TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Zrozumienie, w jaki sposób komórki nabywają określone właściwości podczas rozwoju, jest kluczowe, aby docenić złożoność organów i ich potencjalną ewolucję w kierunku stanów patologicznych. Istnieje duży nacisk badawczy na rozszyfrowanie sieci regulacyjnych genów, które leżą u podstaw specyfikacji i różnicowania komórek, poprzez nieujawnianie globalnych profili ekspresji genów, statusu wiązania Pol II, zajętości czynnika transkrypcyjnego w sekwencjach regulatorowych lub potranslacyjnych modyfikacji histonów.

Do oceny ekspresji genów na poziomie globalnym stosuje się mikromacierze i metody sekwencyjne RNA. Mikromacierze pozwalają na wykrycie obfitości mRNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA jest lepiej nastawione na informowanie o różnych typach RNA, w tym kodujących i niekodujących RNA, takich jak mikroRNA, lncRNA lub snRNA. Jednak techniki te nie są w stanie rozróżnienia mRNA w stanie stacjonarnym z aktywną transkrypcją, mRNA z aktywną translacją i mRNA wchodzącego w proces degradacji. Wiadomo, że pomiar poziomów mRNA w stanie stacjonarnym jest słabym oszacowaniem składu proteomu^1-3. Wręcz przeciwnie, identyfikacja aktywnie translującego mRNA daje dokładniejszy obraz produkcji białek.

Jednak badania transkryptomiczne były prowadzone głównie na poziomie całego organizmu, porównując przyrost lub utratę funkcji określonego czynnika do stanu^{dzikiego typu 4-7} lub na wypreparowanej tkance, co utrudnia interpretację profili ekspresji genów. Niedawne postępy w narzędziach do celowania w komórki, oczyszczanie powinowactwa i poprawa czułości pozwalają obecnie na przeprowadzanie analiz całego genomu na małych populacjach komórek, a nawet pojedynczych komórkach w żywym organizmie.

U Drosophila, duże zbiory linii transgenicznych umożliwiają specyficzne czasowe i przestrzenne celowanie w różne tkanki i subpopulacje komórek za pomocą systemu GAL4/UAS^8-10, co pozwala na dokładniejsze określenie mechanizmów molekularnych wymaganych do funkcjonowania komórki.

Wśród nowo opracowanych metod profilowanie polisomów metodą frakcjonowania zostało opisane jako sposób na wychwytywanie aktywnie translującego RNA¹¹. Ta metoda oparta na wirowaniu w gradiencie sacharozy pozwala na wybór frakcji polisomowej i określenie mRNA translowanego w całym genomie podczas analizy za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Izolację polisomów można połączyć z trawieniem nukleazy w celu identyfikacji śladów rybosomalnych odpowiadających fragmentom RNA chronionym przez rybosomy podczas procesu translacji¹². Ślad rybosomalny zwiększa dokładność kwantyfikacji translacji RNA i rozdzielczości na poziomie sekwencji RNA oraz pozycjonowania rybosomów, umożliwia pomiar szybkości translacji. Jednak do tej pory nie zastosowano go do specyficznej dla komórki izolacji translatomów, głównie ze względu na silny spadek wydajności RNA uzyskanej pod koniec procesu śladu rybosomowego. Biorąc pod uwagę, że wybór wielkości RNA może generować potencjalne fałszywie dodatnie wyniki z różnych RNP, które mogą również chronić RNA w podobny sposób, potrzebne są dalsze postępy, aby poprawić ślad rybosomalny i dostosować go do podejść specyficznych dla komórki.

Jedna z takich metod, zwana Oczyszczaniem Powinowactwa Rybosomów (TRAP), została opisana w 2008 roku przez Heimana i wsp. i zastosowana do wyizolowania translatomu z podzbioru neuronów u myszy. Poprzez znakowanie epitopowe białka rybosomalnego w sposób specyficzny dla typu komórki, polisomy mogą być selektywnie oczyszczane bez pracochłonnego etapu dysocjacji i sortowania komórek. W tym przypadku białko rybosomalne 60S L10a na powierzchni rybosomu zostało oznaczone eGFP ¹³. Od 2008 roku w kilku badaniach stosowano tę metodę na różnych gatunkach, od myszy^{w wieku 14-19} lat po X. laevis^20,21, danio pręgowanego^22,23 i Arabidopsis thaliana ²⁴. Metoda TRAP została również dostosowana do modelu Drosophila i wykorzystana do oczyszczania mRNA specyficznych dla typu komórki z komórek ^{neuronalnych 25} i astrocytów ²⁶. Wszechstronny binarny system GAL4/UAS został wykorzystany do ekspresji RpL10A znakowanego GFP w sposób specyficzny dla tkanki. Głowy dorosłych muszek zostały wypreparowane w celu przeprowadzenia selekcji polisomów z komórek neuronalnych (celowanych przez pan-neuronalny sterownik Elav-Gal4) i zsekwencjonowano izolowane RNA. Duża liczba genów regulowanych w górę odpowiadała tym, o których wiadomo, że ulegają ekspresji w układzie nerwowym, co wskazuje, że podejście to ma dobrą specyficzność i skłania nas do dostosowania go do rzadkich populacji komórek (mniej niż 1% komórek) obecnych w rozwijających się zarodkach Drosophila.

W modelu Drosophila, stadium embrionalne jest modelem z wyboru do badania procesów rozwojowych, ponieważ aktorzy molekularni i ruchy morfogenetyczne są ewolucyjnie zachowane. Jedyne specyficzne tkankowo podejścia transkryptomiczne przeprowadzone do tej pory w tym modelu zostały przeprowadzone przy użyciu sortowania komórkowego lub jądrowego i były w stanie zbadać tylko transkryptom w stanie ustalonym ^27-31, co stworzyło zapotrzebowanie na metody dedykowane profilowaniu translatomu specyficznemu dla tkanki/komórki w zarodku muchy. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony zarodkom Drosophila. Dzięki tej metodzie udało się wyizolować mRNA zaangażowane w translację w bardzo ograniczonej populacji komórek liczącej około 100 komórek mięśniowych na zarodek z zachowaniem wysokiej jakości i swoistości. Binarny system GAL4 / UAS jest używany do sterowania ekspresją RpL10A znakowanego GFP w subpopulacji mięśni bez żadnej toksyczności, bez widocznych fenotypów lub opóźnienia rozwojowego, jak wykazano wcześniej²⁵. Zarodki Drosophila posiadają 30 mięśni na półsegment, które dadzą początek muskulaturze larwy. Wykorzystując region regulatorowy odkryty w pobliżu genu tożsamości garbu, celem jest 6 z 30 mięśni wielojądrowych. W tym teście rybosomy są unieruchamiane na mRNA za pomocą inhibitora wydłużania translacji cykloheksymidu. Ekstrakty cytozolowe są następnie używane do oczyszczania powinowactwa za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem GFP. Jakość oczyszczonego RNA zweryfikowano za pomocą bioanalizatora. Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) został wykorzystany do określenia swoistości i czułości izolacji mRNA i wykazał, że nasz zoptymalizowany protokół jest bardzo skuteczny.

1. Generowanie linii muchowej

1. Wygeneruj dwie różne konstrukcje. W pierwszym konstrukcie cDNA RpL10A (podjednostka białka rybosomalnego L10a) jest klonowane za GFP do plazmidu pUASP-PL-GFP-Nter (zmodyfikowana wersja z³²). Zastosowanie promotora linii zarodkowej pozwala na bardziej wielowartościowe wykorzystanie linii transgenicznej.
   UWAGA: Uzyskaj drugi konstrukt poprzez sklonowanie sekwencji regulatorowej napędzającej specyficzną tkankowo ekspresję genu garbu przed GAL4 (TF) przy użyciu plazmidu pPTGAL4.
2. Wstrzyknąć plazmidy oddzielnie do muszek w¹¹¹⁸ i wprowadzić konstrukty do genomu muchy przez insercję elementu P (zgodnie ze standardową procedurą)³³.
3. Wybierz transformanty, aby odzyskać linie muchowe z konstruktami na dwóch różnych chromosomach. Ostateczna linia TRAP jest tworzona przez połączenie tych dwóch linii (krzyżówek genetycznych) w celu uzyskania jednej podwójnej stabilnej linii transgenicznej. F0: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; MKRS/TM6B x w-; Cyo/SCU; Garbaty Gal4/TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; Garbaty Gal4/TM6B. Znacznie wzmocnij tę linię i zbierz pożądane zarodki w stadium.

2. Pobieranie zarodków

1. Przygotuj 8 dużych cylindrycznych klatek populacyjnych zawierających około 40 g młodych much w klatce (około 180 000 much w klatce).
2. Kontynuuj tak zwane pre-lays, które pozwalają muchom usunąć rozwijające się zarodki z ich jajowodów. W tym celu połóż muchy na 1 godzinę na dwóch szalkach Petriego o średnicy 11 cm, zawierających mieszaninę zestalonego agaru i soku winogronowego i przykryj 1/3 powierzchni świeżo przygotowaną pastą drożdżową. Po 3 wymianach talerzy z sokiem winogronowym zbierz prawdziwe zarodki na podobnych świeżo przygotowanych talerzach.
   UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od badanego okna rozwojowego.
3. Wyjąć płytki z klatek i pozostawić je w tej samej temperaturze przez czas potrzebny do uzyskania prawidłowego stadium rozwojowego (np. 3 godziny składania jaj + 10 godzin dodatkowej inkubacji dają zarodki w stadium 10-13 godzin po złożeniu jaj (AEL)). Zawiesić zawartość płytki (zarodki, pasta drożdżowa, martwe muchy) w 50 ml wody za pomocą pędzla.
4. Przejść przez szereg sit (700 μm, 355 μm, 112 μm) w celu oddzielenia zarodków od martwych much i pozostałych części ciała i zebrać zarodki zatrzymane na sicie o mniejszej średnicy, a następnie krótko umyć w wodzie dejonizowanej. Nie używaj więcej niż 18 płytek na kolekcję, ponieważ może to zatkać sita.
5. Dechorionate zarodki w 4,5% wybielaczu w dejonizowanej wodzie przez 2 minuty i dokładnie płukać wodą dejonizowaną przez 30-60 sekund. Inkubować zarodki w PBS 0,01% Tween 20, 100 μg/ml cykloheksymidu, przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
6. Wysuszyć zarodki na celulozowych arkuszach chłonnych i przenieść je do probówek do mikrowirówek. Zważyć probówki i błyskawicznie zamrozić zarodki przez zanurzenie w ciekłym azocie. Na tym etapie wysuszone zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem GFP

1. Dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne Protein G w oryginalnej butelce przez delikatne mieszanie.
2. Przenieś 90 μl kulek do probówki wolnej od RNaz i zbierz je na magnesie (30–60 sekund). Do przeprowadzenia immunoprecypitacji (IP) z użyciem 1 ml lizatu zawierającego 60-80 mg/ml białek niezbędne jest 90 μl kulek. Przestrzegaj proporcji, aby zapobiec nasyceniu ściegów. Użyj kilku probówek w zależności od ilości białka.
3. Umyj koraliki za pomocą 1× PBS 0,01% Tween 20 (500 μl) i zbierz koraliki na magnesie, aby usunąć supernatant. Dodać 30 μg przeciwciała GFP w 350 μl PBS 0,01% Tween 20 do kulek i inkubować z powolnym mieszaniem koniec nad końcem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zebrać kulki na magnesie (30-60 sek), wyrzucić supernatant i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl₂ 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor proteazy 1×, inhibitor RNazy 100 U).
5. Zbierz kulki na magnesie i dodaj 500 μl buforu blokującego (BSA 0,1 μg/μl, tRNA drożdży 0,1 μg/μl, glikogen 0,1 μg/μl w buforze do ekstrakcji polisomów).
6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć ten krok raz ze świeżym buforem blokującym.
7. Zebrać kulki na magnesie i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów, a następnie zebrać kulki i natychmiast przejść do etapu oczyszczania immunologicznego (sekcja 6).

4. Przygotowanie lizatu

1. Przed rozpoczęciem ustaw program na wielokierunkowej szlifierce do kulek szybkoobrotowych: 2×10 s przy 5,000 obr./min, 15 sec pauza. Przenieść wysuszone zarodki (1,5 g) do 15 ml probówek wstępnie schłodzonych na lodzie zawierających bufor do ekstrakcji polisomów i natychmiast poddać homogenizacji. Homogenizować 1,5 g zarodków w 4 ml buforu do ekstrakcji polisomów.
2. Rozłóż homogenizowane zarodki w dwóch wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 2 ml i zmiel zarodki, uruchamiając program homogenizatora. Przenieść lizat do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek mikrowirówek na lodzie i przygotować postjądrowy supernatant przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 2 000 g.
3. Przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówki na lodzie, dodać 1/100 objętości próbki 10% Nonidetu P-40 do supernatantu (stężenie końcowe = 0,1%) i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.
4. Odwirować pulsacyjnie próbkę w minifuge, aby zebrać ciecz na dnie probówki, dodać 1/9 objętości próbki 300 mM 1,2-Diheptanoilo-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (stężenie końcowe = 30 mM), delikatnie wymieszać przez odwrócenie probówki i inkubować mieszaninę na lodzie przez 5 minut (mieszać przez kilkakrotne odwrócenie podczas inkubacji).
5. Przygotować supernatant pomitochondrialny przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 20 000 g. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda: stężenie w lizacie powinno wynosić 60-80 mg/ml. Przenieść supernatant do nowej, świeżo schłodzonej probówki mikrowirówki i natychmiast przejść do etapu wstępnej absorpcji (sekcja 5).

5. Wstępna absorpcja

1. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne mieszanie i przenieść 30 μl kulek do probówki mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej (30 μl kulek/1 ml lizatu embrionalnego).
2. Zebrać kulki na magnesie, odpipetować supernatant i ponownie zawiesić kulki w buforze do ekstrakcji polisomów (500 μl). Zebrać koraliki na magnesie, dodać lizat embrionalny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   1. Usuń kulki i trzymaj supernatant na lodzie do etapu oczyszczania immunologicznego. Przed immunooczyszczaniem należy zachować 100 μl supernatantu (wejście), aby porównać globalną próbkę RNA z próbką RNA pobraną po oczyszczeniu immunologicznym, na przykład metodą RT-qPCR.

6. Oczyszczanie immunologiczne

1. Dodać 1 ml (co odpowiada 60-80 mg/ml białka) wstępnie wchłoniętego lizatu do probówki wolnej od RNaz zawierającej 90 μl zablokowanych kulek sprzężonych z przeciwciałem GFP. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, delikatnie mieszając od końca do końca w rotatorze probówkowym. Alternatywnie przeprowadzić inkubację O/N w temperaturze 4 °C.
2. Po inkubacji zbierz koraliki na magnesie. Za pomocą minifuge odwiruj kulki, a następnie zawieś je ponownie w 500 μl buforu do płukania (Hepes 10mM, KCl 350mM, MgCl₂ 5mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor RNazy 100 U) i zbierz je na magnesie. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
3. Wymień koraliki na nową, wstępnie schłodzoną probówkę wolną od RNaz i umyj dwukrotnie. Zbierz kulki na magnesie i przystąp do ekstrakcji RNA, dodając 1 ml TRiZol bezpośrednio do kulek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Oczyszczanie RNA i ocena jakości

1. Użyj zestawu RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu eluuj RNA wodą wolną od (x) μl RNazy. Ogrzewać przez 2 minuty w temperaturze 60 °C i przechowywać zamrożone próbki w temperaturze -80 °C. Sprawdź jakość RNA za pomocą bioanalizatora (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
2. Aby przetestować swoistość RNA TRAPed, należy przeprowadzić odwrotną transkrypcję na 3 ng oczyszczonego RNA (wejście i IP) zgodnie z instrukcjami producenta (indeks górny III). Użyj cDNA uzyskanego do qPCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla genu.

Embrionalny somatyczny układ mięśniowy Drosophila składa się z 30 mięśni na półsegment, a każdy mięsień ma określony zestaw właściwości: kod tożsamości genów, pozycję, liczbę zdarzeń fuzji, miejsca przyczepu i unerwienie. Identyfikacja translowanego mRNA w określonym podzbiorze mięśni dostarczy informacji na temat białek wymaganych do wytworzenia tych specyficznych cech mięśni. Za pomocą metody opartej na TRAP oczyszczono RNA z subpopulacji mięśni wyrażających garb genu tożsamości (ryc. 1A-B). Głównym problemem związanym z tym podejściem jest jakość i swoistość wyizolowanego RNA. Opisany tutaj zoptymalizowany protokół umożliwił systematyczne odzyskiwanie wysokiej jakości RNA ocenianego za pomocą analizy bioanalizatora. Uzyskany profil nie wykazuje degradacji RNA (ryc. 1C).

W innych badaniach opracowanych wokół metody TRAP, pojawiły się pytania dotyczące szczegółowości danych. Tutaj ulepszamy metodę tłumienia tła związanego z niespecyficznym wiązaniem RNA z kulkami lub rurkami oraz poprzez optymalizację bufora płuczącego. Aby ocenić poziom tła i skuteczność izolowania komórek wykazujących ekspresję garbienia, przeprowadziliśmy próby RT-qPCR na 3 powtórzeniach tego samego stadium embrionalnego. Obliczono wzbogacenie fałd 4 różnych genów (mef2, slouch, prospero, soxNeuro) w porównaniu z danymi wejściowymi i znormalizowano względem genu RpL32 (ryc. 1D). Wyniki te wykazały 2,3-krotne wzbogacenie genu pan-muskularnego mef2 i5,6-krotne wzbogacenie genu garbienia. W przeciwieństwie do tego, dwa geny ulegające ekspresji w układzie nerwowym były zubożone w porównaniu z danymi wejściowymi. Bardzo podobne wartości zmiany krotności zaobserwowano na 3 kontrpróbach biologicznych, co pokazuje, że protokół jest solidny. Za pomocą sterownika Slouch-Gal4 i zaczynając od 1,5 g, uzyskano około 1,5x10^6 zarodków, które zawierają 100 komórek GFP / zarodek (łącznie 150×10^6 komórek dodatnich).

Po przeprowadzeniu eksperymentu TRAP, wydajność wynosi około 25-45 ng specyficznego RNA, w zależności od etapu zainteresowania. Ten materiał jest wystarczający do przeprowadzenia analizy mikromacierzy lub sekwencji RNA przy użyciu protokołu amplifikacji w celu zbudowania biblioteki sekwencyjnej RNA. Wydajność będzie w dużym stopniu zależała od siły sterownika użytego do wyrażenia RpL10A-EGFP.

Rysunek 1. Ocena jakości i swoistości RNA izolowanego metodą TRAP z zarodków Slouch-GAL4>UASRpL10A-EGFP.

(A-B) Konfokalne obrazy zarodka stadium 16 pokazujące ekspresję RpL10A-EGFP w szczególności w sześciu komórkach mięśniowych Slouch na półsegment (A). Kolokalizację RpL10A-EGFP z ogólnym markerem mięśniowym Beta3tubuliną obserwuje się na obrazie łączenia (B). (C) Kontrola jakości RNA TRAPed została przeprowadzona na bioanalizatorze wykazującym doskonałą integralność rRNA 18S i 28S. (D) Analiza RT-qPCR wykazała wysoką specyficzność eksperymentów mRNA izolowanych przez TRAP na 3 replikach biologicznych zarodków w stadium 16. Zmiana krotności jest obliczana w porównaniu z danymi wejściowymi i normalizowana względem genu RpL32. Transkrypty Mef2 obecne we wszystkich liniach mięśniowych są 2,3-krotnie wzbogacone w porównaniu z danymi wejściowymi, podczas gdy bardziej ograniczone transkrypty garbienia są wzbogacone 5,6-krotnie. Komórki nerwowe wykazujące ekspresję genów prospero i soxN są uszczuplone odpowiednio 2,2-krotnie i 5,5-krotnie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n=3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.