne, wykorzystanie szczepów myszy z niedoborem odporności umożliwia również badania z wykorzystaniem przeszczepów lub komórek pochodzenia ludzkiego bez niepożądanych odpowiedzi immunologicznych u myszy.
Pomimo wyżej wymienionych zalet, modele masywnych ubytków kostnych trzonu u myszy są rzadkie. W większości takich modeli stosuje się stabilizację kości za pomocą szpilki śródszpikowej, która wypełnia jamę szpiku kostnego (ograniczając w ten sposób objętość badanego materiału), a także utrudnia odtwarzalność, nie zapewniając stabilności obrotowej i osiowej2,4-7.
Cele obecnego badania to (i) naśladowanie klinicznej sytuacji braku zrostu kostnego, aby opisać powtarzalny, krytyczny rozmiar, segmentowy model ubytku kości udowej u myszy, który jest stabilizowany przez dokładną i powtarzalną osteosyntezę płytki blokującej, która zapewnia wysoce stabilne środowisko biomechaniczne8-10; (ii) zilustrowanie obecnego modelu dwoma potencjalnymi substytutami kości oraz opisanie analiz tworzenia kości, które można zastosować.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Myszy użyte w niniejszym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi opublikowanymi przez Europejski Komitet ds. "Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych" (Dyrektywa 2010/63/UE i Europejska Konwencja ETS 123). Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komisję Etyki Wydziału Lekarskiego Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV/2010-01-04).
1. Zwierzęta
- Użyj myszy atymmicznych (w wieku 10 tygodni). Użyj minimalnej liczby 6 myszy z wadą pozostawioną pustą jako negatywnej grupy kontrolnej.
2. Przygotowanie rusztowań
- Preparat do przeszczepu syngenicznego
- Do wypełnienia ubytku należy użyć izoprzeszczepu kostnego, aby zapewnić grupie kontrolnej minimalną liczbę 6 zwierząt.
- Uzyskanie iprzeszczepów kostnych poprzez pobranie wyciętej kości udowej od myszy należącej do grupy "wad pozostawionych pustych" lub "ubytków wypełnionych rusztowaniem koralowym" (pozwala to uniknąć użycia dodatkowego zwierzęcia do pobrania izoprzeszczepu kości)11.
- Przepłucz wyciętą kość solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrzymuj ją w sterylności za pomocą wilgotnego kompresu z gazy.
- Przygotowanie rusztowania koralowego
- Użyj rusztowania wykonanego z naturalnego koralowca: Acropora sp. kostki egzoszkieletu koralowego, 3 x 3 x 3 mm jako potencjalny substytut kości z minimum 6 zwierzętami.
- Ręcznie wytnij każdy sześcian koralowy do kształtu walca (3,5 wysokości; 2 mm średnicy).
- Wysterylizuj każde rusztowanie w autoklawie (121 °C przez 20 min), umyj je sterylnym PBS i zanurz w kompletnej pożywce hodowlanej (α-MEM) na 24 godziny przed implantacją myszom.
3. Zabiegi anestezjologiczne i analgezja
- Na 15 minut przed znieczuleniem należy zastosować zapobiegawcze działanie przeciwbólowe poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg masy ciała zwierzęcia).
- Nakładaj maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu co 30 minut, gdy zwierzęta są pod narkozą.
- Umieść myszy na podkładce rozgrzewającej, aby zapobiec hipotermii.
- Znieczulenie i zniebóle podczas zabiegu chirurgicznego
- Wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór zawierający ksylazynę (8 mg/kg) i ketaminę (100 mg/kg).
- Dostarczyć tlen przez przepływowy przepływ (50 ml/min).
- Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez obecność dobrego rozluźnienia mięśni i brak reakcji zwierzęcia na szkodliwy bodziec (np. mocne uszczypnięcie palca).
- Wstrzykiwać podskórnie pojedynczą dawkę enrofloksacyny (0,05 mg/kg) w ramach profilaktyki mikrobiologicznej.
- Analgezja pooperacyjna
- Analgezję pooperacyjną należy stosować poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 3 kolejne dni.
- Znieczulenie podczas zabiegów diagnostyki obrazowej
- Umieść myszy w pudełku do znieczulania, a następnie wywołaj i utrzymuj znieczulenie za pomocą odpowiednio około 4% i 2% izofluranu w tlenie.
- Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez dobre rozluźnienie mięśni zwierzęcia i brak ruchu.
- Warunki rekonwalescencji
- Trzymaj myszy na podkładce rozgrzewającej do czasu pełnego wyzdrowienia
- Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka po operacji.
- Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Warunki pooperacyjne
- Trzymaj myszy osobno przez pierwsze 3 dni Hostuj myszy przez 4 w klatkach po 3 dniu.
- Zapewnij wodę i dostosowany pokarm ad libitum. Pozwól myszom utrzymać ciężar ciała, bez żadnych ograniczeń aktywności przez cały okres pooperacyjny.
4. Zabieg chirurgiczny: Model Segmentalnej Wady Kości Udowej11,12
- Po znieczuleniu umieść każdą mysz w pozycji leżącej brzusznej z lewą tylną kończyną w wyprostu.
- Wyszoruj kończynę do aseptycznej operacji przy użyciu 10% jodu powidonu przez 5 minut, a następnie umieść sterylną serwetkę pod kończyną, aby uzyskać sterylną powierzchnię (stosuje się sterylną przezroczystą zasłonę, aby móc monitorować ruchy oddechowe podczas zabiegu). Dba się o zachowanie sterylności pola operacyjnego podczas zabiegu.
- Wykonaj 15-17-milimetrowe podłużne nacięcie skóry nad przednio-boczną częścią kości udowej, rozciągające się od stawu biodrowego do stawu kolanowego.
- Naciąć powięź szeroka, rozciąć mięsień obszerny boczny i mięsień dwugłowy uda, aby odsłonić całą długość trzonu kości udowej. Należy zachować ostrożność w celu zachowania nerwu kulszowego doogonowo i torebki stawowej dystalnie (ryc. 1).
- Aby zwiększyć ekspozycję trzonu kości udowej, należy przeciąć mięsień pośladkowy i mięsień dwugłowy uda z 3. krętarza.
- Wykonaj okrężną sekcję kości udowej w środku trzonu.
- Nałożyć 6-otworową tytanową płytkę mikroblokującą (o długości 10 mm; szerokości 1,5 mm, waga: 30 mg) po przedniej stronie kości udowej.
UWAGA: Otwory płytki, które są stożkowo zagłębione częścią cylindryczną, mieszczą tytanowe samogwintujące blokujące (długość 2 mm, średnica zewnętrzna 0,47 mm, waga: 5 mg, z dolną powierzchnią z gwintowanym w celu umożliwienia zablokowania w otworze płyty), które są połączone z trzpieniem, który odkręca się po zablokowaniu. - Wywierć najbardziej proksymalny otwór płyty za pomocą wiertła 0,3 mm i dedykowanej mocy silnika lub niededykowanej mocy silnika działającej z prędkością 2,500 obr./min przy około 500 mW12).
- Włóż pierwszą za pomocą dedykowanego śrubokręta, a następnie zablokuj ją (Rysunek 2).
UWAGA: Ponieważ wyrównanie płytki jest określane przez zastosowanie tej pierwszej, ważne jest, aby ustawić płytkę równolegle do kości udowej podczas wkładania. - Wywierć najbardziej dystalny otwór płyty w podobny sposób, włóż i zablokuj (Rysunek 3).
- Włoż, ale nie blokuj, dwie pozostałe zewnętrzne.
- Umieść drut piły Gigli 0,22 mm ściśle wokół kości w orientacji przyśrodkowo-bocznej, a następnie włóż go w szczeliny przyrządu (Rysunek 4).
- Włóż dedykowany przyrząd na trzpień dwóch ostatnich i przyłóż go nad płytką (Rysunek 5).
- Wykonaj ostektomię kości udowej środkowej części trzonu o długości 3,5 mm za pomocą piły Gigli pod irygacją (przy użyciu sterylnej soli fizjologicznej), aby zapobiec martwicy termicznej. Poproś asystenta chirurga o wzięcie przyrządu. Niech chirurg stosuje stałe, stałe napięcie. Uważaj, aby nie splątać drutu piły i użyć środkowych dwóch trzecich drutu. Unikaj nadmiernego ruchu, aby uzyskać proste cięcie kości (ryc. 6).
- Po ostektomii usuń piłę Gigli. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki miękkiej, przeciąć drut piły blisko kości z jednej strony.
- Zdejmij przyrząd i zablokuj dwie ostatnie (Rysunek 7).
- Pozostaw wadę segmentową pustą lub wypełnij ją chirurgicznie, umieszczając materiały do badania wewnątrz wady.
- Obficie spłukać pole operacyjne sterylnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej.
- Umieść mięsień obszerny boczny luźno na talerzu. Zamknij powięź i płaszczyzny podskórne za pomocą prostego ciągłego wzoru szwów i szwu 5.0 glycomer 631; Zamknij skórę za pomocą prostego przerywanego wzoru szwów za pomocą nici 4.0 Glycomer 631. Alternatywnie możliwe jest również zamknięcie skóry za pomocą kleju do skóry.
5. Oceny in vivo regeneracji kości
- Gdy myszy są pod narkozą, należy wykonać oceny radiologiczne w sposób podłużny, używając zarówno konwencjonalnych promieni rentgenowskich (26 kV, 10 sekund; 2-krotne powiększenie; rozdzielczość przestrzenna 20 linii/mm), jak i mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości (μCT).
- Do analizy μCT należy uzyskać obrazy w rozdzielczości 36 μm (50 kV i 478 mA, przy czasie naświetlania 40 ms, przy użyciu filtra aluminiowego 0,5 mm, krok obrotu 0,7º i obrót tomograficzny 180º). Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania rezydentnego.
6. Oceny ex vivo regeneracji kości
- Dziesięć tygodni po operacji wywołaj znieczulenie za pomocą izofluranu w tlenie, a następnie poświęć myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie nadmiaru barbituranu (1 ml pentobarbitalu).
- Wytnij kości udowe, usuń nakładającą się tkankę mięśniową i utrwal próbki kości w 4% paraformaldehydzie (pH 7,4) przez cztery dni.
- Usunąć płytkę i z każdej wyciętej próbki kości po utrwaleniu paraformaldehydu.
- Analiza TK ex vivo μ
- Umieść każdą wyciętą i utrwaloną kość w probówkach polietylenowych wypełnionych 75% alkoholem i przeanalizuj ją za pomocą ex vivo μCT.
- Uzyskuj obrazy przy napięciu 80 kV i 100 μA (czas naświetlania 1 000 ms, aluminiowy filtr 0,5 i rozmiar piksela kamery 4 μm (2 400 x 4 000 przy rozmiarze woksela 7 μm), średnio cztery klatki na każdy krok obrotu 0,9º.
- Rekonstrukcja obrazów trójwymiarowych (średnia wielkość woksela 13 μm) przy użyciu projekcji wstecznej z filtrem Hamminga za pomocą oprogramowania rezydentnego.
- Do analizy ilościowej tworzenia kości należy użyć oprogramowania rezydentnego w celu uzyskania objętości zmineralizowanej tkanki (dolny próg szarości 45 wskaźników skali szarości i górny próg szarości 240 wskaźników skali szarości) w określonym i spójnym obszarze zainteresowania odpowiadającym wadze.
- Wykonuj analizy w ten sam sposób dla każdej myszy z tym samym regionem zainteresowania.
- Użyj testu analizy jednoczynnikowej (przedział ufności - na poziomie 95% i istotny poziom na poziomie p < 0,05), aby porównać wskaźnik zrostu kostnego i objętość zmineralizowanej tkanki w obszarze zainteresowania między grupami.
- Analiza histologiczna
- Zanurz każdą wyciętą i utrwaloną kość udową w żywicy metakrylanu metylu i przetwórz ją w celu uzyskania nieodwapnionej histologii.
- Pociąć każdą próbkę kości wzdłuż na gruby przekrój (200 μm) za pomocą okrągłej piły diamentowej chłodzonej wodą.
- Zmielić każdy fragment próbki kości do grubości 100 μm, wypolerować go i wybarwić za pomocą niebieskich barwników Stevenel i van Gieson picrofuchsin.
UWAGA: Po barwieniu komórki pojawiają się na niebiesko, kość na różowo, a koral na brązowo pod mikroskopem świetlnym.
Wyniki
Wspomniane procedury chirurgiczne trwały od 45 do 60 min. Ostektomię i osteosyntezę łatwo było przeprowadzić przy pomocy asystenta chirurga, bez użycia żadnego systemu powiększającego. Nie wystąpiły żadne powikłania śródoperacyjne. W badaniu wstępnym na 18 myszach11 zdjęcia rentgenowskie wykonane po operacji wykazały, że długość ubytku kostnego (3.43 ± 0.12 mm) oraz ułożenie płytki (odległość między jamą stawu kolanowego a dystalną częścią płytki = 2.65 ± 0.56 mm) były powtarzalne.
Wskaźnik śmiertelności związanej z znieczuleniem wynosił około 5%.
Powrót funkcji operowanej kończyny był doskonały u wszystkich zwierząt, a pełne obciążenie kończyny zaobserwowano w ciągu doby po operacji (Animated Figure 1). Masa zestawu do osteosyntezy (płytka i śruby) użytego w niniejszym badaniu stanowiła około 0,1% masy ciała myszy. Nie wystąpiły żadne powikłania pooperacyjne (np. zakażenie rany, uszkodzenie implantu, przemieszczenie przeszczepu kostnego itp.). Nie odnotowano przypadków samookaleczeń ani obrażeń spowodowanych przez współlokatorów z klatki.
W przypadku pozostawienia chirurgicznie wywołanych ubytków kostnych pustych, nie zaobserwowano istotnej kostnienia, co wiązało się z trwałą brakiem zrostu kostnego. W przeciwieństwie do tego, gdy ubytki wypełniono izograftem lub rusztowaniem koralowym, zaobserwowano nowo powstałą tkankę kostną rozciągającą się od proksymalnych i dystalnych krawędzi kości. Ponadto, o ile kostnienie pozwoliło na przywrócenie ciągłości kości w większości ubytków leczonych izograftami (Rycina 8), o tyle w ubytkach wypełnionych rusztowaniem koralowym proces ten zaobserwowano jedynie w obrębie samego rusztowania. W rzeczywistości nie stwierdzono obecności kości w odległości większej niż 1 mm od krawędzi kostnych. Brak chrząstki we wszystkich wynikach analiz histologicznych stanowił dowód na stabilność uzyskanego zespolenia kostnego (Rycina 9, Rycina 10).
Radiografie i analizy microCT wykazały, że w żadnym zwierzęciu z grupy z pozostawionym pustym ubytkiem nie nastąpiło zrost kostny 10 tygodni po implantacji. Objętość tkanki zmineralizowanej oceniona w analizach microCT wyniosła 0,8 ± 0,3 mm3 i była reprezentatywna dla nowo powstałej kości. W grupach izoszczepu oraz rusztowania koralowego zrost kostny uzyskano odpowiednio u 4 i 4 zwierząt. Objętość tkanki zmineralizowanej oceniona w analizach microCT wyniosła 4,4 ± 0,9 mm3 oraz 8,9 ± 0,7 mm3. W tych grupach jednak, ponieważ zarówno izoszczep, jak i rusztowanie koralowe zawierały minerały, nie można było jednoznacznie odróżnić nowej kostnienia od pozostałego materiału implantowanego (izoszczepu lub rusztowania koralowego). Zarówno wskaźnik zrostu kostnego, jak i objętość tkanki zmineralizowanej uzyskane w grupie izoszczepu oraz grupie rusztowania koralowego były istotnie (p < 0,001) wyższe niż w grupie z pozostawionym pustym ubytkiem.
Rysunek 1: Chirurgiczne odsłonięcie w celu utworzenia segmentowego ubytku w kości udowej. W przedniobocznej części kości udowej wykonano podłużne nacięcie skóry o długości 15 - 17 mm, rozciągające się od stawu biodrowego do stawu kolanowego. Nacięto powięź szeroką (fascia lata); mięsień obszerny boczny (vastus lateralis) oraz mięsień dwugłowy uda (biceps femoris) zostały rozdzielone, aby odsłonić całą długość trzonu kości udowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Pozycjonowanie płytki i umieszczenie śruby proksymalnej. Płytkę przymocowano do przedniej strony kości udowej. Wywiercono otwór w najbardziej proksymalnej części płytki; następnie wprowadzono i zablokowano pierwszą śrubę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Umiejscowienie dystalnej śruby. Wywiercono otwór w najbardziej dystalnej części płytki, a następnie wprowadzono i zablokowano śrubę. ( przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Pozycjonowanie piły Gigli. Dwie pozostałe zewnętrzne śruby zostały wprowadzone, lecz nie zablokowane, a drut piły Gigli 0,22 mm został ciasno związany wokół kości w orientacji przyśrodkowo-bocznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Pozycjonowanie szablonu. Szablon nasunięto na trzpienie dwóch ostatnich śrub, umieszczono go nad płytką, a następnie w szczeliny szablonu wprowadzono brzeszczot piły. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Ostektomia. Wykonano ostektomię, a następnie wycofano piłę Gigli. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 7: Blokowanie wewnętrznych śrub. Usunięto szablon i zablokowano dwie ostatnie śruby. Defekty segmentowe pozostawiono następnie puste lub wypełniono testowanymi materiałami. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Reprezentatywne pooperacyjne radiogramy i strzałkowa rekonstrukcja μCT kości udowej myszy. Kość udowa z odpowiednim defektem pozostawionym pustym (A-E), wypełnionym masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym (F-J) lub wypełnionym masywnymi rusztowaniami z koralowca Acropora (K-O); bezpośrednio po operacji (A, F, K), 4 tygodnie po operacji (B, G, L), 6 tygodni po operacji (C, H, M) oraz 10 tygodni po operacji (D, E, I, J, N, O) (długość płytki = 10 mm). (Reprodukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9: Reprezentatywny obraz RTG, rekonstrukcja μCT i histologia ubytku wypełnionego rusztowaniem koralowym badanym w niniejszym badaniu. Obserwowano dużą ilość nowo powstałej kości pomiędzy otaczającymi krawędziami kostnymi a rusztowaniem koralowym; w przeciwieństwie do tego, wewnątrz rusztowania obecne było niewiele kości. Barwienia: błękit Stevenela i piktrofuksyna von Giesona. W tych warunkach kość, komórki i koral barwiły się odpowiednio na czerwono, niebiesko i brązowo. Pasek skali = 500 μm. ACS = rusztowanie koralowe Acropora; BN = kość. (Przedrukowano za zgodą z Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 10: Reprezentatywna histologia ubytku pozostawionego pustym (A), wypełnionego masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym (B) oraz wypełnionego rusztowaniem koralowym (C). W ubytku pozostawionym pustym zaobserwowano zaokrąglenie krawędzi kostnych wraz z wypełnieniem kanału szpikowego i obfitą ilością tkanki włóknistej głęboko w ubytku. W ubytku wypełnionym masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym zaobserwowano ciągłość kostną między przeszczepem a otaczającymi krawędziami kostnymi; szpik kostny był obecny w całej pierwotnej jamie. W ubytku wypełnionym rusztowaniem koralowym zaobserwowano nowo powstałą kość między otaczającymi krawędziami kostnymi a rusztowaniem koralowym, lecz wewnątrz rusztowania obecna była niewielka ilość kości. Barwienia: błękit Stevenela i pikrofuchsina von Giesona. W tych warunkach kość, komórki i koral barwiły się odpowiednio na czerwono, niebiesko i brązowo. Pasek skali = 500 mm. ACS, rusztowanie koralowe; BN, kość; BM, szpik kostny; FT, tkanka włóknista. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Animowana Figura/Wideo 1: Reprezentacyjne nagranie wideo chodu myszy jeden dzień po operacji. Zaobserwowano pełne obciążenie kończyny. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.
Dyskusja
Ektopowa implantacja materiałów i urządzeń związanych z ortopedią u myszy jest powszechnie wykonywana w celu oceny zdolności do tworzenia kości różnych rusztowań13,14. Istnieją jednak istotne różnice między modelami ektopowymi i ortotopowymi, w tym natywne osteogenne czynniki sygnalizacyjne i interakcje parakrynne z komórkami kościotwórczymi gospodarza.
Niniejsze badanie wykazało powtarzalny mysi duży segmentowy ubytek kości udowej o krytycznym rozmiarze (3,5 mm, około 20-25% długości kości udowej). Biorąc pod uwagę wielkość takiego zrostu i stabilność zapewnianą przez wynikową osteosyntezę płytkową, model ten naśladuje klinicznie spotykany zanikowy brak zrostu kostnego.
Okres pooperacyjny wybrany w niniejszym badaniu jest zgodny z wcześniej opisanymi modelami myszy bez zrostu, wykazując brak odpowiedniego gojenia po 8 do 12 tygodniach4,9,15,16.
Co najważniejsze, powtarzalną i stabilną osteosyntezę oraz stabilność wszczepionych substytutów kości uzyskano bez istotnej zachorowalności i śmiertelności1,2 przy użyciu zarówno płytki blokującej, jak i przyrządu do wykonania ostektomii. Wynik ten kontrastuje również z wynikami odnotowanymi po użyciu stabilizatora zewnętrznego lub gwoździa śródszpikowego 4,5,17-24. W przypadku stabilizatorów zewnętrznych potencjalne wady obejmują: zmienność sztywności, infekcje przewodów szpilkowych, poluzowanie szpilek, potencjalne urazy spowodowane przez kołki i ciężar materiałów (od 4 do 20% masy ciała myszy). Do potencjalnych wad gwoździa śródszpikowego należą: wypełnienie jamy szpikowej paznokciem oraz jatrogenne uszkodzenie powierzchni stawowych.
Inne mysie segmentowe ubytki kości udowej o krytycznej wielkości stabilizowane przez osteosyntezę płytkową opisano z ubytkiem kostnym powstałym przez zadzior i o długości od 1,5 do 2 mm16,25. W obecnym modelu użycie przyrządu i drutu piłowego pozwoliło na precyzyjną ostektomię o długości 3,5 mm bez znacznego urazu mięśni.
Jednak, aby odnieść sukces w wykonaniu zabiegu, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów: Nie używaj małych myszy (nagich myszy o wadze poniżej 25 g lub w wieku poniżej 8 tygodni), w przeciwnym razie płytka powinna być zbyt długa. Zbliżając się do kości udowej, należy zadbać o zachowanie zarówno nerwu kulszowego doogonowo, jak i torebki stawowej dystalnie. Nałożyć płytkę na przednią stronę kości udowej, a ponieważ ustawienie płytki jest określane przez zastosowanie tej pierwszej, należy zwrócić uwagę, aby ustawić płytkę równolegle do kości udowej podczas wkładania tej pierwszej.
Przed wykonaniem ostektomii należy wykonać okrężne rozwarstwienie kości udowej w środku trzonu, aby uniknąć urazu mięśniowego. Podczas wykonywania ostektomii asystent chirurga musi mocno trzymać prowadnicę, a chirurg musi uważać (i) aby nie splątać drutu piły, (ii) używać środkowych dwóch trzecich drutu, stosując stałe, stałe napięcie, oraz (iii) unikać nadmiernego ruchu, aby uzyskać proste cięcie kości.
Gojenie kości jest możliwe w obecnym modelu pod warunkiem, że zostanie zastosowany przeszczep kostny. Co więcej, model ten pozwala na dalsze badania mechanizmów zaangażowanych w strategie wymiany kości, gdy w dobrze standaryzowanym, dużym, segmentowym ubytku kostnym stosuje się przeszczepy lub komórki pochodzące od człowieka.
Ponadto, zgodnie z obecnymi trendami wymagającymi udoskonalenia i ograniczenia wykorzystywania zwierząt w badaniach związanych z ortopedią, model ten może być stosowany w połączeniu z technikami obrazowania in vivo , takimi jak bioluminescencja. Takie nieinwazyjne techniki pozwalają monitorować zarówno przeżywalność zagnieżdżonych komórek, jak i gojenie się tkanek bez konieczności składania ofiar ze zwierząt 26.
Głównymi ograniczeniami obecnego modelu są zarówno warunki nośne, jak i objętość powstałego ubytku kostnego, ponieważ nie naśladują one w pełni tych spotykanych klinicznie u ludzi. Inne ograniczenia modelu to (i) nieprzezroczystość promieniotwórcza płytki, która może wymagać usunięcia płytki przed analizą ex vivo μCT i może komplikować interpretację wyników podłużnego badania radiograficznego oraz (ii) brak możliwości modulacji sztywności płytki, która może być kluczowym parametrem mechanicznym w tworzeniu kości27-30.
Należy również pamiętać, że w przypadku stosowania iprzeszczepu kostnego lub innych rusztowań zawierających składnik mineralny (w szczególności węglan wapnia) w procesie segmentacji analizy mikro-CT wprowadzane jest pewne odchylenie, ponieważ gęstość nowo powstałych kości częściowo pokrywała się z gęstością izoprzeszczepu lub gęstością rusztowania. Z tego powodu objętość kości uzyskana w wyniku analizy mikro-CT w większości odzwierciedla objętość zmineralizowanej tkanki (nowo powstała kość plus substytut kości)11,26,31.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Renie Bizios za jej cenne uwagi na temat rękopisu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, Francja | M4526 | 500 ml |
| Acropora sp. kostki egzoszkieletu koralowego, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, Francja | Kostki 3 x 3 x 3 mm, autoklawowanie (121 ° C przez 20 min) sterylizacja | |
| Buprenorfina, Buprecare® | Axience, Pantin, Francja | 0,3 mg/ml | |
| Ksylazyna, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, Francja | 20 mg/ml | |
| Ketamina, Ketamina 500® | Virbac, Carros, Francja | 50 mg/ml | |
| Izofluran, Forè ne® | Abbott, Arcueil, Francja | ||
| Enrofloksacyna, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, Francja | 50 mg/ml | |
| Pentobarbital, Dolethal® | Vé tochinol, Przynęta, Francja | 182,2 mg/ml | |
| Pudełko anestezjologiczne | Ugo Basile, Gemonio, Włochy | 7900/10 | |
| Plastikowa przezroczysta sterylna serweta, BusterOpCover 30 x 45 cm | Buster, Coveto, Montagu, Francja | 613867 | |
| 10% jodu powidonu, Vé t&eaostry; Obiad® Rozwiązanie | Vé toquinol, Przynęta, Francja | 100 mg/ml | |
| Tytanowa płytka mikroblokująca, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 otworów, 10 mm długości i 1,5 mm szerokości, autoklawowanie (121 ° C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Wiertło 0,3 mm, Wiertło 0,30 mm | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | (121 ° C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Moc silnika | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Śrubokręt, Handrill | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | (121 ° C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Samogwintujące wkręty blokujące, MouseFix Śruba 2 mm | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm długości, 0,47 mm średnicy zewnętrznej i 0,34 mm średnicy rdzenia, autoklawowanie (121 ° C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Przyrząd, MouseFix XL Prowadnica wiertarki i piły | RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3,5 mm między szczelinami, autoklawowanie (121 ° C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu) |
| Piły Gigli 0,22 mm (piły 0,22 mm) | RISystem AG, Davos, Szwajcaria | ||
| 5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vé tochinol, Przynęta, Francja | Igła do gwintowania | |
| 4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vé toquinol, Przynęta, Francja | Rentgenowska igła z gwintownikiem | |
| , MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
| In vivo tomografia mikrokomputerowa o wysokiej rozdzielczości, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgia | ||
| Ex vivo tomografia mikrokomputerowa o wysokiej rozdzielczości, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgia | ||
| Oprogramowanie rezydentne: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgia |
Bibliografia
- Auer, J. A., et al. Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use. BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Srouji, S., et al. A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones. Bone. 55 (1), 241-247 (2013).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. Femoral non-union models in the mouse. Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).
- Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. Sourcebook of models for biomedical research. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).
- Becquart, P., et al. Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo. Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).
- Deschepper, M., et al. Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation. Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).
- Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. Development of a femoral non-union model in the mouse. Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Claes, L., et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).
- Drosse, I., et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective. Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model. J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).
- Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model. J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).
- Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics. J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).
- Manassero, M., et al. Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice. Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).
- Bos, R. R., et al. Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats. Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).
- Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects. J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).
- Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study. Bone. 39 (4), 932-937 (2006).
- Rai, B., et al. Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair. J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).
- Komlev, V. S., et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study. Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).
Przedruki i uprawnienia
