Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Summary

Interesujące są rusztowania zdolne do dopasowania się do ubytków kostnych czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), wykazując jednocześnie osteoprzewodnictwo i bioaktywność. Protokół ten opisuje przygotowanie rusztowania z pamięcią kształtu na bazie dikrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnikiem i ługowania cząstek stałych (SCPL) z wykorzystaniem stopionej matrycy solnej i nałożeniu bioaktywnej powłoki polidopaminowej .

Abstract

Inżynieria tkankowa została zbadana jako alternatywna strategia leczenia krytycznych ubytków kostno-szczękowo-twarzowych (CMF). Zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego podejścia ma rusztowanie, które jest w stanie zmieścić się w nieregularnym defektu, a jednocześnie ma wymaganą biodegradowalność, wzajemne połączenia porów i bioaktywność. Ze względu na swoje właściwości odzyskiwania kształtu i trwałości, rusztowania z polimeru z pamięcią kształtu (SMP) mogą osiągnąć "samodopasowanie" wady. W ten sposób, po wystawieniu na działanie ciepłej soli fizjologicznej (~60 ºC), rusztowanie SMP stałoby się plastyczne, co pozwoliłoby na ręczne wciśnięcie go w nieregularną wadę. Późniejsze schłodzenie (~37 ºC) przywróciłoby rusztowanie do stosunkowo sztywnego stanu w obrębie defektu. Aby spełnić te wymagania, w niniejszym protokole opisano przygotowanie rusztowań SMP przygotowanych za pomocą fotochemicznego utwardzania biodegradowalnego diakrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody wymywania cząstek stałych przez odlewanie rozpuszczalnikiem (SCPL). Stopiony szablon soli jest wykorzystywany do uzyskania wzajemnych połączeń porów. Aby uzyskać bioaktywność, na powierzchnię ścian porów rusztowania nakłada się powłokę polidopaminową. Opisano również charakterystykę zachowań związanych z pamięcią samodopasowania i kształtu, wzajemnych połączeń porów i bioaktywności in vitro.

Introduction

Obecnie uważany za złoty standard leczenia ubytków kostno-czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), przeszczep pobranych autologicznych przeszczepów jest utrudniony przez skomplikowane procedury przeszczepów, chorobowość miejsca dawczego i ograniczoną dostępność¹. Szczególną trudnością jest uformowanie i zamocowanie sztywnego autoprzeszczepu w ubytku w celu uzyskania osteointegracji i zapobieżenia resorpcji przeszczepu. Inżynieria tkankowa została zbadana jako strategia alternatywna dla autoprzeszczepu i syntetycznych substytutów kości (np. cementu kostnego)^2,3. Kluczowe znaczenie dla powodzenia podejścia opartego na inżynierii tkankowej ma rusztowanie o określonym zestawie właściwości. Po pierwsze, aby osiągnąć osteointegrację, rusztowanie musi utrzymywać ścisły kontakt z sąsiednią tkanką kostną⁴. Rusztowanie powinno być również osteokondukcyjne, co pozwala na migrację komórek, dyfuzję składników odżywczych i odkładanie się tkanek nowotworowych^4,5. Takie zachowanie jest zwykle osiągane za pomocą biodegradowalnych rusztowań wykazujących wysoce połączoną morfologię porów. Wreszcie, rusztowanie powinno być bioaktywne, aby sprzyjać integracji i wiązaniu z otaczającą tkanką kostną⁵.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania rusztowania inżynierii tkankowej o tych właściwościach. Co ważne, rusztowanie to wykazuje zdolność do "samodopasowywania się" do nieregularnych defektów CMF ze względu na zachowanie pamięci kształtu⁶. Wiadomo, że termoczułe polimery z pamięcią kształtu (SMP) zmieniają kształt pod wpływem ciepła^7,8. SMP składają się z "punktów sieciowych" (tj. chemicznych lub fizycznych wiązań poprzecznych), które określają trwały kształt, oraz "segmentów przełączających", które utrzymują tymczasowy kształt i przywracają stały kształt. Segmenty przełączające wykazują temperaturę przemiany termicznej (T_trans) odpowiadającą przemianie szklistej (T_g) lub przemianie stopionej (T_m) polimeru. W rezultacie, SMP mogą być sekwencyjnie deformowane do kształtu tymczasowego w T > T_trans, utrwalane w kształcie tymczasowym w T < T_trans i odzyskiwane do trwałego kształtu w T > T_trans. W ten sposób rusztowanie SMP może osiągnąć "samodopasowanie" w obrębie wady CMF w następujący sposób⁶. Po wystawieniu na działanie ciepłej soli fizjologicznej (T > T_trans) rusztowanie SMP stałoby się plastyczne, co pozwoliłoby na ręczne wciśnięcie ogólnie przygotowanego cylindrycznego rusztowania w nieregularną wadę, przy czym odzyskiwanie kształtu sprzyja rozszerzaniu się rusztowania do granicy wady. Po schłodzeniu (T < T_trans) rusztowanie powróciłoby do swojego stosunkowo bardziej sztywnego stanu, z niestałością kształtu zachowującą swój nowy tymczasowy kształt w obrębie defektu. W tym protokole rusztowanie SMP jest przygotowywane z polikaprolaktonu (PCL), biodegradowalnego polimeru intensywnie badanego pod kątem regeneracji tkanek i innych zastosowań biomedycznych^9-11. W przypadku pamięci kształtu_{, TM} PCL służy jako T_trans i waha się od 43 do 60 ºC, w zależności od masy cząsteczkowej PCL¹². W tym protokole T_trans (tj. T_m) rusztowania wynosi 56,6±0,3 ºC⁶.

W celu osiągnięcia osteoprzewodnictwa, opracowano protokół do tworzenia rusztowań SMP opartych na PCL z wysoce połączonymi porami, opartych na metodzie wymywania cząstek stałych metodą odlewania rozpuszczalnikiem (SCPL)^6,13,14. Diakrylan polikaprolaktonu (PCL-DA) (M_n = ~ 10 000 g/mol) został wykorzystany do umożliwienia szybkiego, fotochemicznego sieciowania i rozpuszczony w dichlorometanie (DCM), aby umożliwić odlewanie rozpuszczalnikiem na matrycy solnej. Po utwardzeniu fotochemicznym i odparowaniu rozpuszczalnika, matryca soli została usunięta przez wypłukanie do wody. Średnia wielkość soli reguluje wielkość porów rusztowania. Co ważne, matryca soli została stopiona z wodą przed odlaniem rozpuszczalnikiem, aby uzyskać wzajemne połączenie porów.

Bioaktywność została przekazana rusztowaniu SMP poprzez tworzenie in situ powłoki polidopaminowej na ściankach porów⁶. Bioaktywność jest często wprowadzana do rusztowań poprzez włączenie wypełniaczy szklanych lub szklano-ceramicznych¹⁵. Mogą one jednak powodować niepożądane kruche właściwości mechaniczne. Wykazano, że dopamina tworzy przylegającą, cienką warstwę polidopaminy na różnych podłożach^16-19. W tym protokole rusztowanie SMP poddano lekko zasadowemu roztworowi dopaminy (pH = 8,5) w celu utworzenia nanogrubej powłoki polidopaminy na wszystkich powierzchniach ścian porów⁶. Oprócz zwiększania hydrofilowości powierzchni w celu poprawy adhezji i rozprzestrzeniania się komórek, wykazano, że polidopamina jest bioaktywna pod względem tworzenia hydroksyapatytu (HAp) po ekspozycji na symulowany płyn ustrojowy (SBF)^18,20,21. W ostatnim etapie rusztowanie powlekane jest poddawane obróbce cieplnej w temperaturze 85 ºC (T >_{T trans}), co prowadzi do zagęszczenia rusztowania. Wcześniej zauważono, że obróbka cieplna jest niezbędna dla zachowania pamięci kształtu rusztowania, być może ze względu na reorganizację domen krystalicznych PCL w celu zbliżenia się do bliższej odległości¹⁴.

Dodatkowo opisujemy metody charakteryzowania zachowania samodopasowania w obrębie nieregularnego defektu modelu, zachowania pamięci kształtu w kategoriach kontrolowanych przez szczep cykliczno-termicznych testów mechanicznej kompresji (tj. odzyskiwania kształtu i stałości kształtu), morfologii porów i bioaktywności in vitro. Przedstawiono również strategie dostosowywania właściwości rusztowań.

Protocol

1. Synteza makromeru PCL-DA

1. Uruchom reakcję akrylacji.
   1. Odważyć 20 g PCL-diolu (M_n = ~ 10 000 g/mol) do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte teflonem.
   2. Rozpuścić PCL-diol w DCM.
      1. Dodać 120 ml DCM do kolby (stężenie = 0,17 g/ml).
      2. Umieść luźno gumową przegrodę w szyjce kolby, aby uniknąć wzrostu ciśnienia, a jednocześnie zapobiec parowaniu DCM.
      3. Mieszać roztwór przez ~30 min przy ~250 obr./min, aby całkowicie rozpuścić polimer.
   3. Dodać ~6,6 mg 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) do roztworu i rozpuścić mieszając.
   4. Umieść gumową przegrodę bezpiecznie w szyjce kolby. Pozwól roztworowi kontynuować mieszanie.
   5. Przez gumową przegrodę delikatnie przepłukać kolbę_N2 przez ~ 3 minuty, używając wlotu igły o dodatnim ciśnieniu N₂ i otwartej igły jako wylotu.
   6. Zdemontować wlot i wylot N₂.
   7. Dodawać kroplami 0,56 ml (4,0 mmol) trietyloaminy (Et₃N) za pomocą szklanej strzykawki wyposażonej w igłę wprowadzaną przez gumową przegrodę.
   8. Dodawać kroplami 0,65 ml (8,0 mmol) chlorku akrylolu za pomocą szklanej strzykawki wyposażonej w igłę wprowadzaną przez gumową przegrodę.
   9. Umieścić wlot_N2 z powrotem w kolbie i pozostawić zawartość do mieszania pod dodatnim ciśnieniem_N2 przez ~30 min.
   10. Podgrzej kąpiel olejową do temperatury 55 °C.
   11. Po wyznaczonych ~30 minutach usuń wlot N₂ i zastąp przegrodę skraplaczem.
   12. Zanurzyć kolbę w podgrzanej kąpieli olejowej.
   13. Pozostawić zawartość kolby do mieszania przez 20 godzin.
   14. Po upływie wyznaczonych 20 godzin wyjąć kolbę z łaźni olejowej i pozostawić zawartość do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
   15. Za pomocą wyparki obrotowej usunąć rozpuszczalnik DCM z kolby.
2. Oczyść surowy produkt PCL-DA.
   1. Do kolby dodać ~135 ml octanu etylu i rozpuścić surowy PCL-DA.
   2. Przefiltrować grawitacyjnie roztwór przez bibułę filtracyjną do czystej kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. (Uwaga: Roztwór może zgęstnieć na bibule filtracyjnej, nie przechodząc łatwo przez nią. Jeśli tak, ostrożnie zastosuj łagodne ciepło za pomocą pistoletu grzewczego.)
   3. Za pomocą wyparki obrotowej usunąć rozpuszczalnik octanu etylu z kolby.
   4. Do kolby dodać ~140 ml DCM i rozpuścić surowy PCL-DA.
   5. Przenieść zawartość do rozdzielacza o pojemności 500 ml.
   6. Do lejka dodać 13,5 ml 2 M węglanu potasu (K₂CO₃ ).
   7. Zakryj lejek. Delikatnie wymieszaj dwie warstwy, odwracając lejek i delikatnie obracając raz lub dwa razy, uważając, aby uwolnić ciśnienie przez kurek. Powtórz 3 razy.
   8. Zastąp nasadkę warstwą Parafilmu i pozwól mieszaninie oddzielić O/N (~12 godzin).
   9. Zebrać dolną, organiczną warstwę do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
   10. Dodać ~5 g bezwodnego siarczanu magnezu (_MgSO4) do kolby i delikatnie zamieszać.
   11. Grawitacyjnie przefiltrować mieszaninę przez wysokiej jakości bibułę filtracyjną i do czystej kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml.
   12. Za pomocą wyparki obrotowej usunąć rozpuszczalnik DCM z kolby.
   13. Wysuszyć w wysokiej próżni, aby usunąć resztki DCM. (Uwaga: PCL-DA należy przechowywać z dala od światła.)
   14. Potwierdź akrylację za pomocą ¹H NMR^22,23.

2. Przygotowanie rusztowania SMP (Rysunek 1)

1. Przygotuj stopiony szablon soli.
   1. Za pomocą sita o średnicy 425 μm uzyskamy cząsteczki chlorku sodu (NaCl) o średnicy ~460 ± 70 μm. (Uwaga: Średnią wielkość cząstek można potwierdzić na podstawie obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej [SEM] za pomocą oprogramowania ImageJ.)¹⁴
   2. Do szklanej fiolki o pojemności 3 ml (średnica wewnętrzna = 12,9 mm) dodać 1,8 g uprzednio przesianego NaCl.
   3. Powoli dodawać, w czterech porcjach, 7,5% wag. (w przeliczeniu na masę soli) wody DI (0,146 g) do fiolki. Wymieszaj metalową szpatułką po dodaniu każdej porcji wody.
   4. Zakręć fiolkę, zawiń w chusteczkę i umieść pionowo w probówce wirówkowej. Wirować przez 15 minut przy 3 220 x g.
   5. Zdejmij nakrętkę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu O/N (~12 godzin).
2. W nowej szklanej fiolce przygotować "roztwór makromeru", łącząc 0,15 g PCL-DA na ml DCM. (Uwaga: Na jedno rusztowanie należy przygotować ~ 1 ml roztworu.) Zakręć i mieszaj roztwór na wysokich obrotach na mieszadle wirowym przez ~1 min.
3. W nowej szklanej fiolce o pojemności 3 ml przygotować "roztwór fotoinicjatora" na bazie 10% wag. 2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonu (DMP) w 1-winylo-2-pirolidynonie (NVP). Połączyć 0,115 g DMP w 1 ml NVP. (Uwaga: Dla jednego rusztowania wymagane jest ~180 μl.) Zakryj, zawiń w folię aluminiową (w celu zablokowania światła) i mieszaj roztwór na wysokich obrotach na mieszadle wirowym przez ~1 min. (Uwaga: W przypadku wcześniejszego przygotowania roztwór należy przechowywać w lodówce i chronić przed światłem.)
4. Owinąć fiolkę zawierającą roztwór makromeru (bez nakrętki) folią aluminiową (w celu zablokowania światła) i dodać za pomocą pipety 15% obj. (w przeliczeniu na całkowitą objętość roztworu makromeru) roztworu fotoinicjatora. Zakręć i mieszaj roztwór na wysokich obrotach na mieszadle wirowym przez ~1 min.
5. Owinąć fiolkę zawierającą stopioną matrycę soli (bez nakrętki) folią aluminiową (w celu zablokowania światła) i dodać za pomocą pipety wcześniej przygotowany roztwór makromeru/fotoinicjatora (~0,6 ml lub do całkowitego pokrycia matrycy).
6. Zakręć fiolkę, zawiń w chusteczkę i umieść pionowo w probówce wirówkowej. Wirować przez 10 minut przy stężeniu 1,260 x g w celu rozprowadzenia roztworu makromeru w całej matrycy.
7. Zdjąć folię aluminiową, odkręcić fiolkę i wystawić na działanie promieniowania UV (365 nm, 25 W) przez 3 minuty.
8. Usunąć "rusztowanie zawierające sól" z fiolki za pomocą pęsety po nacięciu i złamaniu górnej części szklanej fiolki.
9. W zlewce o pojemności 400 ml przygotować ~200 ml rozpuszczalnika woda/etanol (1:1 obj.
10. Rusztowanie należy utrzymywać zanurzone w rozpuszczalniku woda/etanol przez 4 dni z codzienną wymianą rozpuszczalnika.
11. Zdjąć rusztowanie z rozpuszczalnika i wysuszyć na powietrzu O/N.

3. Nakładanie powłoki polidopaminowej na rusztowanie SMP (Rysunek 1)

1. W zlewce o pojemności 400 ml wyposażonej w mieszadło pokryte teflonem przygotować ~200 ml roztworu chlorowodorku dopaminy (2 mg/ml w 10 mM buforze Tris, pH = 8,5, 25 ºC). Mieszać z prędkością ~150 obr./min.
2. Umieść jednorazową igłę (długość = 40 mm; rozstaw = 20) w rusztowaniu, ~ połowa odległości przez rusztowanie. Owinąć drut wokół piasty igły.
3. Zanurzyć rusztowanie (z piastą igły nad powierzchnią roztworu) w mieszającym roztworze dopaminy, zakotwiczając drut do krawędzi zlewki.
4. Odgazowuje rusztowanie, umieszczając strzykawkę w piaście igły i używając jej do wyciągania powietrza z rusztowania. (Uwaga: Odgazowanie jest zakończone, gdy nie można już usunąć powietrza, a roztwór całkowicie przeniknął do rusztowania.)
5. Utrzymuj rusztowanie zanurzone w mieszającym roztworze dopaminy przez 16 godzin.
6. Zdjąć rusztowanie z roztworu i usunąć igłę. Spłucz wodą DI i wysusz w piekarniku próżniowym w temperaturze RT przez 24 godziny.
7. Umieść rusztowanie w piekarniku o temperaturze 85 ºC na 1 godzinę.
8. Poczekaj, aż rusztowanie ostygnie do temperatury rynkowej. Końcowe rusztowanie cylindryczne będzie miało średnicę ~6 mm x wysokość ~5 mm.

4. Ocena "samodopasowanego" zachowania

1. Przygotuj "nieregularny model defektu CMF" za pomocą arkusza sztywnego tworzywa sztucznego o grubości ~5 mm. Użyj wiertła, aby utworzyć pustą przestrzeń w arkuszu tworzywa sztucznego o średniej średnicy nieco mniejszej niż ~6 mm, jak pokazano na rysunku 2A.
2. W zlewce podgrzej wodę DI (reprezentującą kliniczne zastosowanie soli fizjologicznej) do temperatury ~60 ºC.
3. Umieścić rusztowanie w zlewce z wodą o temperaturze ~60 ºC. Użyj pęsety, aby wepchnąć rusztowanie pod powierzchnię wody, wystawiając wszystkie obszary na działanie wody. Kontynuuj przez ~2 minuty lub do momentu, gdy rusztowanie zauważalnie zmięknie (Rysunek 2B).
4. Zdjąć rusztowanie ze zlewki i natychmiast wcisnąć (ręcznie) w wadę modelu.
5. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT (~5-10 min) (Rysunek 2C).
6. Usunąć z ubytku, aby zaobserwować nowy, stały tymczasowy kształt i powrót do stosunkowo bardziej sztywnego stanu (rysunek 2D).

5. Testowanie zachowania pamięci kształtu

1. Za pomocą dynamicznego analizatora mechanicznego (DMA; np. TA Instruments Q800 używany w niniejszym dokumencie), przeprowadzić kontrolowany przez odkształcenie test cykliczno-termicznego mechanicznego ściskania na rusztowaniu w ciągu dwóch cykli (N) w celu określenia stałości kształtu (R_f) i odzyskiwania kształtu (R_r) (Rysunek 3).
   1. Utrzymywać w równowadze do 60 °C (_{T high}) przez 5 min.
   2. Ściskanie do maksymalnego odkształcenia (ε_m = 50 %) przy 50 %/min.
   3. Trzymaj na ε_m (5 min).
   4. Schłodzić do 25 °C (_{T low}) i utrzymać przez 10 minut, aby utrwalić tymczasowy kształt.
   5. Usuń ładunek.
   6. Zmierz ostateczne odkształcenie w stanie bezstresowym (ε_u).
   7. Podgrzej ponownie do 60 °C (_{T high}) i utrzymuj przez 10 minut, aby odzyskać trwały kształt.
   8. Zmierz odzyskany szczep (ε_p).
   9. Pozostając jeszcze w temperaturze 60 °C (_{T high}), rozpocząć drugi cykl (N = 2) poprzez ściśnięcie rusztowania do 50 % wysokości odzyskanej po 1. cyklu (N = 1).
   10. Powtórzyć 5.1.3-5.1.8 dla N = 2.
   11. Oblicz R_f i R_r dla N = 1 i 2, korzystając z następujących równań:
       R_f(N) = [ε_u(N)/ ε_m]R_r(N) = [ε_m - ε_p(N)]/[ε_m- ε_p(N-1)]

6. Wizualizacja wielkości porów i wzajemnych połączeń porów

1. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM; np. FEI Quanta SEM, jak zastosowano w niniejszym dokumencie), obserwuj wielkość porów i wzajemne połączenia porów.
   1. Za pomocą pęsety do przytrzymania rusztowania SMP zanurzyć w płynie N₂ na 1 minutę.
   2. Usunąć z cieczy N₂ i rozbić wzdłuż środka rusztowania czystą żyletką.
   3. Za pomocą taśmy węglowej przymocuj jedną z połówek rusztowania SMP do stolika na próbkę tak, aby pęknięta powierzchnia była skierowana do góry.
   4. Napylanie warstwowe z Au-Pt (~4 nm).
   5. Przechwyć obraz SEM przy zalecanym napięciu przyspieszającym 10-15 kV ( Rysunek 4A).

7. Badanie bioaktywności in vitro

1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj ~30 ml 1X SBF²⁴.
2. Zaopatrz się w rusztowanie w oryginalnym, cylindrycznie formowanym trwałym kształcie. Przetnij rusztowanie na pół (w poprzek okrągłej krawędzi) za pomocą czystego ostrza.
3. Umieść pojedynczą połówkę rusztowania w przygotowanej probówce wirówkowej i nasadce.
4. Utrzymuj probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej w warunkach statycznych bez zmian SBF.
5. Po 14 dniach zdjąć rusztowanie z SBF i schnąć na powietrzu przez 24 godziny.
6. Za pomocą taśmy węglowej przymocuj rusztowanie do stolika na próbkę tak, aby pęknięta powierzchnia była skierowana do góry.
7. Napylanie warstwowe z Au-Pt (~4 nm).
8. Uchwyć obraz SEM przy zalecanym napięciu przyspieszającym 10-15 kV (rysunek 4B).

Results

Powstałe rusztowanie SMP oparte na PCL jest w stanie samodzielnie dopasować się do modelu defektu CMF (Rysunek 2). Po krótkim wystawieniu na działanie ciepłej soli fizjologicznej (~60 °C) cylindryczne rusztowanie mięknie, umożliwiając ręczne wciśnięcie rusztowania w wadę modelu i rozszerzanie się w niej. Po schłodzeniu do temperatury rynkowej rusztowanie jest mocowane w nowym, tymczasowym kształcie, który zostaje zachowany po usunięciu z ubytku.

Zachowanie pamięci kształtu rus...

Discussion

Protokół ten opisuje przygotowanie powlekanego polidopaminą rusztowania na bazie PCL, którego samodopasowanie, a także osteoindukcyjność i bioaktywność sprawiają, że jest ono interesujące w leczeniu nieregularnych ubytków kostnych CMF. Aspekty protokołu mogą być zmieniane w celu zmiany różnych funkcji rusztowania.

Protokół rozpoczyna się od arylacji PCL-diolu w celu umożliwienia utwardzenia promieniami UV. W podanym przykładzie PCL-diol M_n wynosi ~10 000 g/mol. Jednak poprzez odpowi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polikaprolakton-diol (Mn ~ 10 000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichlorometan (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Suszone na sitach molekularnych
4-dimetyloaminopirydyna (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Trietyloamina (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Chlorek akrylu	Sigma-Aldrich	A24109
Octan etylu	Sigma-Aldrich	319902
Węglan potasu (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Bezwodny siarczan magnezu (MgSO4)	Fisher	M65
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimetoksy-2-fenyl acetofenon (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-winylo-2-pirolidynon (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Chlorowodorek dopaminy	Sigma-Aldrich	H8502
Bufor Tris (2mol/L)	Fisher	BP1759	Stosowany przy stężeniu 10 mM, pH = 8,5
Sito	VWR	47729-972
Oświetlacz UV (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Wirówka	Eppendorf	5810 R
Dynamiczny analizator mechaniczny (DMA)	TA Instruments	Q800
Powlekarka do napylania o wysokiej rozdzielczości	Cressington	208HR
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)	FEI	Quanta 600