Charakterystyka diagramu fazowego z wykorzystaniem kulek magnetycznych jako nośników cieczy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania wieloskładnikowych diagramów fazowych przy użyciu zewnętrznie kontrolowanych kulek magnetycznych jako nośników cieczy w podejściu lab-in-tube. Takie podejście może być pomocne w zastosowaniach, które mają na celu zebranie dalszych informacji na temat przemiany fazowej w złożonych układach cieczowych.

Streszczenie

Magnetyczne kulki o średniej średnicy ~1,9 μm były używane do transportu mikrolitrowych objętości cieczy między sąsiadującymi segmentami cieczy za pomocą rurki w celu zbadania przemiany fazowej tych segmentów cieczy. Kulki magnetyczne były sterowane zewnętrznie za pomocą magnesu, co pozwoliło na mostek przez zawór powietrzny między sąsiednimi segmentami cieczy. Na wewnętrzną powierzchnię rurki nałożono powłokę hydrofobową, aby zwiększyć separację między dwoma segmentami cieczy. Zastosowane pole magnetyczne utworzyło zagregowane skupisko kulek magnetycznych, wychwytując pewną ilość cieczy w klastrze, która jest określana jako objętość przeniesienia. Do jednego segmentu cieczy dodano barwnik fluorescencyjny, po którym nastąpiła seria transferów cieczy, które następnie zmieniły intensywność fluorescencji w sąsiednim segmencie cieczy. Na podstawie analizy numerycznej zmierzonej zmiany intensywności fluorescencji stwierdzono, że objętość przenoszona na masę kulek magnetycznych wynosi od ~2 do 3 μl/mg. Ta niewielka ilość cieczy pozwoliła na użycie stosunkowo małych segmentów cieczy o objętości kilkuset mikrolitrów, co zwiększyło wykonalność urządzenia w przypadku podejścia lab-in-tube. Ta technika polegająca na zastosowaniu niewielkich zmian składu w objętości cieczy została zastosowana do analizy binarnego diagramu fazowego między wodą a środkiem powierzchniowo czynnym C12E5 (eter monododecylowy glikolu pentaetylenowego), co doprowadziło do szybszej analizy przy mniejszych objętościach próbek niż metody konwencjonalne.

Wprowadzenie

Magnetyczne koraliki (MB) o średnicy rzędu 1 mikrometra były dość często używane^1,2 w zastosowaniach opartych na mikroprzepływach, szczególnie w urządzeniach biomedycznych. W tych urządzeniach MB oferują takie możliwości, jak separacja komórek i kwasów nukleinowych, środki kontrastowe i dostarczanie leków, żeby wymienić tylko kilka. Połączenie kontroli zewnętrznej (pole magnetyczne) i mikrofluidyki opartej na kropelkach umożliwiło³ kontrole testów immunologicznych przy użyciu małych objętości (<100 nl). MB okazały się również obiecujące, gdy są używane do obsługi cieczy⁴. Podejście to wykorzystuje MB do transportu biomolekuł między segmentami cieczy w rurze oddzielonej zaworem powietrznym. Ta metoda nie jest tak potężna, jak inne, bardziej złożone urządzenia typu lab-on-chip widziane w przeszłości, ale jest znacznie prostsza i oferuje możliwość obsługi objętości cieczy o rozmiarach mikrolitrów. Podobne podejście zostało niedawno zgłoszone przez grupę Haseltona i zastosowane do testów biomedycznych.

Jednym z najważniejszych aspektów tego urządzenia jest separacja segmentów cieczy oferowana przez zawór powietrzny sterowany napięciem powierzchniowym. Mikrolitrowe objętości cieczy przyłączone do MB są transportowane przez tę szczelinę powietrzną między segmentami cieczy za pomocą zewnętrznie przyłożonego pola magnetycznego. Mikrocząstki MB (o średnicy od ~0,4 do 7 μm, średnio 1,9 μm) pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego tworzą mikroporowaty klaster, który zatrzymuje ciecz w środku. Wytrzymałość tego uwięzienia cieczy jest wystarczająca, aby wytrzymać siły napięcia powierzchniowego podczas transportu MB z jednego zbiornika do drugiego. Zazwyczaj efekt ten jest niepożądany, ponieważ większość podejść wymaga transportu tylko określonych cząsteczek (takich jak biomarkery) zawartych w cieczach⁶. Jednak, jak widać w naszej pracy, efekt ten można wykorzystać, aby stać się pozytywnym aspektem urządzenia.

Wykorzystaliśmy to podejście 'lab-in-tube', pokazane schematycznie na rysunku 1, do analizy diagramów fazowych w binarnych systemach materiałowych. Surfaktant C12E5 został wybrany jako główny punkt charakterystyki, ponieważ jest szeroko stosowany w zastosowaniach przemysłowych, takich jak farmaceutyki, produkty spożywcze, kosmetyki itp. W szczególności zbadano układ podwójny_H2O/C12E5, ponieważ dostarcza on bogatego zestawu faz do zbadania. Skupiliśmy się na jednym specyficznym aspekcie tej mieszaniny chemicznej, a mianowicie na przejściach do faz ciekłokrystalicznych w określonych stężeniach^7-9. To przejście można łatwo zaobserwować w naszym urządzeniu poprzez włączenie polaryzatorów do badań mikroskopii optycznej w celu podkreślenia granic fazowych.

Możliwość mapowania diagramów fazowych jest bardzo ważnym obszarem badań, aby zrozumieć kinetykę związaną z przejściem fazowym¹⁰. Możliwość precyzyjnego określenia interakcji środków powierzchniowo czynnych z rozpuszczalnikami i innymi składnikami jest kluczowa ze względu na ich złożoność i wiele odrębnych faz¹¹. Wiele innych technik było wcześniej używanych do charakteryzowania przemiany fazowej. Konwencjonalne podejście polega na pobraniu wielu próbek, z których każda składa się z różnych stężeń i umożliwieniu ich zrównoważenia, co wymaga długiego czasu przetwarzania i dużej ilości próbek. Następnie próbki są zwykle analizowane metodami optycznymi, takimi jak dyfuzyjny transport międzyfazowy (DIT), który zapewnia wysoką rozdzielczość takich kompozycji środków powierzchniowo czynnych^12,13. Podobnie jak metoda, którą zastosowaliśmy, metoda DIT wykorzystuje światło spolaryzowane do obrazowania wyraźnych granic fazowych.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów jednorazowego użytku w urządzeniu

1. Przygotowanie rurki
   1. Pokrój rurkę na segmenty o długości 15 cm. Rurka ma średnicę wewnętrzną 1,6 mm i średnicę zewnętrzną 3,2 mm.
   2. Zawieś segmenty rur pionowo za pomocą taśmy. Umieść ręcznik papierowy pod rurkami, aby zebrać nadmiar roztworu fluoropolimeru.
   3. Wstrzyknąć 100 μl roztworu fluoropolimeru do górnego otworu każdego segmentu probówki za pomocą strzykawki, tak aby zetknął się z całym obwodem na wewnętrznej ściance.
   4. Pozostaw segmenty rurki na miejscu na 1 godzinę, aby usunąć nadmiar roztworu fluoropolimeru.
   5. Usuń roztwór fluoropolimeru ze spodu probówki, który nie kapał. Wyjmij rurkę z pozycji wiszącej i wyrzuć ręczniki papierowe.
   6. Umieść segmenty rurki w piecu w temperaturze 100 °C na 1 godzinę, aby wyżarzyć warstwę powłoki fluoropolimerowej.
   7. Wyjmij segmenty rurki z piekarnika. Użyj pęsety, ponieważ segmenty rurki będą gorące.
2. Przygotowanie rozcieńczonego roztworu kulki magnetycznej
   1. Obliczyć stężenie kulek magnetycznych potrzebne do osiągnięcia pożądanej objętości przeniesienia, określone na podstawie zależności między objętością przenoszoną a masą MB pokazaną na rysunku 2.
      Uwaga: Oryginalny roztwór MB zawiera 1 g MB w 50 ml roztworu. Biorąc pod uwagę objętość komory testowej wynoszącą 20 μl, rozcieńczyć oryginalny roztwór MB wodą destylowaną w stosunku 6:4 (roztwór MB do wody), aby uzyskać objętość przeniesienia ~0,4 μl. Dostosuj współczynnik rozcieńczenia, gdy pożądana jest inna objętość przeniesienia.
   2. Umieścić fiolkę z próbką o pojemności 20 ml na mikrowadze. Wyzeruj saldo.
   3. Wymieszać pojemnik z roztworem kulek magnetycznych, a następnie pobrać 0,6 ml za pomocą mikropipety.
   4. Dozować odpipetowany roztwór do fiolki z próbką po równowadze.
   5. Wlać 0,4 ml wody destylowanej do fiolki z próbką.
3. Przygotowanie barwnika fluorescencyjnego w płynie
   1. Rozpuść 2% wag. barwnika w wodzie demineralizowanej, wirując roztwór przez 1 minutę.

2. Przygotowanie zestawu doświadczalnego do eksperymentów fluorescencyjnych

1. Przygotowanie urządzenia do rurek.
   1. Włóż żeńskie złącze Luer-lock na jednym końcu rurki.
   2. Umieścić probówkę w strzykawce Luer-lock o pojemności 3 ml i podziałce 0,1 ml.
   3. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić szybkość podawania na 2 ml/h.
   4. W celu dokładnego wprowadzenia płynów do rurki należy użyć pompy strzykawkowej, aby pobrać roztwór zawierający kulki magnetyczne i barwnik fluorescencyjny.
   5. Wlać 20 μl roztworu kulek magnetycznych do probówki za pomocą pompy strzykawkowej. Ten segment cieczy jest określany jako komora testowa (objętość komory testowej może się różnić w zależności od eksperymentu). Wirować pojemnik roztworem kulek magnetycznych przez 1 minutę, a następnie mieszać ręcznie podczas cyklu pobierania, aby uzyskać jednolite dyspersje MB.
   6. Po zakończeniu wprowadzania cieczy do komory testowej należy pobrać 6 μl powietrza do probówki. Ta objętość powietrza utworzy później zawór pomiędzy dwoma segmentami cieczy.
   7. Po zakończeniu wprowadzania szczeliny powietrznej rozpocznij pobieranie 180 μl cieczy z barwnikiem fluorescencyjnym. Ten segment cieczy jest określany jako zbiornik. Objętość zbiornika może się różnić w zależności od eksperymentu. Większa objętość zbiornika jest korzystna, aby zminimalizować zmianę stężenia barwnika.
   8. Umieść drugie żeńskie złącze Luer-lock na drugim końcu rurki.
   9. Wyjąć rurkę ze strzykawki.
   10. Umieść nasadki Luer-lock na obu końcach urządzenia.
2. Konfiguracja optyki do eksperymentów fluorescencyjnych
   1. Włącz wszystkie elementy podłączone do odwróconego mikroskopu.
   2. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do obrazowania mikroskopu.

3. Procedura eksperymentalna dla eksperymentów fluorescencyjnych

1. Wykonaj wstępny pomiar intensywności fluorescencji komory testowej i zbiornika za pomocą odwróconego mikroskopu. Podczas analizy fluorescencji próbki należy upewnić się, że ognisko znajduje się w pozycji środkowej (zarówno w kierunku x, jak i y) segmentu cieczy w probówce. Rejestruj pomiary w arkuszu kalkulacyjnym danych.
2. Umieść urządzenie na magnesie sześciennym tak, aby wszystkie kulki magnetyczne segregowały się w jednym obszarze w komorze testowej. Przenieś koraliki do zbiornika, przesuwając urządzenie nad magnesem (~ 10 sekund). 1-calowy magnes neodymowy sześcienny jest klasy N48 o sile ciągnącej 45,6 kg.
3. Gdy klaster kulek magnetycznych zostanie przeniesiony przez szczelinę powietrzną do zbiornika, porusz kulki magnetyczne, umieszczając urządzenie na magnesie i obracając, aby uwolnić ciecz uwięzioną w klastrze. Kontynuuj mieszanie kulek magnetycznych, aż do zakończenia homogenizacji zbiornika (~ 30-45 sekund).
4. Umieść urządzenie na magnesie tak, aby wszystkie kulki magnetyczne w zbiorniku segregowały się w jednym obszarze. Przenieś klaster kulek magnetycznych z powrotem do komory testowej.
5. Gdy klaster dotrze do komory testowej, zamieszaj kulki magnetyczne, umieszczając urządzenie na magnesie i obracając, aby uwolnić uwięzioną w nim ciecz fluorescencyjną. Kontynuuj mieszanie kulek magnetycznych aż do zakończenia homogenizacji komory testowej (~ 30-45 sekund).
6. Wykonaj pomiary intensywności fluorescencji zarówno w komorze testowej, jak i zbiorniku za pomocą mikroskopu odwróconego. Rejestruj pomiary w arkuszu kalkulacyjnym danych.
7. Kroki 3.2-3.6 są powtarzane, aż oba segmenty cieczy zbiegną się do podobnych intensywności fluorescencji (~ 100 cykli).

4. Analiza numeryczna danych fluorescencyjnych

1. Po zapisaniu danych o intensywności fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym wykonaj analizę numeryczną za pomocą MATLAB.
2. Wyprowadź równania, aby obliczyć teoretyczną wartość intensywności fluorescencji zarówno w zbiorniku, jak i komorze testowej. Uwzględnij następujące równania w pliku skryptu MATLAB:
   gdzie I jest intensywnością fluorescencji (A.U.), V jest objętością (μl), n jest liczbą transferów, R jest zbiornikiem, T jest komorą testową, a C jest przeniesieniem.
3. Korzystając z programu MATLAB, generuj wykresy i analizuj, aby określić objętość przeniesienia dla wszystkich eksperymentów. Na podstawie tych danych można utworzyć rysunek 2.

5. Przygotowanie zestawu doświadczalnego do eksperymentów z surfaktantami

1. Przygotowanie urządzenia do rurek.
   1. Włóż żeński Luer-lock na jeden koniec rurki.
   2. Umieścić probówkę w strzykawce typu Luer-lock.
   3. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić szybkość podawania na 2 ml/h.
   4. W celu dokładnego wprowadzenia płynów do rurki, należy użyć pompy strzykawkowej, aby pobrać roztwór zawierający kulki magnetyczne i środek powierzchniowo czynny.
   5. Wlać 20 μl roztworu kulek magnetycznych do probówki za pomocą pompy strzykawkowej. Ten segment cieczy jest określany jako komora testowa (objętość komory testowej może się różnić w zależności od eksperymentu). Podczas cyklu pobierania należy ręcznie mieszać pojemnik roztworem kulek magnetycznych, aby uzyskać jednolite dyspersje MB.
   6. Po zakończeniu wprowadzania cieczy do komory testowej należy pobrać 6 μl powietrza do probówki. Ta objętość powietrza będzie później nazywana szczeliną powietrzną.
   7. Po zakończeniu wprowadzania szczeliny powietrznej rozpocznij pobieranie 180 μl czystego środka powierzchniowo czynnego C12E5. Będzie on później nazywany zbiornikiem.
2. Konfiguracja optyki do eksperymentów z surfaktantami.
   1. Przesunąć pompę strzykawkową z rurką tak, aby komora testowa z kulkami magnetycznymi była zogniskowana za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
   2. Umieść arkusz folii polaryzacyjnej na źródle światła LED. Wsuń źródło światła LED pod rurkę dołączoną do pompy strzykawkowej.
   3. Przymocuj kolejną folię polaryzacyjną do soczewki mikroskopu stereoskopowego za pomocą taśmy. Upewnij się, że dwie folie polaryzacyjne są przesunięte względem siebie o 90 stopni.
   4. Zamontuj kamerę CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) do mikroskopu stereoskopowego. Podłącz aparat do komputera i otwórz oprogramowanie do obrazowania.

6. Procedura eksperymentalna dla eksperymentów z surfaktantami

1. Umieść magnes sześcienny obok komory testowej, podczas gdy magnes jest zamontowany na stojaku.
2. Gdy kulki magnetyczne utworzą klaster, rozpocznij pompowanie cieczy w rurze z prędkością 2 ml / godz., tak aby klaster kulek magnetycznych został przeniesiony z komory testowej, przez szczelinę powietrzną i do komory zbiornika środka powierzchniowo czynnego.
3. Gdy klaster kulek magnetycznych osiągnie punkt środkowy komory zbiornika, przerwij pompowanie na pompie strzykawkowej.
4. Odsuń magnes sześcienny od rury, umożliwiając oddzielenie się kulek magnetycznych i skrócenie czasu dyfuzji cieczy uwięzionej w klastrze kulek magnetycznych.
5. Obserwuj ekran komputera, aby obserwować, jak mieszanina_H2O/C12E5 przechodzi przez różne fazy.
6. Po zakończeniu dyfuzji i przemiany fazowej cieczy umieść magnes z powrotem w swoim pierwotnym miejscu przeznaczenia przy zbiorniku, aby kulki magnetyczne uformowały się w klaster.
7. Za pomocą pompy strzykawkowej pobrać ciecze w taki sposób, aby klaster kulek magnetycznych został przeniesiony ze zbiornika środka powierzchniowo czynnego, przez szczelinę powietrzną i z powrotem do komory testowej_H2O.
8. Gdy klaster kulek magnetycznych osiągnie punkt środkowy komory testowej, przerwij pompowanie na pompie strzykawkowej.
9. Odsuń magnes sześcienny od rury. Umożliwi to oddzielenie kulek magnetycznych i pomoże skrócić czas dyfuzji cieczy uwięzionej w klastrze kulek magnetycznych.
10. Obserwuj ekran komputera, aby obserwować, jak mieszanina_H2O/C12E5 przechodzi przez różne fazy.
11. Po zakończeniu dyfuzji i przemiany fazowej cieczy umieść magnes z powrotem w swoim pierwotnym miejscu przeznaczenia przy komorze testowej, aby kulki magnetyczne uformowały się w klaster.
12. Powtarzaj kroki 6.2-6.11, aż komora testowa wyświetli zmianę fazy.

Wyniki

Wykorzystując podejście Lab-in-Tube do transportu objętości rzędu µl cieczy za pomocą kulek magnetycznych wraz z oprogramowaniem MATLAB do analizy numerycznej, wyznaczono średnie objętości przenoszonej cieczy w funkcji masy kulek magnetycznych (Rysunek 2). Większa masa kulek magnetycznych zapewnia większą objętość przenoszenia w tempie 2-3 µl/mg. Układ eksperymentalny (Rysunek 1) został wykorzystany do obserwacji zmiany fazy wewnątrz binarnego systemu H₂O/C12E5. Ponieważ syste...

Dyskusja

W większości popularnych technik badania diagramów fazowych konieczne jest przygotowanie wielu próbek o różnym składzie i proporcjach, które muszą osiągnąć równowagę termodynamiczną, co powoduje długotrwały proces i znaczną ilość materiału. Niektóre wyzwania można rozwiązać metodą DIT (dyfuzyjny transport międzyfazowy) wykorzystującą płaską kapilę i metodę analizy w podczerwieni, ale żadna z nich nie jest w stanie rozwiązać wszystkich problemów przy niskich kosztach inwestycji.

Możliwość wykor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Koraliki magnetyczne
C12E5 Środek powierzchniowo czynny	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Magnes sześcienny	Apex Magnets	M1CU
Folia polaryzacyjna	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Roztwór fluoropolimeru
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Barwnik fluorescencyjny
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Żeński
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56
Strzykawka	Fisher Scientific	14-823-435
Pompka strzykawkowa	Stoelting	53130
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ-2T
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse Ti-U	Zastosowana kostka filtrująca miała zakres długości fali wzbudzenia w zakresie 540-580 nm oraz zwierciadło dichroiczne w zakresie 585 nm, co pozwalało na fotoemisję w zakresie 593-668 nm.
Instrumenty Balance	Denver	PI-225D
Kamera mikroskopowa	Motic	5000