Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Węch jest jedną z najbardziej rozwiniętych i ważnych funkcji sensorycznych u ssaków. Każde upośledzenie aktywności węchowej może wpływać na przyjmowanie pokarmu, zachowania społeczne, a w najgorszym przypadku nawet na przeżycie. U ludzi pogorszenie węchu jest zależne od wieku¹ i jest uważane za silny predyktor zaburzeń neurologicznych ^2-6. Test identyfikacji węchowej opracowany przez University of Pennsylvania jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych, nieinwazyjnych i mierzalnych testów diagnostycznych, które mogą ocenić wczesne deficyty neurologiczne⁷ i przewidzieć z dużym prawdopodobieństwem postęp demencji^8,9.

Dostępność układu węchowego i znaczenie węchu u gryzoni, wywołało intensywną linię badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw funkcji węchowych¹⁰. Wcześniej wykazaliśmy, że utrata funkcji receptora sygnalizacyjnego Notch1 wpływa na unikanie węchu¹¹. W tym protokole używamy myszy pozbawionych liganda sygnałowego, Jagged1, w neuronach lub gleju do badania wydajności węchowej.

Wrodzony węch jest definiowany przez trzy parametry: percepcja, rozróżnianie zapachów i wrażliwość węchowa⁴. Testy węchowe u gryzoni można przeprowadzać na różne sposoby, a niektóre badania behawioralne wykorzystują olfaktometry, które dostarczają zwierzęciu zapach o określonym stężeniu pary i w precyzyjnych ramach czasowych^12-14. Niemniej jednak oprzyrządowanie to jest drogie i może być dostępne tylko w specjalistycznych obiektach. W naszej pracy zapewniamy prosty, szybki i powtarzalny protokół badań węchowych, który przeprowadzany jest przy użyciu lotnych zapachów. Opisane testy mierzą percepcję zapachu atraktantu lub środka odstraszającego i oceniają rozróżnienie między zapachem a wodą^11,15,16. Korzystając z tej samej konfiguracji, możemy również zmierzyć wrażliwość na zapach o różnych stężeniach^16,17. Komputerowe przetwarzanie wideo post-hoc, zainspirowane pracą Page'a i^{współpracowników18}, zapewnia bezstronne wyniki bez potrzeby eksperymentalnego zaślepienia i pozwala jednej osobie na przeprowadzenie całego eksperymentu.

Ten protokół ma na celu dostarczenie punktu wyjścia do badania zachowań węchowych u myszy.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zgodne z Dyrektywą UE 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i są zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (Kanton Fryburg, Szwajcaria).

1. Przygotowanie zwierząt

1. Zwierzęta doświadczalne
   1. Przeprowadzaj eksperymenty na dorosłych samcach myszy typu dzikiego i transgenicznego (tło C57BL/6) w wieku 3-5 miesięcy. Trzy grupy myszy odpowiadają kontrolom miotu typu dzikiego (grupa A, Jagged1 flox/flox¹⁹) i dwóm warunkowym liniom myszy KO (grupa B, Jagged1ncKO i C, Jagged1gcKO).
   2. Trzymaj myszy w standardowych warunkach laboratoryjnych w wentylowanym pomieszczeniu, z 12-godzinnym kontrolowanym cyklem ciemności/światła i dostarczaj pożywienie i wodę ad libitum.

2. Konfiguracja eksperymentalna

1. Arena eksperymentalna
   1. Na arenie eksperymentalnej użyj czystej, wysterylizowanej klatki dla myszy (36 cm długości x 20,5 cm szerokości x 13,5 cm wysokości) (Rysunek 1A).
   2. Przypisz każdą mysz do numerowanej klatki ze świeżą ściółką o wysokości 3 cm. Jeśli klatki są ponownie używane, tak jak w teście wrażliwości na zapach, należy podjąć następujące środki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między zapachami a myszami.
      1. Zaznacz stronę wody.
      2. Oczyść węższe ścianki klatek dwiema bibułkami spryskanymi 70% etanolem, po jednej na każdą stronę.
      3. Ułóż klatki zgodnie z genotypem myszy i przechowuj tymczasowo pod kapturem laminarnym.
2. kamera
   1. Zamontuj kamerę na niestandardowym statywie tak, aby obiektyw znajdował się w odległości 58 cm od spodu klatki (Rysunek 1A). Ustal pozycję statywu i klatki i rozgranicz za pomocą znaczników, aby umożliwić wyśrodkowanie aparatu na górze klatki.
   2. Nagrywaj filmy w rozdzielczości 320 x 240 pikseli, 15,08 klatek na sekundę jako pliki MOV.
3. Zapachów
   1. Zawiesić zapachy, jeśli jest to wskazane, w rozpuszczalniku, w którym są rozpuszczalne.
   2. Do testu preferencji użyj masła orzechowego. Ponownie zawiesić masło orzechowe w oleju arachidowym (10% w/v).
   3. Do testu unikania należy użyć czystego kwasu 2-metylomasłowyego (2-MB) (98%).
   4. Do testu wrażliwości należy użyć moczu samicy z tej samej kolonii myszy i tła (C57BL/6).
      1. Dla wygody zbierz mocz 1-2 dni przed badaniem węchowym. Unieruchomić i trzymać mysz pod maską z brzuchem nad siatką klatki. Pod siatką klatki umieść plastikową szalkę Petriego, aby zebrać krople moczu.
      2. Zbierz mocz od każdej samicy do probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszaj wszystkie próbki moczu, aby znormalizować zmienność między zwierzętami. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      3. W dniu eksperymentu rozmrozić mocz i wykonać 4 rozcieńczenia w podwójnie destylowanej wodzie o współczynniku rozcieńczenia 10 (1:10, 1:100; 1:10,000; 1:10,000).

3. Testy węchowe

Uwaga: W tym protokole celowo wybrano zapachy, które są odbierane jako silne atraktanty (masło orzechowe i żeński mocz) lub silne środki odstraszające (kwas 2-MB)¹⁵. Ważne jest, aby przed testem unikania przeprowadzić testy preferencji i wrażliwości na przyjemne zapachy, aby wyeliminować możliwość jakiejkolwiek ingerencji w zachowanie węchowe. Niemniej jednak, dla uproszczenia, w niniejszym artykule test preferencji i unikania zostanie opisany w ramach testu percepcji. Każda sesja behawioralna rozpoczyna się od fazy przyzwyczajenia.

1. Faza przyzwyczajenia
   1. Umieść zwierzę w czystej przypisanej klatce i pozwól mu eksplorować przez 5 minut (Rysunek 1B). Ponieważ środowisko klatki doświadczalnej jest znane klatce domowej, ten krótki czas wystarczy, aby umożliwić przyzwyczajenie.
   2. Jeśli test wrażliwości zostanie zakończony w ciągu jednego dnia, należy przeprowadzić habituację tylko raz przed zastosowaniem najbardziej rozcieńczonego zapachu. Jeżeli test wrażliwości jest przeprowadzany w różnych dniach, każdego dnia potrzebna jest faza przyzwyczajenia na nowej, czystej klatce.
2. Test Percepcji
   1. Po przyzwyczajeniu włącz kamerę i natychmiast odpipetuj 60 μl przyjemnego zapachu (masło orzechowe) i 60 μl neutralnego zapachu (woda z kranu) na przeciwległe ścianki klatki w odległości około 10 cm od dna (rysunek 1C).
   2. Pozwól myszy badać zapachy przez 2 minuty (rysunek 1D). Następnie wyłącz aparat.
   3. W tym momencie przejdź do następnej myszy, zaczynając od fazy przyzwyczajenia. Dokładnie w ten sam sposób należy przeprowadzić test unikania, nakładając 60 μl środka odstraszającego (kwas 2 MB) i 60 μl wody.
3. Test wrażliwości
   1. Oceń próg przyciągania samców myszy do rosnących stężeń moczu samic w następującej kolejności: 1:10 000; 1:1,000; 1:100; 1:10 i czysty mocz.
   2. Po przyzwyczajeniu, wystawić każdą mysz na działanie najwyższego rozcieńczenia odpipetowanego przez eksperymentatora, jak opisano wcześniej w 3.2.1.
   3. Nagraj eksploracyjne zachowanie moczu w porównaniu z wodą w ciągu 2 minut na kamerze wideo. Po tym, jak wszystkie kohorty myszy są testowane pod kątem najwyższego rozcieńczenia (1: 10 000), należy wystawić je na działanie wyższego stężenia moczu, jak wskazano powyżej.

4. Analiza danych post-hoc

Uwaga: Wszystkie opisane testy behawioralne są przetwarzane post hoc zgodnie z instrukcjami analizy danych.

1. Otwórz pliki MOV w ImageJ dla systemów Windows
   1. Zainstaluj program Quick Time for Java, korzystając z ustawień dostosowanych do programu http://www.apple.com/quicktime/download .
   2. Zainstaluj wtyczkę Quick Time ze strony ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. Zaimportuj plik QTJava.zip (C:\Program Files\QuickTime\QTSystem) do rozszerzenia biblioteki ImageJ (. ImageJ\jre\lib\ext).
   4. Skopiuj również QTJava.zip z folderu wtyczek i zmień jego nazwę na QTJava.jar.
   5. Zainstaluj sześć skryptów dołączonych do folderu Makra (ImageJ\plugins\Macros).
   6. Otwórz ImageJ, a następnie skompiluj i uruchom wtyczkę Quick Time, a następnie zamknij ImageJ.
   7. Otwórz ponownie ImageJ i otwórz plik MOV za pomocą polecenia Plik> importu> za pomocą funkcji Szybki czas.
2. Regulacja wideo
   1. Po otwarciu pliku wideo w ImageJ, wytnij wideo, aby uzyskać stałą 2-minutową eksplorację od momentu, gdy eksperymentator odpipetował substancje zapachowe do klatki (T0). Zidentyfikuj klatkę odpowiadającą T0 i usuń poprzednie klatki, używając przyrostów 1 (narzędzie do usuwania ImageJ\Image\Stacks\ToolsSlice). Użyj tego samego polecenia, aby usunąć wszystkie klatki przekraczające 2 minuty eksploracji.
   2. Upewnij się, że klatka jest wyśrodkowana i w razie potrzeby użyj polecenia Image>Transform>Rotate, aby ją wyrównać.
3. Przetwarzanie wideo
   Uwaga: Przetwarzanie wideo jest w pełni wspomagane komputerowo i wykorzystuje polecenia makr dołączone do tego dokumentu.
   1. Aby ograniczyć obszar do klatki o rozmiarze 127 x 218 pikseli, uruchom makro Krok 1 z polecenia Plug>Macros>Run. Przesuń stały prostokąt nad klatką (Rysunek 2, Krok 1).
   2. Przytnij obszar klatki w obszarze zainteresowania (ROI) za pomocą makra Krok 2 (Rysunek 2, Krok 2).
   3. Użyj makra kroku 3, aby wyodrębnić obraz myszy z tła, przypisując sygnał progowy, usuwając plamki i filtrując wariancję sygnału. Wartości wyjściowe na wykresie osi Z wskazują średnie wartości szarości, odpowiadające intensywności cienia myszy poruszającego się w ROI "komory wodnej" podczas 2-minutowej eksploracji. Skopiuj wyniki do arkusza o nazwie zgodnej z ROI w pliku arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2, Krok 3).
   4. Użyj makra kroku 4, aby wyodrębnić średnie wartości szarości myszy w "komorze zapachowej" ROI. Skopiuj wyniki do arkusza o nazwie zgodnej z ROI w tym samym pliku arkusza kalkulacyjnego, co w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 4).
   5. Aby jeszcze bardziej zawęzić analizę ruchu myszy w "obwodzie wody" ROI, należy użyć makra Krok 5. Skopiuj wynik do arkusza roboczego o nazwie zgodnej z ROI w tym samym pliku arkusza kalkulacyjnego, co w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 5).
   6. Aby ograniczyć analizę ruchu myszy w "obwodzie zapachu" ROI, użyj makra kroku 6. Skopiuj wynik do arkusza roboczego o nazwie zgodnej z plikiem arkusza kalkulacyjnego ROI, jak w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 6).
   7. Przetwarzaj wszystkie filmy i sprawdzaj spójność liczby klatek na zwierzę. Tutaj nagraj wszystkie zwierzęta przez 1,810 klatek odpowiadających 2-minutowej sesji eksploracyjnej.
   8. Dla każdego zwierzęcia i dla każdego ROI sortuj ramki ze średnimi wartościami szarości większymi niż 0. Podziel liczbę klatek przez wartości odpowiadające 1 sekundzie i uzyskaj sekundy spędzone w każdym ROI.

5. Analiza statystyczna

1. Dla każdego testu sprawdź jednorodność wariancji w obrębie grup/genotypów za pomocą testu Bartletta, korzystając ze wzoru dostępnego na http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ .
2. W teście przyciągania i unikania przeprowadź porównania między czasem spędzonym z wodą a zapachem w jednej grupie za pomocą bezkierunkowego testu t Studenta, zakładając równe lub nierówne wariancje w zależności od wyników testu Bartletta. Porównaj czas spędzony z zapachami odjęty przez czas spędzony z wodą między genotypami za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.
3. W teście wrażliwości przeanalizuj porównania czasu spędzonego z zapachem odjętym od czasu spędzonego z wodą między grupami przy określonym rozcieńczeniu moczu za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego. Porównaj wrażliwość między grupami na rosnące stężenia zapachów za pomocą 2-kierunkowej ANOVA z powtórzeniami z testem post-hoc Bonferroniego.
4. Interakcja między genotypami i zabiegami w teście przyciągania i unikania jest badana za pomocą dwukierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.

Test percepcji mierzy pociąg do masła orzechowego i unikanie kwasu o wielkości 2 MB. Badane są trzy grupy myszy, a czas spędzony w "obwodzie zapachowym" jest określany ilościowo w porównaniu z wodą. W teście preferencji grupa kontrolna A wykazuje znaczącą preferencję zapachu w porównaniu z wodą (t8 = 2,52, p <0,05). Z drugiej strony, grupa B nie wykazuje znaczącego pociągu do masła orzechowego i spędza więcej czasu z wodą (t6 = 3,22, p <0,05). Tym samym zachowuje się inaczej niż grupa kontrolna A (F1,7 = 26,39, p <0,005). Ponadto grupa C nie wykazuje dyskryminacji i spędza mniej więcej tyle samo czasu z wodą i masłem orzechowym (t8 = 0,78, p = 0,45). Ogólnie rzecz biorąc, te trzy grupy zachowują się inaczej (F2,9 = 19,83, p <0,005) i istnieje znacząca interakcja między genotypem a traktowaniem (masło orzechowe i woda) (F2,1 = 4,90, p <0,005) (Rysunek 3A).

W odpowiedzi na 2-MB kwasu, grupa kontrolna wykazuje odruch unikania i w rezultacie spędza więcej czasu z wodą (t8 = 2,67, p <0,05). Podobnie grupa B wykazuje wyraźny odruch unikania kwasu 2-MB (t6 = 3,71, p <0,01). Z drugiej strony, grupa C nie rozróżnia tych dwóch zapachów i spędza porównywalne czasy z kwasem 2-MB i wodą (t8 = 2,2, p = 0,6) (ryc. 3B). Ogólnie rzecz biorąc, porównując reakcję unikania, trzy grupy nie wykazują istotnie różnych zachowań (F2, 9 = 0,76, p = 0,49), w wyniku czego nie ma interakcji między leczeniem a genotypem (F1, 2 = 0,52, p = 0,63).

W teście wrażliwości węchowej na mocz kobiety, krzywa pokazuje preferencję moczu w różnych stężeniach w porównaniu z wodą (Indeks preferencji = czas spędzony z moczem odjęty od czasu spędzonego z wodą). W tym teście obserwujemy, że grupa kontrolna A ma próg przyciągania moczu w rozcieńczeniu 1:1,000 i wykazuje rosnące przyciąganie do moczu wraz ze wzrostem stężenia. Grupy B i C wykazują 100-krotnie wyższy próg przyciągania (1:10) w porównaniu z grupą A (F2,9 = 4,78, p <0,05). Grupy B i C mają porównywalne krzywe czułości (F1,19 = 0,36, p = 0,55). Porównując wrażliwość między grupami, wydaje się, że grupa A ma wyższą wrażliwość na mocz kobiet w porównaniu z grupami B i C (F2,19 = 7,12, p <0,01) (ryc. 4).

Rycina 1: Przedstawienie układu użytego do przeprowadzenia testów węchowych. (A) Kamera nad klatką. (B) Myszy umieszcza się w klatce na 5-minutowy okres przyzwyczajenia. (C) Substancje zapachowe są pipetowane na ścianę klatki. (D) Aktywność eksploracyjna środka zapachowego w porównaniu z wodą jest testowana w oknie 2-minutowym.

Rysunek 2: Przepływ pracy wspomaganego komputerowo przetwarzania wideo za pomocą poleceń makr w ImageJ. Przykład odnosi się do myszy z grupy A wystawionej na działanie moczu w rozcieńczeniu 1:10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne wyniki testów preferencji węchowych i unikania. Myszy z trzech grup (n = 5 dla grupy A, n = 4 dla grupy B i n = 5 dla grupy C) zostały wystawione na działanie (A) masła orzechowego i (B) kwasu 2-MB przez 2-minutową sesję eksploracyjną. Przedstawiony jest całkowity czas badania zapachu (czarne kółka) w porównaniu z wodą (szare kółka). Na znaczące różnice w zachowaniu węchowym między grupami wskazują czarne poziome paski i gwiazdki. Znaczące różnice w czasie wąchania zapachu i wody w obrębie grup są pokazane za pomocą szarych poziomych pasków i gwiazdek. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,01 (szare poziome paski, test t-studenta; poziomy pasek, jednokierunkowa ANOVA). Słupki błędów są błędami standardowymi średniej (SEM).

Rycina 4: Reprezentatywne wyniki testów wrażliwości na rosnące stężenie moczu kobiet. Krzywa wskaźnika preferencji, wyrażona przez czas eksploracji moczu w różnych stężeniach odjęty przez czas spędzony z wodą, pokazuje, że grupa A (n = 5) ma najwyższą wrażliwość na mocz w porównaniu z grupą B (n = 4) i C (n = 5). *P <0,05 (czarne poziome paski, jednokierunkowa ANOVA). Słupki błędów to SEM.

Nie ma konfliktu interesów.