Celem tego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Przedstawiamy 3 protokoły do prostego i niezawodnego przeprowadzania wkraplania płuc, stabilizacji i pomiarów objętości płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Możliwość bezpośredniego wstrzykiwania żywych czynników, komórek lub substancji chemicznych do płuc bez ranienia lub zabijania myszy jest ważnym narzędziem w badaniach nad rakiem płuc. Chociaż istnieje wiele opublikowanych metod pokazujących, jak intubować myszy w celu pomiaru funkcji płuc, żadna z nich nie jest pozbawiona potencjalnych problemów z szybkim wkraplaniem tchawicy w dużych kohortach myszy. W niniejszej pracy opisano prostą i szybką metodę, która umożliwia badaczowi przeprowadzenie takich wkropleń w sposób efektywny. Metoda nie wymaga żadnych specjalnych narzędzi ani oświetlenia i można się jej nauczyć przy bardzo niewielkiej praktyce. Polega na znieczuleniu myszy, wykonaniu małego nacięcia na szyi w celu uwidocznienia tchawicy, a następnie bezpośrednim wprowadzeniu cewnika dożylnego. Małe nacięcie jest szybko zamykane klejem tkankowym, a myszy mogą dojść do siebie. Wykwalifikowany uczeń lub technik może wykonywać wpaplanie średnio 2 minuty na mysz. Po ustaleniu nowotworu często zachodzi potrzeba ilościowej analizy histologicznej płuc. Tradycyjnie patolodzy zwykle nie zawracają sobie głowy standaryzacją inflacji płuc podczas fiksacji, a analizy często opierają się na systemie punktacji, który może być dość subiektywny. Chociaż czasami może to być wystarczające do oszacowania wielkości guza płuca, każda właściwa stereologiczna kwantyfikacja struktury płuc lub komórek wymaga powtarzalnej procedury utrwalania, a następnie pomiaru objętości płuc. Tutaj opisujemy proste, niezawodne procedury zarówno mocowania płuc pod ciśnieniem, jak i dokładnego pomiaru ustalonej objętości płuc. Jedynym wymogiem jest waga laboratoryjna, która jest dokładna w zakresie od 1 mg do 300 g. Przedstawione tutaj procedury mogą zatem znacznie poprawić zdolność do tworzenia, leczenia i analizowania raka płuc u myszy.
Wprowadzenie
Z wielu powodów, rak płuc nie był szeroko badany na myszach. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest to, że dostęp do płuc in vivo jest bardzo utrudniony, a analiza ilościowa nieruchomych płuc nie jest powszechnie wykonywana. Metody opisane w tym artykule mają na celu zaradzenie tej sytuacji. Celem niniejszego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Chociaż żadne z tych podejść nie jest całkowicie nowe, nie zostały one przedstawione razem jako samodzielne metody w uproszczony sposób, jak opisano tutaj.
Było wiele manuskryptów, które opisywały metody intubacji płuc myszy, głównie w celu powtórzenia czynności płucnej lub płukania oskrzelowo-pęcherzykowego u pojedynczych myszy w badaniach podłużnych. Od czasu tego oryginalnego artykułu pojawiło się kilka innych artykułów, które opisywały różne podejścia do intubacji myszy 1-9. Chociaż wszystkie te metody mogą być z powodzeniem stosowane, zwykle wymagają znacznego szkolenia i często nie są pozbawione nietrywialnej awaryjności. Ponadto, aby przeprowadzić pomiary czynności płuc, kaniula musi być na tyle ciasno dopasowana do tchawicy, aby nie było przecieku powietrza. Jednak innym praktycznym zastosowaniem intubacji jest dostarczanie określonych czynników (komórek rakowych lub innych zniewag) lub leków terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Taka procedura nie wymaga ściśle przylegającej kaniuli ani żadnego wyrafinowanego sprzętu do czynności płuc. Nowatorska cecha tej metody pokazana tutaj polega na drobnym zabiegu chirurgicznym, który umożliwia intubację bez możliwości wejścia kaniuli do przełyku. To proste podejście umożliwia udaną intubację przy stosunkowo niewielkim przeszkoleniu lub doświadczeniu. Przy użyciu tego podejścia można leczyć nawet 30 myszy/godz., a wskaźnik niepowodzeń zbliża się do zera.
Gdy myszy są gotowe do złożenia w ofierze, uszkodzone lub rakowe płuca mogą zostać usunięte do analizy histologicznej i patologicznej. Jednakże, aby prawidłowo określić ilościowo wszelkie zmienne histologiczne w celu porównania z innymi płucami, niezbędna jest standaryzacja procedur fiksacji i prawidłowe określenie ilościowe stałej objętości płuc10. W tym artykule szczegółowo opisano proste procedury, które umożliwiają ustandaryzowane procedury stabilizacji, a także sposób pomiaru stałej objętości płuc. Objętość jest istotną metryką w kwantyfikacji histologii, ponieważ bez takiego określenia objętości można zmierzyć tylko gęstości względne10. Jednak gdy objętość płuc jest znana, można określić ilościowo bezwzględne pomiary komórek i inne pomiary strukturalne w płucach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół opisuje system, który działa dobrze u myszy o wadze 20–35 g. Metodę można łatwo dostosować do większych lub mniejszych myszy, po prostu zmieniając rozmiar cewnika. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Wkraplanie do płuc
- Wybierz komercyjną kaniulę dożylną o długości jednego cala i długości 20 g, która zostanie użyta do intubacji.
- Zmodyfikuj końcówkę cewnika, zginając ją ręcznie, aby uzyskać lekką krzywiznę na końcówce, jak pokazano na rysunku 1.
- Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (15 mg/kg) wstrzykniętym IP i potwierdzić znieczulenie przez brak ruchu odruchowego. Bezpośrednio po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy. Natychmiast po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy i podaj karprofen (5-10 mg/kg m.c.) na znieczulenie pooperacyjne i wkroplone.
- Umieść mysz na wznak na pochyłej platformie. Jak pokazano na rysunku 2, duży segregator biurowy z przyklejonymi pętlami do szwów działa doskonale.
- Ogol brzuszną część szyi oraz oczyść i zdezynfekuj okolice szyi 70% alkoholem. W nowych rękawiczkach lateksowych i bezpudrowych używaj narzędzi chirurgicznych zdezynfekowanych 70% alkoholem.
- Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie chirurgiczne na szyi około 12 mm poniżej dolnego siekacza.
- Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij skórę na szyi doogonowo, aż będzie widać brzuszną ścianę tchawicy.
- Delikatnie cofnij język i włóż kaniulę z wygiętą końcówką pochyloną w kierunku brzusznej powierzchni myszy. Podobnie jak w ppkt 1.4, delikatnie pociągnąć za skórę na szyi i wprowadzić kaniulę do tchawicy.
UWAGA: Przy odrobinie wprawy cewnik będzie widoczny przesuwający się w dół tchawicy. Jeśli trafi do przełyku, nie będzie wizualnej obserwacji ruchu cewnika. W tchawicy nie wykonuje się żadnych nacięć. - Gdy cewnik jest widoczny w tchawicy na szyi, przesuń go o około 5 mm, aby niezawodnie przeszedł przez struny głosowe, ale nadal znacznie powyżej carina.
- Przygotować się do wkroplenia do 50 μl płynu, wstrzykując go przez cewnik za pomocą końcówki pipety z żelem. Umieść końcówkę w piaście typu luer, ale przed wstrzyknięciem uważnie obserwuj ruch płynu w końcówce synchronicznie z oddechem myszy. Następnie wstrzyknąć zakroplony płyn.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml natychmiast wykonaj stosunkowo szybkie napompowanie 0,6 ml powietrza do płuc przez cewnik, aby pomóc rozprowadzić płyn głęboko w płucach. Wyjmij kaniulę.
- Wyjmij kaniulę.
- Użyj niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego, aby zamknąć małą ranę pooperacyjną zgodnie z instrukcją dołączoną do opakowania VetBond. Umieść myszy w indywidualnych klatkach i monitoruj je wizualnie, dopóki się nie obudzą i nie będą zachowywać się normalnie bez żadnych oznak dyskomfortu.
2. Unieruchomienie płuc
UWAGA: Gdy wszystkie procedury eksperymentalne zostaną wykonane na myszy, płuca mogą być przygotowane do przetwarzania histologicznego poprzez utrwalenie formaldehydem (lub innym pożądanym utrwalaczem).
- Poświęć mysz za pomocą procedury akceptowalnej przez IACUC. W przypadku reprezentatywnej myszy pokazanej na filmie stosuje się zwichnięcie szyjki macicy znieczulonej myszy.
- Wykonaj tracheostomię (jeśli jeszcze tego nie zrobiono), chirurgicznie odsłaniając brzuszną stronę tchawicy, wykonując małe nacięcie i wkładając końcówkę igły 18 G do tchawicy i wiążąc ją nitką.
- Ostrożnie otwórz klatkę piersiową z nacięciem w linii środkowej, odetnij przeponę i usuń boczne ściany klatki piersiowej, aby odsłonić płuca.
- Podłączyć końcówkę typu luer igły do zbiornika na stojaku pierścieniowym zawierającym formaldehyd. Zobacz rysunek 3.
- Ustaw górną powierzchnię formaldehydu 25 cm powyżej poziomu myszy. Zobacz rysunek 3. Następnie upewnij się, że w rurce mocującej nie ma powietrza, wypuszczając płyn z końca kurka. Podłącz końcówkę typu luer kaniuli tchawicy do rurki zbiornika. Otwórz kurek, aby napompować płuca formaldehydem. Pozostaw płuca pod ciśnieniem przez co najmniej 20 minut.
- Otwórz kurek, aby napompować płuca formaldehydem. Pozostaw płuca pod ciśnieniem przez co najmniej 20 minut.
- Następnie zwiąż tchawicę poza końcem igły. Pomocne może być powolne odciąganie igły, aby odsłonić więcej niekaniulowanej tchawicy. Po bezpiecznym związaniu wyjmij kurek.
- Ostrożnie wypreparuj płuca.
- Umieść płuca w formaldehydzie na noc. Dłuższe czasy są w porządku, a niektóre plamy lub procedury mogą określać określone czasy. Również wszelkie inne płynne utrwalacze, takie jak z-fix, mogą być używane do wkraplania i zanurzania.
- Przed dalszym przetwarzaniem histologicznym należy zmierzyć stałą objętość płuc zgodnie z opisem poniżej.
3. Pomiar stałej objętości płuc
- Zmierz objętość płuc za pomocą zasady Archimedesa, jak pokazano na rysunku 4. Usunąć nieruchome płuco z formaldehydu i wyciąć serce oraz wszelką inną tkankę niepłucną.
- Użyj wcześniej skonstruowanego, prostego, domowego urządzenia podtrzymującego drut, które służy do utrzymywania płuc całkowicie pod wodą.
UWAGA: To urządzenie musi być kompatybilne z dowolną używaną wagą. Typowe urządzenie pokazane na rysunku 5 składa się z plastikowych pipet i cienkiego (20 G) drutu. System ten dobrze współpracuje z wagą używaną na filmie, ale można go łatwo dostosować do większości wag laboratoryjnych. - Umieścić zlewkę z ≈200 ml wody na wadze i wytarować z klatką podtrzymującą w wodzie. Zobacz rysunek 6. Wyjmij metalową klatkę; Umieść płuco na powierzchni wody i wciśnij klatkę pod wodę.
- Zapisz masę na wadze. Liczba ta odzwierciedla objętość wypartej wody, a zatem jest bezpośrednią miarą objętości płuc. Należy uważać, aby płuco, szew lub jakakolwiek część drucianej klatki nie dotykała boków ani dna zlewki.
- Aby uzyskać dokładność, powtórz ten pomiar. Wyjmij płuco z wody i osusz na chusteczce. Ponownie wytarować zlewkę z umieszczoną klatką i powtórzyć pomiar objętości płuc. Następnie należy uśrednić oba pomiary objętości.
UWAGA: Jeśli płuca pozostaną w formalinie dłużej niż około tygodnia, powietrze w płucach zostanie rozpuszczone w płynie. Kiedy tak się stanie, płuco zapadnie się, więc nie jest już konieczne używanie żadnego urządzenia, jak na rysunku 5, aby utrzymać płuco zanurzone. W takim przypadku objętość można zmierzyć, po prostu przytrzymując płuco za jeden ze sznurków szwowych, aż zostanie całkowicie zanurzone, jak pokazano na rysunku 4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedura opisana w pierwszym protokole sama w sobie nie prowadzi do żadnych uogólnionych wyników. Opisuje ona jedynie bardzo niezawodny sposób wprowadzania substancji bezpośrednio do tchawicy. Rysunek 7 przedstawia przykład płuca, do którego wprowadzono błękit trypanu metodą opisaną w niniejszej pracy. Widoczny jest rozległy rozkład barwnika, podobny do tego, który obserwowano w przypadku innych barwników lub znaczników podawanych bezpośrednio do tchawicy myszy11,12. Metodę tę wykorzystaliśmy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj procedury mają kilka zalet. Po pierwsze, wymagany sprzęt jest prosty i niedrogi. Po drugie, intubację można wykonać szybko z niewielką liczbą błędów. Po trzecie, zdolność do unieruchomienia płuc pod stałym ciśnieniem, a następnie zmierzenia ustalonej objętości płuc pozwala na prawidłowe określenie ilościowe struktur lub komórek w płucach10.
Jednym z możliwych minusów intubacji jest drobna operacja. Może to ograniczyć możliwość powtórzenia procedury, jeśli wymagane jest...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Waga laboratoryjna | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Można używać innych wag, jeśli mają zakres 1-300 g |
| Cewnik dożylny 20 g Luer | Insylte | Kilku innych możliwych dostawców, np. , | |
| Butelka laboratoryjna | Różne Kilku | innych możliwych dostawców |
Bibliografia
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601(2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549(2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
