Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52960

⸱

28 lipca 2015

 , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy kwantyfikację cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności digitoniny.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe patogeny bakteryjne mogą replikować się w cytozolu lub w wyspecjalizowanych wakuolach zawierających patogeny (PCV). Aby dotrzeć do cytozolu, bakterie takie jak Shigella flexneri i Francisella novicida muszą wywołać pęknięcie fagosomu. W przeciwieństwie do tego, Salmonella typhimurium replikuje się w komorze wakuolarnej, znanej jako wakuola zawierająca Salmonellę (SCV). Jednak niektóre mutanty Salmonelli nie zachowują integralności SCV i w ten sposób są uwalniane do cytozolu. Procent bakterii cytozolowych i wakuolarnych na poziomie pojedynczych bakterii można zmierzyć za pomocą różnicowej przepuszczalności, znanej również jako test ochrony przed fagosomami. Podejście to wykorzystuje właściwość detergentu digitoniny do selektywnego wiązania cholesterolu. Ponieważ błona plazmatyczna zawiera więcej cholesterolu niż inne błony komórkowe, digitonina może być stosowana do selektywnego przenikania błony plazmatycznej, pozostawiając nienaruszone błony wewnątrzkomórkowe. Krótko mówiąc, po zakażeniu patogenem wykazującym ekspresję białka markerowego fluorescencyjnego (np. mCherry), błona plazmatyczna komórek gospodarza jest przesiąknięta krótką inkubacją w buforze zawierającym digitoninę. Komórki są następnie przemywane i inkubowane z pierwszorzędowym przeciwciałem (sprzężonym z wybranym fluoroforem) skierowanym przeciwko wybranej bakterii (np. anty-Salmonella-FITC) i ponownie przemywane. W przypadku stosowania nieoznakowanych bakterii można wykonać dodatkowy krok, w którym wszystkie błony są przepuszczalne, a wszystkie bakterie barwione odpowiednim przeciwciałem. Po barwieniu procent bakterii wakuolarnych i cytozolowych można określić ilościowo za pomocą FACS lub mikroskopii, licząc zdarzenia jedno- lub podwójnie dodatnie. Poniżej przedstawiamy szczegóły eksperymentalne dotyczące stosowania tej techniki w przypadku bakterii Salmonella typhimurium. Zaletą tego testu jest to, że w przeciwieństwie do innych testów, zapewnia on kwantyfikację na poziomie pojedynczych bakterii, a jeśli jest analizowany pod mikroskopem, podaje dokładną liczbę bakterii cytozolowych i wakuolarnych w danej komórce.

Wprowadzenie

Wewnątrzkomórkowe patogeny bakteryjne replikują się albo bezpośrednio w cytozolu komórki gospodarza, albo w wyspecjalizowanych komorach wakuolarnych1. W początkowej fazie infekcji większość patogenów zostaje zinternalizowana albo przez fagocytozę przez wyspecjalizowane komórki (takie jak makrofagi), albo przez aktywne promowanie własnego wychwytu do komórek niefagocytarnych. W komórkach fagocytarnych fagosom zwykle łączy się z lizosomami, tworząc przedział degradacyjny, w którym trawione są cząstki fagocytozy. Wyspecjalizowane bakterie cytozolowe, takie jak Francisella novicida lub Shigella flexneri, unikają degradacji fagosomalnej poprzez wywołanie pęknięcia fagosomu, a następnie ulatniają się do cytozolu2,3. Wymaga to mechanizmu związanego ze zjadliwością, takiego jak Wyspa Patogenicity Francisella (FPI) lub Shigella flexneri T3SS, która wstrzykuje białka efektorowe sprzyjające pękaniu wakuolarnemu2-4. Cytozol komórki gospodarza zawiera szereg konserwatywnych receptorów rozpoznawania wzorców, które normalnie rozpoznają obecność patogenów i indukują wrodzoną sygnalizację immunologiczną5. Ponadto ksenofagia, przeciwbakteryjna forma autofagii, może degradować bakterie, które dostają się do cytozolu. Bakterie cytozolowe są zwykle dobrze przystosowane do tępienia lub obchodzenia tych reakcji przy użyciu różnych strategii. Na przykład Francisella modyfikuje swój LPS, aby uniknąć rozpoznania gospodarza, a Shigella zapobiega rekrutacji autofagii za pomocą wydzielanych białek efektorowych6,7.

Inną strategią ucieczki przed degradacją lizosomalną jest modelowy patogen wakuolarny Salmonella enterica serowar Typhimurium, dalej określany jako Salmonella typhimurium. Salmonella wykorzystuje T3SS do wstrzykiwania efektorów, które przebudowują początkowy fagosom do jego wewnątrzkomórkowej niszy, wakuoli zawierającej Salmonellę (SCV) 8,9. Ciągła manipulacja szlakami gospodarza jest niezbędna do utrzymania tej wakuoli poprzez rekrutację lipidów i innych składników odżywczych do wakuoli. Rzeczywiście, mutant sifA Salmonelli nie utrzymuje stabilności wakuolarnej i dostaje się do cytozolu komórek gospodarza w ciągu kilku godzin po zakażeniu, co powoduje aktywację wrodzonych szlaków immunologicznych i rekrutację autofagii8. Ucieczka wakuolarna Salmonelli różni się w zależności od typu komórki, która jest badana, a kilka doniesień wykazało, że w komórkach nabłonkowych nawet WT Salmonella może uciec z SCV i hiperreplikować się w cytozolu10. Ostatnie doniesienia pokazują, że wrodzone immunologiczne wykrywanie patogenów wakuolarnych zależy również od zdolności gospodarza do rozpoznawania i destabilizacji wakuoli zawierających patogen (PCV) 11-14.

Biorąc pod uwagę, że zarówno genotyp gospodarza, jak i bakterii może wpływać na rozkład bakterii wewnątrzkomórkowych między przedziałem wakuolarnym a cytozolowym, konieczne jest ilościowe określenie liczby bakterii wakuolarnych i cytozolowych. Ponieważ w większości układów eksperymentalnych komórki gospodarza są zakażone więcej niż jedną bakterią, a następnie mogą zawierać kilka bakterii w różnych przedziałach subkomórkowych, potrzebna jest technika, która umożliwia ilościowe określenie na poziomie pojedynczych bakterii. Różnicowa przepuszczalność (znana również jako test ochrony fagosomalnej) zapewnia tę rozdzielczość 2,4,10,12. Test opiera się na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej komórki gospodarza detergentem digitoniną, która pozostawia nienaruszone błony wakuolarne, a tym samym umożliwia selektywne barwienie bakterii cytozolowych przeciwciałami. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły oznaczania ilościowego cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium przy użyciu przepuszczalności różnicowej. Zasada działania tej metody jest opisana na rycinie 1: Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) są zakażone Salmonellą w fazie stacjonarnej wykazującą ekspresję mCherry. Należy stosować Salmonellę w fazie stacjonarnej, ponieważ obniżają one ekspresję SPI-1 T3SS, którego aktywność w przeciwnym razie zostałaby rozpoznana przez inflamasom NLRC4 i indukują szybką śmierć komórek (piroptozę) BMDM15. Po zakażeniu komórki przemywa się i traktuje 50 μg/ml digitoniny przez 1 minutę. Komórki są natychmiast ponownie myte i inkubowane z przeciwciałami anty-Salmonella sprzężonymi z FITC w celu oznaczenia bakterii z dostępem do cytozolu. Po dodatkowym etapie mycia komórki są poddawane lizie, a procent bakterii mCherry+ (wakuolarnych) i FITC+ / mCherry+ (cytozolowych) jest oznaczany przez FACS. Donosimy również o adaptacji tej metody, która może być zastosowana, jeśli nie są dostępne żadne szczepy wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego (ryc. 2). Po znakowaniu FITC wprowadzane są dodatkowe kroki, w których komórki są utrwalone i całkowicie przepuszczalne. Następnie wszystkie bakterie są barwione przeciwciałami anty-Salmonella i odpowiadającymi im przeciwciałami drugorzędowymi. Wykrywanie odbywa się następnie za pomocą mikroskopii zamiast analizy FACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test digitoniny z ekspresją mCherry Salmonella (analiza oparta na FACS)

  1. Przygotowanie bakterii
    Uwaga: W tym teście stosuje się Salmonellę typu dzikiego SL1344 (oporną na streptomycynę) wykazującą ekspresję mCherry z plazmidu (pFPV kodującego mCherry pod promotorem rpsM). Fagocytoza bakteryjna i proliferacja nie zostały zmienione przez konstytutywną ekspresję mCherry (dane nie pokazane) 16.
    1. Zaszczepić szczep 1 dzień przed zakażeniem w 3 ml pożywki LB uzupełnionej streptomycyną (90 μg/ml) i ampicyliną (100 μg/ml, wektor wykazujący ekspresję mCherry) w wytrząsarce w temperaturze 37 °C O/N.
  2. Posiewanie komórek do infekcji.
    1. Wysiewaj BMDM typu dzikiego na 24-dołkowej płytce o gęstości 1,25 x 105 komórek/studzienkę w 1 ml pierwotnej pożywki makrofagowej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą (FCS, inaktywowaną termicznie, 56 °C, 30 min), 1% HEPES, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-glutaminy i 10% supernatantu L929 (kondycjonowane podłoże z czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) wytwarzającego komórki L929). Studzienki nasienne zgodnie z tabelą 1 w celu uwzględnienia indywidualnych warunków. Dodać szkiełka nakrywkowe do studzienek używanych jako kontrole (tabela 1).
    2. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
PrzepuszczalnośćBarwienie
Szkiełko nakrywkowe szklaneSalmonellaDigitoninaSaponinaprzeciw Salmonellianty-Calnexinanty-PDI
A1 (próbka)-/+*+++
A2 (próbka)-/+*+++
A3 (próbka)-/+*+++
A4 (brak kontroli przepuszczalności)-/+*++
A5 (pełna kontrola przepuszczalności)-/+*+++
B1 (barwione na obecność kalneksyny)++
B2 (barwiony na obecność kalneksyny)+++
B3 (barwione na obecność kalneksyny)+++
C1 (barwiony na PDI)++
C2 (barwiony na PDI)+++
C3 (barwiony na PDI)+++

Tabela 1: Schemat posiewu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) w formacie 24-dołkowym do późniejszego zakażenia Salmonellą, przepuszczalności i barwienia. *W zależności od tego, czy protokół 1 czy protokół 2 jest wykonywany.

  1. Przygotowanie bakterii do infekcji.
    1. Następnego dnia oznacz stężenie Salmonelli w nocnej hodowli, rozcieńczając kulturę w stosunku 1:10 w PBS i mierząc OD600 w porównaniu z kontrolą tylko PBS. Gwarantuje to, że OD600 jest mierzony w zakresie liniowym spektrofotometru.
    2. Obliczyć stężenie Salmonelli na ml. OD600 równy 1 odpowiada 1 x 109 bakteriom.
    3. Rozcieńczyć bakterie w pożywce makrofagowej, aby osiągnąć stężenie Salmonelli 1,25 x 106 komórek/ml.
  2. Zakażenie komórek Salmonellą.
    1. Usunąć pożywkę z BMDM. Dodać 1 ml pożywki makrofagowej do niezakażonych studzienek kontrolnych (B1-B3, C1-C3). Dodać 1 ml zawiesiny Salmonelli do studzienek A1 - A5, aby osiągnąć wielokrotność infekcji (m.o.i.) wynoszącą 10 bakterii na komórkę.
    2. Odwirować płytkę przez 15 minut w sile 300 x g w temperaturze 37 °C w celu zsynchronizowania infekcji. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Zabijanie zewnątrzkomórkowej Salmonelli za pomocą gentamycyny.
    1. Po 1 godzinie od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 0,1 ml pożywki makrofagowej zawierającej 0,1 mg/ml gentamycyny w celu zabicia bakterii zewnątrzkomórkowych. Dodaj gentamycynę do wszystkich studzienek, nawet do niezakażonych komórek kontrolnych, aby upewnić się, że wszystkie komórki są traktowane w ten sam sposób. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Mycie komórek.
    1. Po 2 godzinach od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć wszystkie studzienki 2x 1 ml zwykłego DMEM (wstępnie podgrzanego do 37 °C) i zastąpić go pożywką makrofagową (wstępnie podgrzaną do 37 °C) zawierającą 10 μg/ml gentamycyny, aby zapobiec rozwojowi pozostałych bakterii zewnątrzkomórkowych. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Przygotowanie świeżych z detergentami i przeciwciałami.
    1. Tuż przed pożądanym punktem analizy należy przygotować świeży roztwór podstawowy digitoniny o stężeniu 1 mg/ml w buforze KHM (110 mM octan potasu, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Przefiltrować materiał podstawowy i rozcieńczyć w buforze KHM do stężenia roboczego 50 μg/ml digitoniny. Ponadto należy przygotować roztwór 0,1% saponiny w buforze KHM, przeciwciało anty-Salmonella sprzężone z FITC (CSA-1-FITC) w stosunku 1/500, anty-kalnexin w stosunku 1/100 lub anty-PDI w stosunku 1/100 w buforze KHM uzupełnionym 3% BSA.
  6. Przenikanie komórek.
    1. Wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (podgrzanego do temperatury 37 °C). Usunąć bufor KHM i dodać 0,25 ml zwykłego buforu KHM do studzienek A4 i B1 / C1, bufor KHM z digitoniną do dołków A1 - A3 i B2 / C2 lub bufor KHM z saponiną do dołków A5 i B3 / C3 (zgodnie z tabelą 1). Inkubować dokładnie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i natychmiast przemyć wszystkie studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (wstępnie podgrzanego do 37 °C).
  7. Barwienie przeciwciał pierwotnych.
    1. Usunąć bufor KHM i dodać pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (Goat anti Salmonella-FITC, 250 μl/basenik, 0,1 μg/ml) do odpowiednich studzienek (ryc. 1, tabela 1). Inkubować płytkę przez 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Umyj komórki 1x 1 ml PBS.
  8. Zainfekowane komórki (studzienki A1 - A5): analiza FACS
    1. Umyj komórki 3x PBS i dodaj 0,5 ml lodowatego PBS zawierającego 0,1% Tritonu. Przenieść do probówki FACS o pojemności 5 ml z nasadką sitową w celu rozbicia agregatów komórkowych. Próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Przeanalizuj próbki FACS. Korzystając z w pełni przepuszczalnych elementów sterujących, ustaw bramkę dla wszystkich bakterii w oparciu o rozproszenie do przodu i z boku (FSC/SSC) w pierwszej kolejności, a następnie sygnał mCherry (filtr 610 nm ± 20 nm).
    3. Następnie przeanalizuj sygnał FITC w całej populacji bakterii przy użyciu w pełni przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych kontroli, aby ustawić bramki dla bakterii cytozolowych (FITC+, mCherry+) i bakterii wakuolarnych (FITC-, mCherry+) (Figura 3).
    4. Po ustawieniu bramek przeanalizuj próbki i określ procentową zawartość bakterii cytozolowych w porównaniu z wakuolarnymi za pomocą oprogramowania FlowJo zgodnie z protokołem producenta.
  9. Niezakażone kontrole przepuszczalności (studzienki B1 - B3, C1 - C3): mikroskopia
    1. Utrwalenie
      1. Usuń PBS i dodaj 250 μl PFA 4% do PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Przemyć studzienki 2x 1 ml PBS i dodać 250 μl 0,1 M glicyny do PBS przez 10 minut w celu utrwalenia. Przemyć studzienki 2x 1 ml PBS.
    2. Wtórne barwienie przeciwciał.
      1. Kontrola przenikania barwnika przez 1 godzinę w RT z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforami w PBS uzupełnionymi 0,1% saponiną i 3% BSA, aby w pełni przepuszczalność komórek.
      2. Szkiełka nakrywkowe przemyć 3x 1 ml PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe do analizy w podłożu montażowym z DAPI (1,5 μg/ml).
    3. Analiza mikroskopowa.
      1. Analizuj szkiełka nakrywkowe za pomocą szkiełek kontrolnych w powiększeniu 40X lub 63X za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli przepuszczalność zadziałała, nie powinno być barwienia dla komórek nieprzepuszczalnych, barwienia Calnexin zarówno dla komórek przepuszczalnych digitoniną, jak i saponiny, a barwienia PDI tylko dla komórek przepuszczalnych saponiną (ryc. 4).

2. Test digitoniny z nieoznakowaną salmonellą (analiza oparta na mikroskopii)

  1. Przygotowanie bakterii do kultur O/N.
    1. Nieznakowaną Salmonellę typu dzikiego SL1344 (oporną na streptomycynę) zaszczepić 1 dzień przed zakażeniem w 3 ml pożywki LB uzupełnionej streptomycyną (90 μg/ml) w wytrząsarce w temperaturze 37 °C O/N.
    2. Posiewanie komórek do infekcji.
      1. Nasiona BMDM w 24-dołkowej płytce zawierającej sterylne szklane szkiełka nakrywkowe o gęstości 1,25 x 105 komórek/basenik w 1 ml pożywki makrofagowej (DMEM uzupełnione 10% surowicą cielęcą płodu (FCS, odkomplementowaną, 56 °C, 30 min), 1% HEPES, 1% L-aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-glutaminy i 10% L929 supernatantu). Studzienki nasienne zgodnie z tabelą 1 w celu uwzględnienia indywidualnych warunków.
      2. Inkubować komórki O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Przygotowanie bakterii do infekcji.
      1. Następnego dnia oznacz stężenie Salmonelli w kulturze O/N, rozcieńczając kulturę w stosunku 1:10 w PBS i mierząc OD600 w porównaniu z kontrolą tylko PBS. Gwarantuje to, że OD600 jest mierzony w zakresie liniowym spektrofotometru.
      2. Określ stężenie Salmonelli na mililitr. OD600 równe 1 odpowiada bakteriom 1 x 109.
      3. Rozcieńczyć bakterie w pożywce makrofagowej, aby osiągnąć stężenie Salmonelli 1,25 x 106 komórek/ml.
    4. Zakażenie komórek Salmonellą.
      1. Usuń pożywkę ze wszystkich studzienek. Dodać 1 ml zwykłej pożywki makrofagowej do niezakażonych studzienek kontrolnych (B1 - B3, C1 - C3). Dodać 1 ml zawiesiny Salmonelli do studzienek A1 - A5, aby osiągnąć wielokrotność infekcji (m.o.i.) wynoszącą 10 bakterii na komórkę.
      2. Odwirować płytkę przez 15 minut w sile 300 x g w temperaturze 37 °C w celu zsynchronizowania infekcji. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Zabijanie zewnątrzkomórkowej Salmonelli za pomocą gentamycyny.
      1. Po 1 godzinie od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 0,1 ml pożywki makrofagowej zawierającej 1 mg/ml gentamycyny, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe do wszystkich studzienek. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Mycie komórek.
      1. Po 2 godzinach od zakażenia wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć każdą studzienkę 3x 1 ml świeżej pożywki makrofagowej zawierającej 10 μg/ml gentamycyny, aby zapobiec rozwojowi pozostałych bakterii zewnątrzkomórkowych. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO2 .
    7. Przygotowanie świeżych z detergentami i przeciwciałami.
      1. Tuż przed pożądanym punktem analizy należy przygotować świeży roztwór podstawowy digitoniny o stężeniu 1 mg/ml w buforze KHM (110 mM octan potasu, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Przefiltrować materiał podstawowy i rozcieńczyć w buforze KHM do stężenia roboczego 50 μg/ml digitoniny.
      2. Ponadto należy przygotować roztwór 0,1% saponiny w buforze KHM, anty-Salmonella-FITC (CSA-1, 0,1 μg/ml), anty-kalneksyny w stosunku 1/100 lub anty-PDI w proporcji 1/100 w buforze KHM uzupełnionym 3% BSA (patrz tabela materiałów dla stężenia przeciwciał).
    8. Przenikanie komórek.
      1. Wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (podgrzanego do temperatury 37 °C). Usunąć bufor KHM i dodać 0,25 ml zwykłego buforu KHM do studzienek A4 i B1 / C1, bufor KHM z digitoniną do dołków A1 - A3 i B2 / C2 lub bufor KHM z saponiną do dołków A5 i B3 / C3 (zgodnie z tabelą 1). Inkubować dokładnie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i natychmiast przemyć wszystkie studzienki 3x 0,5 ml buforu KHM (wstępnie podgrzanego do 37 °C).
    9. Barwienie przeciwciał pierwotnych.
      1. Usuń bufor KHM i dodaj pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (kozi anty Salmonella CSA1-FITC, 250 μl/basenik, 0,1 μg/ml) do odpowiednich studzienek (ryc. 2, tabela 1). Inkubować płytkę przez 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przemyć 3x 1 ml PBS.
    10. Utrwalenie.
      1. Usuń PBS i dodaj 250 μl PFA 4% do PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Przemyć studzienki 2x 1 ml PBS i dodać 250 μl 0,1 M glicyny do PBS przez 10 minut, aby utrwalić utrwalacz. Przemyć studzienki 2x 1 ml PBS.
    11. Całkowite barwienie zakażonych próbek pod wpływem salmonelli.
      1. Przemyj szkiełka nakrywkowe 3x PBS z 0,1% saponiną/3% BSA i inkubuj próbki z przeciwciałem anty-CSA1 (kozia anty-CSA1, 0,1 μg/ml, mysi anty-LPS również działa, 0,1 μg/ml) przez 1 godzinę w RT w PBS z 0,1% saponiną/3% BSA.
      2. Umyć 3x w PBS z 0,1% saponiną/3% BSA. Inkubuj próbki z drugorzędowym przeciwciałem anty-kozim sprzężonym z wybranym fluoroforem w PBS z 0,1% saponiną/3% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      3. Szkiełka nakrywkowe przemyć 3x 1 ml PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe do analizy w podłożu montażowym z DAPI (1,5 μg/ml).
    12. Analiza mikroskopowa.
      1. Uzyskaj dane za pomocą mikroskopu konfokalnego, licząc cytozolową Salmonellę (anty-Salmonella-FITC dodatnią) i całkowitą Salmonellę (podwójnie dodatnią) (ryc. 5). Kontrole przepuszczalności powinny wykazać: brak barwienia dla komórek nieprzepuszczalnych, barwienie Calnexin dla komórek przepuszczalnych digitoniną i barwienie PDI dla komórek przepuszczalnych saponiną (ryc. 4). Studzienki A4 i A5 będą służyć jako wewnętrzna kontrola barwienia Salmonellą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 oraz Rysunek 2 przedstawiają schematy testu z użyciem digitoniny opisanego w protokole 1 i protokole 2, ilustrując kluczowe etapy procedury oraz uzyskane wyniki. Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki FACS. Kontrole pozytywne i negatywne służą do ustawienia bramek dla bakterii mCherry+/FITC- (wakularna Salmonella) oraz bakterii mCherry+/FITC+ (cytozolowa Salmonella). Na podstawie tych bramek można określić procent bakterii cytozolowych i wakularnych w próbkach doświa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Permeabilizacja różnicowa jest łatwą i solidną metodą analizy i ilościowego określenia subkomórkowego rozmieszczenia patogenów bakteryjnych między przedziałami wakuolarnymi a cytozolem. Ten sam test został z powodzeniem zastosowany w przypadku bakterii takich jak Francisella novicida2,4 i Shigella flexneri12. Ponieważ jednak wiele wewnątrzkomórkowych patogenów zmienia lub modyfikuje struktury błony wewnętrznej gospodarza, odporność przepuszczalności digitoniny będzie musiała być ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Mathiasowi S. Dickowi, Rolandowi F. Dreierowi i Sebastianowi Rühlowi za dyskusję. Praca ta była wspierana przez profesurę SNSF PP00P3_139120/1 oraz grant projektowy Uniwersytetu w Bazylei ID2153162 dla P.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DigitoninaSigmaD562850 μ g/ml
PFAmpbio219998380
HEPESLife Technologies15630
Octan potasuSigma791733
MgCl2SigmaM8266
BSASigmaA2153
anty-Salmonella CSA-1-FITCKPL01-91-99-MG1/500
anty-Salmonella CSA-1KPL02-91-99-MG1/500
anty-CalnexinEnzo LifesciencesSPA-860D1/100
anty-PDIEnzo LifesciencesSPA-8901/100
SaponinSigma47036
Podłoże montażowe VectashieldVectorlabsH-1200
Anti Rabbit anti-488Molecular SondyA-110701/500
GlycineSigmaG8898
GentamycynaLife Technologies15710-49100 μ g/ml oraz 10 &m; g/ml
Triton X-100PromegaH5141
PBSGibco20012-019
DMEMSigmaD6429
NEAAAmimed5-13K00-H
LSM700 Mikroskop konfokalnyObrazowanie Zeisswykonane w technologii 63X
FACS FortessaBDdetekcja mCherry 610 nm
FACS FortessaBDFITC 530 nm
Detekcja technologii

Bibliografia

  1. Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
  2. Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
  3. Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
  4. Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
  5. Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
  6. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
  7. Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
  8. Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
  9. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  10. Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732(2012).
  11. Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).
  12. Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
  13. Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
  14. Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
  15. Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
  16. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681(2014).
  17. Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298(2012).
  18. Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
  19. Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bakterie cytozolowebakterie wakuolarnewakuola zawieraj ca Salmonellaanaliza cytometrycznapermeabilizacja digitoninmakrofagi szpiku kostnegoSalmonella Typhimuriumtest ochrony fagosom wmikroskopia fluorescencyjna
Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.