Artykuł metodologiczny

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52943

⸱

30 lipca 2015

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się cennym systemem modeli genetycznych do badań nad biologią rozwoju i chorobami. Danio pręgowany ma wysoki stopień ochrony genomu, a także podobieństwa w procesach komórkowych, molekularnych i fizjologicznych z innymi kręgowcami, w tym ludźmi. We wczesnej ontogenezie zarodki danio pręgowanego są optycznie przezroczyste, co pozwala naukowcom na wizualizację dynamiki organogenezy za pomocą prostego stereomikroskopu. Implantacja mikrogranulek to metoda, która umożliwia manipulację tkankami poprzez zmianę czynników w środowisku lokalnym. Dzięki temu naukowcy mogą badać wpływ dowolnej liczby interesujących nas cząsteczek sygnałowych, takich jak wydzielane peptydy, w określonych punktach przestrzennych i czasowych w rozwijającym się zarodku. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół manipulowania koralikami i wszczepiania koralików podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Badacze biologii rozwojowej wykorzystują szeroki wachlarz metod komórkowych, molekularnych i genetycznych, aby odkryć mechanizmy kontrolujące formowanie organizmu. Wśród tych podejść manipulacja tkankami jest kluczowym narzędziem w rozszyfrowywaniu złożonych pytań dotyczących losu komórek, ruchu komórek i organizacji tkanek. Jednym ze sposobów zmiany lokalnego środowiska tkankowego jest chirurgiczne zastosowanie mikrogranulek, które są używane do dostarczania ogniskowego źródła białek lub innych cząsteczek sygnałowych 1. Ten rodzaj eksperymentalnej manipulacji został szeroko zastosowany w klasycznych modelach embriologicznych kręgowców, takich jak żaba i pisklę 2.

Danio pręgowany stał się ważnym modelowym organizmem kręgowców do badań organogenezy, a także zapewnia wiele unikalnych korzyści w modelowaniu chorób 3-5, ponieważ dzielą z ludźmi wysoką ochronę genetyczną 6. W szczególności przezroczystość optyczna i rozwój zewnętrzny zarodka danio pręgowanego oferują niezrównany punkt widzenia do obserwacji ontogenezy tkanek 3-5. Wdrożenie zakrojonych na szeroką skalę badań genetycznych pozwoliło na stworzenie potężnego repozytorium zmutowanych szczepów danio pręgowanego do dalszych badań 7,8 oraz identyfikacji alternatywnych technik przesiewowych, które można skutecznie przeprowadzić na mniejszą skalę w pojedynczych laboratoriach 9,10. Dalsze prace eksperymentalne na danio pręgowanym zostały ułatwione dzięki postępom w metodologiach transgenicznych i odwrotnych podejściach genetycznych 11,12, a także genetyce chemicznej 13-15.

Techniki manipulacji tkankami, takie jak implementacja mikrogranulek, nie były tak szeroko stosowane u danio pręgowanego, ale mimo to dostarczają użytecznego narzędzia do dalszego zrozumienia sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju. Wszczepienie mikrogranulek zostało wykorzystane do zbadania procesów tworzenia się narządów w siatkówce danio pręgowanego 16,17, sercu 18, mózgu 19-22, grzebieniu nerwowym 23 i płetwie 24,25. W tych i innych badaniach kulki zostały zastosowane podczas rozwoju, aby zrozumieć dyfuzję cząsteczek sygnałowych 26, jak gradienty wpływają na migrację komórek 27 i wzorzec osiowy 28. Ostatnio mikrogranulki zostały wykorzystane do oceny mechanizmów regeneracji u dorosłych ryb danio pręgowanego 29. Na przykład w badaniach rozwojowych prace nad mikrokulkami danio pręgowanego dostarczyły informacji na temat mechanizmów tworzenia kończyn dzięki badaniom płetwy piersiowej 25. Pączek płetwy piersiowej danio pręgowanego jest homologiczny do zawiązka kończyn przednich u myszy 30 i piskląt 31. Pączek kończyny kręgowca ma dwa podstawowe węzły sygnalizacyjne: strefę aktywności polaryzacyjnej (ZPA), która ustanawia oś od przodu do tyłu poprzez ekspresję celów genu Sonic hedgehog (Shh) i dalszych celów genu Hox, oraz wierzchołkowy grzbiet ektodermalny (AER) obecny na końcu zawiązka kończyny, który działa w celu ustalenia bliższej do dystalnej tożsamości kończyny poprzez ekspresję czynników wzrostu fibroblastów (Fgfs). Wszczepiając mikrogranulki nasączone Fgf mutantom genetycznym Shh danio pręgowanego, badacze zidentyfikowali Fgf jako niezbędny do progresji cyklu komórkowego i wzrostu kończyny kręgowca 25. Oprócz kaskad sygnalizacyjnych Fgf i Shh, które ustalają tożsamość pozycyjną, pionierskie badania z wykorzystaniem pąka kończyny pisklęcia zidentyfikowały kwas retinowy (RA) jako cząsteczkę, która może naśladować działanie regionu polaryzującego w celu ustalenia tożsamości przedniej do tylnej 32. Eksperymenty te polegały na umieszczeniu małych pasków papieru Whatman nasączonego RA w kończynie pisklęcia, aby ocenić wzór palców 32. Co więcej, naukowcy przeprowadzili inne eleganckie badania, w których wykorzystano mikrogranulki, przeszczep komórek i egzogenne zabiegi RZS u danio pręgowanego, aby ustalić, że RZS działa w celu zapewnienia dalekosiężnych wskazówek pozycyjnych w tyłomózgowiu danio pręgowanego i mezodermie 28. Jednak obecnie pozostaje wiele pytań dotyczących roli czynników sygnalizacyjnych, takich jak Fgf i RA, w wielu aspektach rozwoju kręgowców. Efekty sygnalizacyjne RZS, działając jako morfogen, wpływają na wiele narządów 33, takich jak rozwijające się serce 34 i komórki progenitorowe nerek, gdzie RZS określa losy typu bliższych komórek nerki 35-39. Pogłębienie wiedzy na ten temat może przynieść znaczne korzyści z badań eksperymentalnych wykorzystujących techniki manipulacji tkankami i implantacji mikrogranulek.

Chociaż przeprowadzono mniej badań z mikrogranulkami u danio pręgowanego, w porównaniu do modeli takich jak pisklę, te, które zostały przeprowadzone, były bardzo pouczające. Jedną z przyczyn niedostatku badań opartych na implantacji mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego jest prawdopodobnie przekonanie, że istnieją trudne wyzwania techniczne, oparte na wielkości zarodka, które stanowią przeszkodę w skutecznym przeprowadzaniu takich manipulacji. Jednak implantacji mikrogranulek w zarodkach danio pręgowanego można nauczyć się w praktyce i wspomóc poprzez wizualną obserwację techniki, a tym samym można ją wykorzystać jako środek do zbadania mechanizmów rozwoju. Tutaj demonstrujemy precyzyjne zastosowanie mikrogranulek do zarodka danio pręgowanego, które można wykorzystać do przeprowadzenia szerokiej gamy testów dotyczących tworzenia tkanek i morfogenezy komórek.

Protokół

Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame.

1. Przygotowanie roztworu Ringera

  1. Przygotować roztwór 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl2 i 5 mM Hepes z ultraczystymH2Opoprzez ciągłe mieszanie, aby uniknąć wytrącania się soli.
  2. Po dodaniu soli, gdy roztwór nadal miesza, dodać 100 jednostek/penicylinę na ml i 100 μg streptomycyny na ml.
  3. Po dodaniu wszystkich antybiotyków i soli należy przeprowadzić sterylizację filtracyjną roztworu i przechowywać w sterylnym pojemniku.
    Uwaga: N-fenylotiomocznik (1-fenylo-2-tiomocznik) lub PTU można dodać do roztworu Ringera w celu zablokowania tworzenia się pigmentu w zarodkach z zagnieżdżonymi kulkami bez negatywnych konsekwencji dla zdrowia zarodka. Do przygotowania roztworu Ringera/blokującego pigmentację należy użyć roztworu o stężeniu 0,003% PTU. Ze względu na niskie stężenie PTU, które ma być dodawane, zaleca się przygotowanie większej objętości roztworu Ringera, co najmniej 1 l, aby uniknąć dodawania niewielkich ilości proszku PTU. Dodaj PTU w kroku 1.2, podczas gdy roztwór miesza.

2. Przygotowanie roztworu trikainy

  1. Dodać 2 g soli metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikainy) na l roztworu plus 0,1 M Tris, z 1 M podstawowego roztworu zbalansowanego do pH 9,5 i otrzymanego z ultraczystym H2O.
    Uwaga: Trikaina zostanie użyta do eutanazji zarodków danio pręgowanego w pożądanym punkcie czasowym w celu zbadania fenotypów implantacji koralików.

3. Przygotowanie roztworu E3

  1. Przygotować roztwór 0,25 M NaCl, 10 mM KCl, 12,5 mM CaCl2 i 16,6 mM MgSO4 do 1 l ultraczystej wody, aby uzyskać 1 l E3.
  2. Dodaj 200 μl błękitu metylenowego do roztworu E3, aby zahamować rozwój grzybów.

4. Ciągnięcie igieł do przenoszenia mikrokulek

  1. Użyć polerowanego ogniowo szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej: 1,0 mm, średnicy wewnętrznej: 0,5 mm, o długości 10 cm.
  2. Umieść szkło borokrzemowe w ściągaczu do mikropipet, aby przygotować cienkie igły.
    Uwaga: Następujące cztery wymiary mogą być użyte jako punkt wyjścia do wyciągania igieł: Ciepło = 540, Ciągnięcie = 245, Prędkość = 200 i Czas = 125.
  3. Po wyciągnięciu odpowiedniej liczby igieł przechowywać na przykrytych plastikowych szalkach Petriego, umieszczonych na paskach plasteliny lub taśmie klejącej, aby zapobiec złamaniu końcówki igły, do czasu użycia.
  4. Aby przyciąć końcówkę igły do żądanego rozmiaru otworu, użyj pary drobnych kleszczy, aby naciąć koniec igły.
    Uwaga: Rozmiar otworu igły będzie się różnić w zależności od używanego rozmiaru mikrokulek, a także preferencji użytkownika dotyczących obsługi. Dobrym punktem wyjścia jest wykonanie otworów o rozmiarach od 100 do 200 μm, jeśli zostaną wykorzystane mikrogranulki w zakresie od 50 do 100 μm.
  5. Przed użyciem włóż przyciętą igłę do uchwytu rurki kapilarnej, aby uformować gotowy instrument do przenoszenia mikrokulek.

5. Przygotowanie narzędzia do wąsów/rzęs

  1. Zdobądź wąsy, rzęsy lub inny mały, ale mocny kawałek naturalnego lub syntetycznego włókna włosowego. Ciąć w pobliżu podstawy filamentu pod kątem 45°. Przyklej wąs do końcówki mikropipety P-1000 za pomocą trwałego, przezroczystego kleju samoprzylepnego.

6. Przygotowanie tacki do implantacji mikrokulek

  1. Zmieszać 2 g agarozy ze 100 ml roztworu E3, aby uzyskać 2 % żel agarozowy E3.
  2. Podgrzewać 2 % roztwór agarozy przez 1 minutę i 30 sekund w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, obracając kolbę co 30 sekund, aby uniknąć bulgotania żelu.
  3. Weź pokrywkę szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i umieść ją w większym naczyniu o wymiarach 150 mm x 15 mm wnętrzem skierowanym do góry.
  4. Wlej gorący żel agarozowy do szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm, upewniając się, że palcem wskazującym zakotwiczyłeś pokrywkę mniejszego naczynia.
    Uwaga: Pozostaw cienką warstwę agarozy pod pokrywką mniejszego naczynia, aby usunąć kondensację, która utworzy się podczas nalewania żelu; Sprawi to, że koraliki będą lepiej widoczne pod mikroskopem preparacyjnym.
  5. Gdy agaroza ostygnie, ale zanim zastygnie, dobrze umieść formę na żelu. Pozwoli to na łatwiejsze umieszczanie zarodków.
  6. Uwaga: Aby uniknąć pęcherzyków w studzienkach, powoli umieszczaj formę pod kątem, aż będzie unosić się na wierzchu żelu.
  7. Za pomocą mikroszpatułki ostrożnie usuń dobrze pleśń, gdy żel zastygnie. Dodać roztwór E3 i przechowywać w temperaturze 4 °C.

7. Pobieranie zarodków

  1. Przygotuj komory godowe, oddzielone przegrodami, napełniając je wodą systemową, a następnie umieszczając dorosłe pary samców i samic danio pręgowanego w komorach O/N.
  2. Zbierz zapłodnione jaja za pomocą drobnego sitka z siatki drucianej (stadia embrionalne będą się nieznacznie różnić).
  3. Umieść zapłodnione jaja na czystej szalce Petriego o średnicy 10 cm, obracając sitko do góry nogami i spłukując je drobnym strumieniem E3, aż w sitku nie pozostaną żadne jaja, a w naczyniu znajduje się około 25 ml roztworu E3.
  4. Po zebraniu podziel jaja na kilka misek (około 50-60 jaj na półkę), aby uniknąć przepełnienia, które może prowadzić do asynchroniczności rozwojowej w obrębie lęgu i utrudnić zbieranie pożądanych punktów czasowych.
  5. Inkubować zarodki w roztworze E3 w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić ocenę rozwoju zgodnie ze standardową serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego 40,
    Uwaga: Zarodki należy przenieść do E3/PTU po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf), aby zapobiec rozwojowi pigmentu, jeśli manipulacje w starszych stadiach wymagają przejrzystości optycznej.

8. Implantacja koralików

  1. Inkubować mikrogranulki w pożądanym stężeniu cząsteczki badanej lub w odpowiednim roztworze nośnika przez wymagany czas w odpowiedniej objętości.
    Uwaga: Badacz może użyć sterylnych szalek Petriego o średnicy od 3 do 6 cm lub płytek wielodołkowych, które umożliwiają wizualizację mikrogranulek w roztworze. Czas może się różnić w zależności od rodzaju i ilości cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, a badacz powinien zapoznać się z zaleceniami producenta lub opublikowanymi zaleceniami dotyczącymi czasu inkubacji i innych aspektów, takich jak wrażliwość na światło i temperaturę.
  2. Gdy zarodki osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju, usuń zarodki z ich kosmówki za pomocą cienkich kleszczy.
  3. Inkubuj zarodki w przefiltrowanym roztworze Ringera z antybiotykami przez 10 minut, aby przyzwyczaić je do roztworu.
  4. Podczas aklimatyzacji zarodków przenieś mikrogranulki do płytki mikrogranulek umieszczonej w tacce implantacyjnej i płucz je w roztworze Ringera przez 10 minut
    Uwaga: Wszczep koraliki w ciągu 50 minut po osiągnięciu tego punktu. Zmniejszy to prawdopodobieństwo, że zostanie wszczepiony koralik o mniejszym stężeniu interesującej nas cząsteczki.
  5. Ułóż zarodki w dołkach tacki do implantacji mikrogranulek, uważając, aby ustawić je tak, aby obszar zainteresowania, w którym zostanie wszczepiony mikrogranulek, był dostępny.
  6. Wykonaj małe nacięcie na zarodku za pomocą igły wolframowej.
  7. Przenieś mikrogranulkę na zarodek za pomocą pipety do transferu mikrokapilarnego: naciskając gruszkę pipety, delikatnie wciągnij mikrokulkę do kolumny kapilarnej, a następnie zwolnij nacisk, aby przenieść mikrokulkę w żądane miejsce.
  8. Użyj narzędzia do wąsów/rzęs, aby umieścić mikrogranulkę wewnątrz zarodka. Uwaga: Pamiętaj, aby umieścić mikrogranulkę w tkance z dala od miejsca nacięcia, aby mikrogranulka nie została wydalona z zarodka podczas gojenia.

Wyniki

W badaniach wykorzystuje się kilka rodzajów narzędzi manipulacyjnych do operowania mikrokulkami (Rysunek 1). Ponadto, do unieruchomienia zarodka danio pręgowanego można użyć prostej formy z agarozy z małymi wgłębieniami, co jest kluczowe dla sprawnego i efektywnego przeprowadzenia tych eksperymentów (Rysunek 1). Implantację mikrokulki można przeprowadzić w interesującym badacza położeniu przestrzennym i etapie czasowym, co pozwala na zawężenie konkretnego okna aktywności badanej cząsteczki.

W tym przypadku pojedyncze mikrokulki zostały wszczepione do embrionów zebrafish w stadium pączka ogonowego lub w późniejszych punktach czasowych podczas etapów somitogenezy (Rysunek 3). W tej demonstracji protokołu wykorzystano mikrokulki o dwóch różnych rozmiarach, wypłukane samym roztworem Ringera (Rysunek 3A, 3B i 3C). Wszczepienie mikrokulek w przypadku braku jakichkolwiek sprzężonych małych cząsteczek pokazuje, że implantacja kulek może zostać przeprowadzona bez wywołania drastycznych efektów morfologicznych podczas prawidłowego rozwoju embrionu zebrafish (Rysunek 4).

Badacz może napotkać trudności z manewrowaniem mikrokuleczką w otworze wykonanym igłą wolframową na powierzchni zarodka. Aby ułatwić manipulację mikrokuleczką po jej umieszczeniu na zarodku za pomocą mikroigły, można zastosować narzędzie w postaci włośka lub rzęsy. Można je wykonać z naturalnie linionych wibrysów kota lub psa, choć można wykorzystać również inne naturalne lub syntetyczne włókna rzęs (Rysunek 1). Delikatne pchnięcie mikrokuleczki igłą wolframową lub narzędziem z włośka powinno spowodować jej zanurzenie w roztworze Ringera w formie. Po zanurzeniu mikrokuleczki w formie, w razie potrzeby można ją przesuwać na większe odległości za pomocą igły wolframowej, a po umieszczeniu nad zarodkiem użyć igły lub narzędzia z włośka, aby wprowadzić mikrokuleczkę do wnętrza zarodka. Sukces implantacji mikrokuleczki można natychmiast ocenić podczas obserwacji pod stereomikroskopem; kuleczka powinna pozostać stabilnie osadzona w tkance. Aby ocenić położenie kuleczki w czasie, każdą próbkę zarodka można obrazować za pomocą fotografii z przebiegiem czasowym in vivo lub sprawdzać w regularnych odstępach czasu (jak przedstawiono na Rysunku 4), aby upewnić się, że lokalizacja kuleczki nie zmieniła się w trakcie trwania eksperymentu na skutek endogennej morfogenezy tkankowej. Monitorowanie położenia kuleczki w czasie jest kluczowe dla rzetelnej interpretacji wyników, np. przy ocenie wpływu małej cząsteczki na tkankę docelową lub proces rozwojowy.

Zastosowanie powyższych kroków zapewni optymalne warunki do osadzania mikrokulek w zarodku ryby danio w pożądanym czasie i miejscu. Z naszego doświadczenia wynika, że początkujący użytkownicy tego protokołu implantacji mikrokulek zazwyczaj nabywają umiejętności niezbędnych do przeprowadzania spójnej chirurgicznej implantacji mikrokulek do zarodka ryby danio po około jednym tygodniu praktyki.

Narzędzia do implantacji kulek: płytka do mikrokulek, precyzyjna pęseta, igła wolframowa, mikropipeta, narzędzie do przesuwania (whisker tool).
Rycina 1. Narzędzia używane do przeprowadzenia implantacji mikrokulek. (A) Taca do implantacji kulek (po lewej, średnica 15 cm) z formami do zarodków (po lewej) oraz taca inkubacyjna do mikrokulek (po prawej, średnica 6 cm). Ta taca robocza umożliwia badaczowi umieszczenie zarodków w pożądanej orientacji do implantacji mikrokulek oraz zapewnia bliskość przygotowanych mikrokulek w obrębie stanowiska mikroskopowego. Mikrokulki powinny być inkubowane w małej cząsteczce(kach) i/lub nośniku, a następnie płukane w oddzielnej płytce do mikrokulek (po prawej) przed umieszczeniem ich w tacy do implantacji kulek znajdującej się pod mikroskopem. (B) Dwie pary precyzyjnych pęset zostaną użyte do usunięcia chorionu otaczającego każdy zarodek danio przebrzuchłego oraz do odłamania końcówki igły mikrokapilarnej. (C) Igła wolframowa zostanie wykorzystana do wykonania bardzo cienkiego nakłucia w zarodku danio przebrzuchłego, w którym zostanie umieszczona mikrokulka. (D) Mikrokapilarna pipeta transferowa posłuży do pobrania i umieszczenia mikrokulki na wierzchu zarodka danio przebrzuchłego w pobliżu miejsca nakłucia. (E) Narzędzie do przesuwania (whisker/lash tool) pozwoli na delikatne wprowadzenie mikrokulki w miejsce nacięcia w zarodku, wykonanego wcześniej igłą wolframową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przetwarzania zarodka zebrafish; zawiera formę do zarodków, tackę z mikrokulkami oraz narzędzie z igły wolframowej.
Rycina 2. Schemat procedury implantacji mikrokulek. (A) Tacka do implantacji mikrokulek, w której mikrokulki są namaczane w odpowiednim roztworze płuczącym, zostaje ustawiona pod stacją stereomikroskopu, a zarodki są ułożone tkanyką skierowaną do góry. (B) Za pomocą igły wolframowej można wykonać niewielkie nacięcie w zarodku, stosując lekki, lecz zdecydowany ruch. (C) Za pomocą mikrokapilarnej pipety transferowej pożądaną mikrokulkę można pobrać z komory inkubacyjnej mikrokulek w tacce (znajdującej się po prawej stronie) i przenieść do przedziału po lewej stronie, w którym znajduje się obszar roboczy zarodka. Mikrokulkę należy umieścić w pobliżu miejsca nacięcia, a następnie delikatnie wprowadzić do nacięcia wykonanego igłą wolframową, używając narzędzia typu whisker/lash. Po wprowadzeniu mikrokulki do miejsca nacięcia, należy ją wsunąć w tkankę (od strony przeciwnej do nacięcia), aby stabilnie ją umieścić i zapobiec jej późniejszemu wypadnięciu z zarodka w miarę rozwoju. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozwój zarodka danio pręgowanego, efekt implantacji kuleczki, obraz mikroskopowy, od etapu pączka ogonowego do 7 somytów.
Rycina 3. Mikrokuleczki mogą być implantowane do zarodków na różnych etapach rozwoju. (A) Do zarodków danio pręgowanego na etapie pączka ogonowego w okolicy tułowia implantowano mikrokuleczkę (średnica ok. 50 µm). W badaniu przeprowadzonym 24 h po implantacji kuleczki (hpbi) zarodki rozwijały się prawidłowo, a mikrokuleczka wykazywała minimalne przemieszczenie w czasie rozwoju. (B) Zarodki danio pręgowanego, którym na etapie 3 somytów (ss) implantowano mikrokuleczki (o średnicy ok. 50 µm) do pęcherzyka żółtkowego, wykazywały prawidłowy rozwój przy stosunkowo niewielkim przemieszczeniu kuleczek w czasie. (C) Większe mikrokuleczki (średnica ok. 70 µm) implantowane do zarodka na etapie 7 ss również wykazywały prawidłowy dalszy rozwój oraz minimalne lub żadne przemieszczenie z miejsca implantacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie implantacji kulek w zarodku, obrazy mikroskopowe, widoki boczne i grzbietowe, punkty czasowe rozwoju.
Rysunek 4. Ogólny rozwój zarodka danio-pręgławki nie jest zaburzony przez obecność mikrokulki do 72 hpbi. W zarodki danio-pręgławki w stadium 7 somitu (ss) wszczepiono mikrokulki namoczone w roztworze Ringera (o średnicy około 50 µm). Każdą mikrokulkę wprowadzono chirurgicznie do tułowia, pomiędzy somity 3 i 4. Obecność kulki nie wiązała się z widocznymi wadami rozwojowymi w 24 hr po implantacji kulki (hpbi), 48 hpbi lub 72 hpbi. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W ciągu ostatniego stulecia zrozumienie wzorców planu ciała i organogenezy poczyniło ogromne postępy. Techniki manipulacji tkankami miały kluczowe znaczenie dla odkrycia kluczowych informacji na temat tych ważnych procesów. Modyfikacja genetyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod ustalania funkcji genów, a metody analizy mozaikowej, takie jak przeszczep komórek, dostarczają użytecznych podejść do zrozumienia autonomii funkcji genów. Implantacja mikrogranulek stanowi kolejne miejsce do zbadania, w jaki sposób poszczególne cząsteczki zmieniają dynamikę rozwoju, ponieważ metoda ta umożliwia badaczowi zmianę lokalnego środowiska tkankowego poprzez wprowadzenie cząsteczek sygnałowych lub inhibitorów. Na rynku dostępnych jest wiele różnych mikrogranulek, które mają różne rozmiary i istnieją inne właściwości fizyczne (np. ładunek), dzięki czemu można je zastosować w warunkach eksperymentalnych. W ten sposób, wszczepiając mikrogranulki, które są nasączone w białku lub substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania w organizmie, naukowcy mogą badać miejscowe efekty podczas rozwoju i znaleźć powiązania między genem lub cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania a określonym fenotypem biologicznym.

W badaniach, takich jak to przeprowadzone przez Wada i współpracowników, wykorzystano implantację mikrogranulek w celu oceny wpływu zwiększonej sygnalizacji Hedgehog na wzorzec szkieletowy w przednim neurokranium (ANC) u danio pręgowanego 23. Wcześniejsze badania wykazały, że Shh jest wymagane do tworzenia ANC 14. Korzystając z mikrogranulek pokrytych Shh, naukowcy odkryli, że sygnał ten sprzyja tworzeniu się chrząstki w ANC. Proces implantacji mikrokulek wykorzystano do wykazania wyraźnego związku między sygnalizacją Hedgehog a tworzeniem się chrząstki w ANC. Inny kluczowy przykład tej techniki manipulacji tkankami u danio pręgowanego obserwuje się w badaniach, w których naukowcy badali kontrolę transkrypcji czynników domeny Erythroblastoma Twenty-Six (ETS), cząsteczki związanej z ETS (Erm) i aktywatora wzmacniacza polioma 3 (Pea3) poprzez sygnalizację Fgf podczas wczesnego rozwoju mózgu danio pręgowanego 19. Dzięki eksperymentom z implantacją mikrogranulek udało im się wykazać, że Fgf8 i Fgf3 mogą ektopowo aktywować ekspresję erm i grochu3. Przykłady te ilustrują użyteczność mikrogranulek w celu zapewnienia wglądu w mechanizmy rozwojowe, które współpracują podczas tworzenia tkanek, które można dobrze scharakteryzować za pomocą metod oceny ekspresji genów 41. W związku z tym przeszczep mikrogranulek może być realną metodą badania innych tkanek, takich jak mezoderma pośrednia (IM), która daje początek nerce. W szczególności pomogłoby to w badaniach nad rozwojem nerek, aby zbadać, w jaki sposób różne cząsteczki wpływają na segmentację nefronów 42 i tuburologenezę 43,44, procesy, które obecnie są tylko powierzchownie rozumiane. Co więcej, implantacja mikrogranulek zaczęła być stosowana do badania procesów regeneracji u ryb danio pręgowanego i może być dostosowana do stosowania z dowolną liczbą modeli regeneracji narządów, takich jak ablacja laserowa tkanek embrionalnych, takich jak nefron 45 lub w połączeniu z metodami, które zostały opracowane w celu przeprowadzenia badań z odpowiednimi dorosłymi strukturami 46-49. Wreszcie, implantacja mikrogranulek może być stosowana w modelach chorób ludzkich, takich jak rak 50,51 lub zwyrodnienie tkanek 52,53.

W niniejszym protokole demonstrujemy metodę implantacji mikrogranulek w zarodkach danio pręgowanego, która została również podobnie opisana przez innych badaczy, ale nie została pokazana za pomocą protokołów wideo 1. Przy minimalnej praktyce byliśmy w stanie wszczepić mikrogranulki w przybliżeniu 8-10 zarodków / godzinę, co wiąże się z wykonalnością tej procedury, gdy badacz zdobędzie pewne doświadczenie. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że koraliki o różnych rozmiarach mogą być wszczepiane we wczesnych stadiach i że przy zachowaniu ostrożności ta technika manipulacji tkankami może być stosowana przy minimalnym fizycznym zakłóceniu zarodka. Jednym z ulepszeń, na które należy zwrócić uwagę, jest użycie narzędzia do wąsów/rzęs do umieszczania mikrogranulki w zarodku. Ten stosunkowo niedrogi i prosty sprzęt ma mniej więcej taką samą średnicę jak mikrogranulka, jest łatwy do uzyskania i pomaga przyspieszyć proces implantacji. Wąs/rzęsę można przyciąć do pożądanej długości, aby uzyskać mocne, ale delikatne narzędzie do obsługi koralików, w zależności od zręczności i preferencji badacza. Wreszcie, chociaż opisaliśmy tutaj, jak fizycznie manipulować mikrogranulkami i zarodkami danio pręgowanego w celu przeprowadzenia implantacji, protokół ten nie określa konkretnych procedur postępowania z różnymi lekami lub peptydami. Ogólnie rzecz biorąc, mikrogranulki poddane działaniu substancji chemicznej powinny być wszczepiane zwierzęciu z dużą ostrożnością, aby uniknąć niepożądanych skutków w innych obszarach organizmu, a naukowcy powinni być dobrze poinformowani o możliwych obawach dotyczących bezpieczeństwa związanych z takimi chemikaliami przed rozpoczęciem badań.

Podsumowując, zademonstrowaliśmy stosunkowo prostą i wydajną metodę implantacji mikrogranulek o szerokim zakresie zastosowań przy użyciu materiałów, które są łatwo dostępne w laboratorium. Mamy nadzieję, że podręcznik ten pomoże naukowcom zajmującym się delikatną naturą manipulacji tkankami danio pręgowanego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez DP2OD008470 grantu NIH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduAB01915Bioanalityczny
Chlorek potasuAB01652Bioanalityczny
Chlorek wapniaAB00366bioanalityczny
HEPESSigma Life ScienceH4034
Roztwór penicyliny-streptomycynySigma-AldrichP4333-20ML
N-fenylotiomocznik (PTU)Aldrich ChemistryP7629
3-aminobenzoesan etylu (trikaina)Fluka AnalyticalA5040
Szkło borokrzemianoweSutter Instruments Co.BF100-50-10
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetSutter Instruments Co.P097
UltraPure AgarozaInvitrogen15510-027
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140
250 ml Kolba ErlenmeyeraFischer ScientificFB-500-250
Falcon Jednorazowe szalki Petriego, sterylneCorning 430167
60 mm x 15 mmVWR25373-085
100 mm x 15 mmVWR25373-100
150 mm x 15 mmVWR25373-187
Saint-Gobain Chemware MikroszpatułkaFischer Scientific21-401-50B
P-1000 Końcówki do mikropipetFischer Scientific2707402
Inkubator niskotemperaturowyFischer Naukowy11 690 516DQ
Dwusulfotlenek AmerykańskiAB00435bioanalityczny
Mikrogranulki (45-106 &mikro; m)Biorad140-1454 AG1-X8
Mikrogranulki (45 &mikro; m)Polysciences7314
Pęseta do mikro preparacjiRoboz Surgical Instruments Co.RS-5010
Igła wolframowaRoboz Instrumenty chirurgiczne Co.RS-6065
Uchwyt rurki kapilarnejGlobe Scientific Inc. Numer katalogowy: 51674
Amerykański Amerykański Amerykański

Bibliografia

  1. Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708(2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063(2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063(2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91(2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604(2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845(2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839(2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644(2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748(1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja tkankamiinkubacja embrion wprzygotowanie kulektacka do implantacjitransfer kapilarnystereomikroskopiaanaliza organogenezyczas rozwoju

Powiązane artykuły