Artykuł metodologiczny

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

DOI:

10.3791/52985

⸱

10 września 2015

 ,  ,  ,  , 
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar poziomów mRNA w procesie translacji w poszczególnych komórkach dostarcza informacji o białkach zaangażowanych w funkcje komórkowe w danym momencie. Protokół nazwany Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić ten proces translacji mRNA w sposób specyficzny dla typu komórki. Opierając się na oczyszczaniu powinowactwa polisomów zawierających znakowaną podjednostkę rybosomalną, TRAP może być stosowany do analiz translatomów w poszczególnych komórkach, umożliwiając porównywanie typów komórek w trakcie procesów rozwojowych lub śledzenie postępów w rozwoju choroby i wpływu potencjalnych terapii na poziomie molekularnym. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną wersję protokołu TRAP, zwaną TRAP-rc (rzadkie komórki), poświęconą identyfikacji RNA zaangażowanych w translację z rzadkich populacji komórek. Projekt TRAP-rc poddano walidacji przy użyciu systemu celowania Gal4/UAS w ograniczonej populacji komórek mięśniowych w zarodkach Drosophila. Ten nowatorski protokół umożliwia odzyskiwanie RNA specyficznego dla typu komórki w ilościach wystarczających do globalnej analizy ekspresji genów, takiej jak mikromacierze lub sekwencja RNA. Solidność protokołu i duże zbiory sterowników Gal4 sprawiają, że TRAP-rc jest bardzo wszechstronnym podejściem z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach całego genomu specyficznych dla komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, w jaki sposób komórki nabywają określone właściwości podczas rozwoju, jest kluczowe, aby docenić złożoność organów i ich potencjalną ewolucję w kierunku stanów patologicznych. Istnieje duży nacisk badawczy na rozszyfrowanie sieci regulacyjnych genów, które leżą u podstaw specyfikacji i różnicowania komórek, poprzez nieujawnianie globalnych profili ekspresji genów, statusu wiązania Pol II, zajętości czynnika transkrypcyjnego w sekwencjach regulatorowych lub potranslacyjnych modyfikacji histonów.

Do oceny ekspresji genów na poziomie globalnym stosuje się mikromacierze i metody sekwencyjne RNA. Mikromacierze pozwalają na wykrycie obfitości mRNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA jest lepiej nastawione na informowanie o różnych typach RNA, w tym kodujących i niekodujących RNA, takich jak mikroRNA, lncRNA lub snRNA. Jednak techniki te nie są w stanie rozróżnienia mRNA w stanie stacjonarnym z aktywną transkrypcją, mRNA z aktywną translacją i mRNA wchodzącego w proces degradacji. Wiadomo, że pomiar poziomów mRNA w stanie stacjonarnym jest słabym oszacowaniem składu proteomu1-3. Wręcz przeciwnie, identyfikacja aktywnie translującego mRNA daje dokładniejszy obraz produkcji białek.

Jednak badania transkryptomiczne były prowadzone głównie na poziomie całego organizmu, porównując przyrost lub utratę funkcji określonego czynnika do stanudzikiego typu 4-7 lub na wypreparowanej tkance, co utrudnia interpretację profili ekspresji genów. Niedawne postępy w narzędziach do celowania w komórki, oczyszczanie powinowactwa i poprawa czułości pozwalają obecnie na przeprowadzanie analiz całego genomu na małych populacjach komórek, a nawet pojedynczych komórkach w żywym organizmie.

U Drosophila, duże zbiory linii transgenicznych umożliwiają specyficzne czasowe i przestrzenne celowanie w różne tkanki i subpopulacje komórek za pomocą systemu GAL4/UAS8-10, co pozwala na dokładniejsze określenie mechanizmów molekularnych wymaganych do funkcjonowania komórki.

Wśród nowo opracowanych metod profilowanie polisomów metodą frakcjonowania zostało opisane jako sposób na wychwytywanie aktywnie translującego RNA11. Ta metoda oparta na wirowaniu w gradiencie sacharozy pozwala na wybór frakcji polisomowej i określenie mRNA translowanego w całym genomie podczas analizy za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Izolację polisomów można połączyć z trawieniem nukleazy w celu identyfikacji śladów rybosomalnych odpowiadających fragmentom RNA chronionym przez rybosomy podczas procesu translacji12. Ślad rybosomalny zwiększa dokładność kwantyfikacji translacji RNA i rozdzielczości na poziomie sekwencji RNA oraz pozycjonowania rybosomów, umożliwia pomiar szybkości translacji. Jednak do tej pory nie zastosowano go do specyficznej dla komórki izolacji translatomów, głównie ze względu na silny spadek wydajności RNA uzyskanej pod koniec procesu śladu rybosomowego. Biorąc pod uwagę, że wybór wielkości RNA może generować potencjalne fałszywie dodatnie wyniki z różnych RNP, które mogą również chronić RNA w podobny sposób, potrzebne są dalsze postępy, aby poprawić ślad rybosomalny i dostosować go do podejść specyficznych dla komórki.

Jedna z takich metod, zwana Oczyszczaniem Powinowactwa Rybosomów (TRAP), została opisana w 2008 roku przez Heimana i wsp. i zastosowana do wyizolowania translatomu z podzbioru neuronów u myszy. Poprzez znakowanie epitopowe białka rybosomalnego w sposób specyficzny dla typu komórki, polisomy mogą być selektywnie oczyszczane bez pracochłonnego etapu dysocjacji i sortowania komórek. W tym przypadku białko rybosomalne 60S L10a na powierzchni rybosomu zostało oznaczone eGFP 13. Od 2008 roku w kilku badaniach stosowano tę metodę na różnych gatunkach, od myszyw wieku 14-19 lat po X. laevis20,21, danio pręgowanego22,23 i Arabidopsis thaliana 24. Metoda TRAP została również dostosowana do modelu Drosophila i wykorzystana do oczyszczania mRNA specyficznych dla typu komórki z komórek neuronalnych 25 i astrocytów 26. Wszechstronny binarny system GAL4/UAS został wykorzystany do ekspresji RpL10A znakowanego GFP w sposób specyficzny dla tkanki. Głowy dorosłych muszek zostały wypreparowane w celu przeprowadzenia selekcji polisomów z komórek neuronalnych (celowanych przez pan-neuronalny sterownik Elav-Gal4) i zsekwencjonowano izolowane RNA. Duża liczba genów regulowanych w górę odpowiadała tym, o których wiadomo, że ulegają ekspresji w układzie nerwowym, co wskazuje, że podejście to ma dobrą specyficzność i skłania nas do dostosowania go do rzadkich populacji komórek (mniej niż 1% komórek) obecnych w rozwijających się zarodkach Drosophila.

W modelu Drosophila, stadium embrionalne jest modelem z wyboru do badania procesów rozwojowych, ponieważ aktorzy molekularni i ruchy morfogenetyczne są ewolucyjnie zachowane. Jedyne specyficzne tkankowo podejścia transkryptomiczne przeprowadzone do tej pory w tym modelu zostały przeprowadzone przy użyciu sortowania komórkowego lub jądrowego i były w stanie zbadać tylko transkryptom w stanie ustalonym 27-31, co stworzyło zapotrzebowanie na metody dedykowane profilowaniu translatomu specyficznemu dla tkanki/komórki w zarodku muchy. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony zarodkom Drosophila. Dzięki tej metodzie udało się wyizolować mRNA zaangażowane w translację w bardzo ograniczonej populacji komórek liczącej około 100 komórek mięśniowych na zarodek z zachowaniem wysokiej jakości i swoistości. Binarny system GAL4 / UAS jest używany do sterowania ekspresją RpL10A znakowanego GFP w subpopulacji mięśni bez żadnej toksyczności, bez widocznych fenotypów lub opóźnienia rozwojowego, jak wykazano wcześniej25. Zarodki Drosophila posiadają 30 mięśni na półsegment, które dadzą początek muskulaturze larwy. Wykorzystując region regulatorowy odkryty w pobliżu genu tożsamości garbu, celem jest 6 z 30 mięśni wielojądrowych. W tym teście rybosomy są unieruchamiane na mRNA za pomocą inhibitora wydłużania translacji cykloheksymidu. Ekstrakty cytozolowe są następnie używane do oczyszczania powinowactwa za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem GFP. Jakość oczyszczonego RNA zweryfikowano za pomocą bioanalizatora. Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) został wykorzystany do określenia swoistości i czułości izolacji mRNA i wykazał, że nasz zoptymalizowany protokół jest bardzo skuteczny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie linii muchowej

  1. Wygeneruj dwie różne konstrukcje. W pierwszym konstrukcie cDNA RpL10A (podjednostka białka rybosomalnego L10a) jest klonowane za GFP do plazmidu pUASP-PL-GFP-Nter (zmodyfikowana wersja z32). Zastosowanie promotora linii zarodkowej pozwala na bardziej wielowartościowe wykorzystanie linii transgenicznej.
    UWAGA: Uzyskaj drugi konstrukt poprzez sklonowanie sekwencji regulatorowej napędzającej specyficzną tkankowo ekspresję genu garbu przed GAL4 (TF) przy użyciu plazmidu pPTGAL4.
  2. Wstrzyknąć plazmidy oddzielnie do muszek w1118 i wprowadzić konstrukty do genomu muchy przez insercję elementu P (zgodnie ze standardową procedurą)33.
  3. Wybierz transformanty, aby odzyskać linie muchowe z konstruktami na dwóch różnych chromosomach. Ostateczna linia TRAP jest tworzona przez połączenie tych dwóch linii (krzyżówek genetycznych) w celu uzyskania jednej podwójnej stabilnej linii transgenicznej. F0: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; MKRS/TM6B x w-; Cyo/SCU; Garbaty Gal4/TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; Garbaty Gal4/TM6B. Znacznie wzmocnij tę linię i zbierz pożądane zarodki w stadium.

2. Pobieranie zarodków

  1. Przygotuj 8 dużych cylindrycznych klatek populacyjnych zawierających około 40 g młodych much w klatce (około 180 000 much w klatce).
  2. Kontynuuj tak zwane pre-lays, które pozwalają muchom usunąć rozwijające się zarodki z ich jajowodów. W tym celu połóż muchy na 1 godzinę na dwóch szalkach Petriego o średnicy 11 cm, zawierających mieszaninę zestalonego agaru i soku winogronowego i przykryj 1/3 powierzchni świeżo przygotowaną pastą drożdżową. Po 3 wymianach talerzy z sokiem winogronowym zbierz prawdziwe zarodki na podobnych świeżo przygotowanych talerzach.
    UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od badanego okna rozwojowego.
  3. Wyjąć płytki z klatek i pozostawić je w tej samej temperaturze przez czas potrzebny do uzyskania prawidłowego stadium rozwojowego (np. 3 godziny składania jaj + 10 godzin dodatkowej inkubacji dają zarodki w stadium 10-13 godzin po złożeniu jaj (AEL)). Zawiesić zawartość płytki (zarodki, pasta drożdżowa, martwe muchy) w 50 ml wody za pomocą pędzla.
  4. Przejść przez szereg sit (700 μm, 355 μm, 112 μm) w celu oddzielenia zarodków od martwych much i pozostałych części ciała i zebrać zarodki zatrzymane na sicie o mniejszej średnicy, a następnie krótko umyć w wodzie dejonizowanej. Nie używaj więcej niż 18 płytek na kolekcję, ponieważ może to zatkać sita.
  5. Dechorionate zarodki w 4,5% wybielaczu w dejonizowanej wodzie przez 2 minuty i dokładnie płukać wodą dejonizowaną przez 30-60 sekund. Inkubować zarodki w PBS 0,01% Tween 20, 100 μg/ml cykloheksymidu, przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
  6. Wysuszyć zarodki na celulozowych arkuszach chłonnych i przenieść je do probówek do mikrowirówek. Zważyć probówki i błyskawicznie zamrozić zarodki przez zanurzenie w ciekłym azocie. Na tym etapie wysuszone zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem GFP

  1. Dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne Protein G w oryginalnej butelce przez delikatne mieszanie.
  2. Przenieś 90 μl kulek do probówki wolnej od RNaz i zbierz je na magnesie (30–60 sekund). Do przeprowadzenia immunoprecypitacji (IP) z użyciem 1 ml lizatu zawierającego 60-80 mg/ml białek niezbędne jest 90 μl kulek. Przestrzegaj proporcji, aby zapobiec nasyceniu ściegów. Użyj kilku probówek w zależności od ilości białka.
  3. Umyj koraliki za pomocą 1× PBS 0,01% Tween 20 (500 μl) i zbierz koraliki na magnesie, aby usunąć supernatant. Dodać 30 μg przeciwciała GFP w 350 μl PBS 0,01% Tween 20 do kulek i inkubować z powolnym mieszaniem koniec nad końcem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zebrać kulki na magnesie (30-60 sek), wyrzucić supernatant i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor proteazy 1×, inhibitor RNazy 100 U).
  5. Zbierz kulki na magnesie i dodaj 500 μl buforu blokującego (BSA 0,1 μg/μl, tRNA drożdży 0,1 μg/μl, glikogen 0,1 μg/μl w buforze do ekstrakcji polisomów).
  6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć ten krok raz ze świeżym buforem blokującym.
  7. Zebrać kulki na magnesie i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów, a następnie zebrać kulki i natychmiast przejść do etapu oczyszczania immunologicznego (sekcja 6).

4. Przygotowanie lizatu

  1. Przed rozpoczęciem ustaw program na wielokierunkowej szlifierce do kulek szybkoobrotowych: 2×10 s przy 5,000 obr./min, 15 sec pauza. Przenieść wysuszone zarodki (1,5 g) do 15 ml probówek wstępnie schłodzonych na lodzie zawierających bufor do ekstrakcji polisomów i natychmiast poddać homogenizacji. Homogenizować 1,5 g zarodków w 4 ml buforu do ekstrakcji polisomów.
  2. Rozłóż homogenizowane zarodki w dwóch wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 2 ml i zmiel zarodki, uruchamiając program homogenizatora. Przenieść lizat do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek mikrowirówek na lodzie i przygotować postjądrowy supernatant przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 2 000 g.
  3. Przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówki na lodzie, dodać 1/100 objętości próbki 10% Nonidetu P-40 do supernatantu (stężenie końcowe = 0,1%) i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.
  4. Odwirować pulsacyjnie próbkę w minifuge, aby zebrać ciecz na dnie probówki, dodać 1/9 objętości próbki 300 mM 1,2-Diheptanoilo-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (stężenie końcowe = 30 mM), delikatnie wymieszać przez odwrócenie probówki i inkubować mieszaninę na lodzie przez 5 minut (mieszać przez kilkakrotne odwrócenie podczas inkubacji).
  5. Przygotować supernatant pomitochondrialny przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 20 000 g. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda: stężenie w lizacie powinno wynosić 60-80 mg/ml. Przenieść supernatant do nowej, świeżo schłodzonej probówki mikrowirówki i natychmiast przejść do etapu wstępnej absorpcji (sekcja 5).

5. Wstępna absorpcja

  1. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne mieszanie i przenieść 30 μl kulek do probówki mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej (30 μl kulek/1 ml lizatu embrionalnego).
  2. Zebrać kulki na magnesie, odpipetować supernatant i ponownie zawiesić kulki w buforze do ekstrakcji polisomów (500 μl). Zebrać koraliki na magnesie, dodać lizat embrionalny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze.
    1. Usuń kulki i trzymaj supernatant na lodzie do etapu oczyszczania immunologicznego. Przed immunooczyszczaniem należy zachować 100 μl supernatantu (wejście), aby porównać globalną próbkę RNA z próbką RNA pobraną po oczyszczeniu immunologicznym, na przykład metodą RT-qPCR.

6. Oczyszczanie immunologiczne

  1. Dodać 1 ml (co odpowiada 60-80 mg/ml białka) wstępnie wchłoniętego lizatu do probówki wolnej od RNaz zawierającej 90 μl zablokowanych kulek sprzężonych z przeciwciałem GFP. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, delikatnie mieszając od końca do końca w rotatorze probówkowym. Alternatywnie przeprowadzić inkubację O/N w temperaturze 4 °C.
  2. Po inkubacji zbierz koraliki na magnesie. Za pomocą minifuge odwiruj kulki, a następnie zawieś je ponownie w 500 μl buforu do płukania (Hepes 10mM, KCl 350mM, MgCl2 5mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor RNazy 100 U) i zbierz je na magnesie. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
  3. Wymień koraliki na nową, wstępnie schłodzoną probówkę wolną od RNaz i umyj dwukrotnie. Zbierz kulki na magnesie i przystąp do ekstrakcji RNA, dodając 1 ml TRiZol bezpośrednio do kulek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Oczyszczanie RNA i ocena jakości

  1. Użyj zestawu RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu eluuj RNA wodą wolną od (x) μl RNazy. Ogrzewać przez 2 minuty w temperaturze 60 °C i przechowywać zamrożone próbki w temperaturze -80 °C. Sprawdź jakość RNA za pomocą bioanalizatora (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Aby przetestować swoistość RNA TRAPed, należy przeprowadzić odwrotną transkrypcję na 3 ng oczyszczonego RNA (wejście i IP) zgodnie z instrukcjami producenta (indeks górny III). Użyj cDNA uzyskanego do qPCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla genu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodkowy układ mięśni somatycznych Drosophila składa się z 30 mięśni na hemisegment, a każdy mięsień posiada specyficzny zestaw właściwości: kod genów tożsamości, pozycję, liczbę zdarzeń fuzji, miejsca przyczepu oraz unerwienie. Identyfikacja przetłumaczonego mRNA w określonym podzbiorze mięśni dostarczy informacji o białkach niezbędnych do uformowania tych specyficznych cech mięśniowych. Z zastosowaniem metody opartej na TRAP oczyszczono RNA z subpopulacji mięśni wykazujących ekspresję genu tożsamości slouch (Ryc. 1A-B). Główną kwestią w tym podejściu jest jakość i specyficzność wyizolowanego RNA. Zoptymalizowany protokół opisany w niniejszej pracy umożliwił systematyczne odzyskiwanie wysokiej jakości RNA, ocenianego za pomocą analizy bioanalizatorem. Uzyskany profil nie wykazuje degradacji RNA (Ryc. 1C).

W innych badaniach opartych na metodzie TRAP pojawiały się wątpliwości co do specyficzności uzyskanych danych. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy tę metodę w celu ograniczenia tła wynikającego z niespecyficznego wiązania RNA z kuleczkami lub probówkami oraz poprzez optymalizację buforu do płukania. Aby ocenić poziom tła oraz wydajność izolacji komórek wykazujących ekspresję genu slouch, przeprowadziliśmy analizy RT-qPCR na 3 powtórzeniach tego samego stadium embrionalnego. Krotność wzbogacenia 4 różnych genów (mef2, slouch, prospero, soxNeuro) obliczono w stosunku do wartości wejściowych i znormalizowano względem RpL32 gen (Rysunek 1D). Wyniki te wykazały 2,3-krotne wzbogacenie genów panmięśniowych mef2 i5,6-krotne wzbogacenie garbić się genu. W przeciwieństwie do tego, dwa geny ekspresjonowane w układzie nerwowym były uszczuplone w porównaniu do materiału wejściowego. Bardzo podobne wartości krotności zmiany (fold change) zaobserwowano w trzech powtórzeniach biologicznych, co świadczy o powtarzalności protokołu. Przy zastosowaniu drivera Slouch-Gal4 i rozpoczęciu od 1,5 g, uzyskano około 1,5x10^6 embrionów zawierających 100 komórek GFP na embrion (łącznie 150×10^6 komórek pozytywnych).

Po przeprowadzeniu eksperymentu TRAP wydajność wynosi około 25–45 ng specyficznego RNA, w zależności od analizowanego etapu. Materiał ten jest wystarczający do przeprowadzenia analizy mikromacierzy lub RNA-seq z wykorzystaniem protokołu amplifikacji w celu budowy biblioteki RNA-seq. Efektywność będzie w dużej mierze zależeć od siły promotora użytego do ekspresji RpL10A-EGFP.

figure-results-1
Rysunek 1. Ocena jakości i swoistości RNA izolowanego metodą TRAP z embrionów Slouch-GAL4>UASRpL10A-EGFP.

(A-B) Obrazy konfokalne zarodka w stadium 16. pokazujące ekspresję RpL10A-EGFP specyficznie w sześciu komórkach mięśniowych Slouch na hemisegment (A). Na obrazie scalonym (B) widoczna jest ko-lokalizacja RpL10A-EGFP z ogólnym markerem mięśni Beta3tubulin. (C) Kontrola jakości RNA wyizolowanego metodą TRAP analizowana za pomocą bioanalizatora, wykazująca pełną integralność rRNA 18S i 28S. (D) Analiza RT-qPCR wykazująca wysoką specyficzność eksperymentów z mRNA izolowanym metodą TRAP na 3 powtórzeniach biologicznych zarodków w stadium 16. Krotność zmiany (fold change) obliczono w stosunku do próbki wejściowej (input) i znormalizowano względem genu RpL32. Transkrypty Mef2, obecne we wszystkich liniach mięśniowych, są wzbogacone 2,3-krotnie w porównaniu do próbki wejściowej, natomiast bardziej ograniczone transkrypty slouch są wzbogacone 5,6-krotnie. Komórki neuronalne wykazujące ekspresję genów prospero i soxN są odpowiednio uszczuplone 2,2-krotnie i 5,5-krotnie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n=3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano zmodyfikowany protokół oczyszczania powinowactwa rybosomów (nazwany "TRAP-rc") przeznaczony do badania rzadkich populacji komórek w zarodkach Drosophila . Podano informacje na temat kluczowych etapów pomyślnej izolacji specyficznego RNA z wydajnością odpowiednią do analizy mikromacierz lub sekwencji RNA , tj. 1) wymaganej ilości materiału biologicznego i zoptymalizowanej procedury lizy zarodków i ekstrakcji polisomów; 2) Proporcje kulek/przeciwciał do lizatu dla optymalnej immunoprecypitacji; 3) kroki pozwalające na redukcję tła, w tym skład bufora myjącego, tak aby prowadzić eksperymenty TRAP-rc z wysoką swoistością i czułością.

Protokół ten zapewnia powtarzalne dane, dzięki czemu można go łatwo zastosować do innych typów komórek. Technika ta umożliwia analizę zróżnicowanej ekspresji genów na poziomie aktywnie translującego mRNA, a tym samym toruje drogę do zrozumienia ekspresji białek w określonym typie komórki w określonym oknie czasowym. Należy jednak pamiętać, że obfitość białka będzie zależeć od szybkości procesów translacji i degradacji. Głównym ograniczeniem metody TRAP jest jej niemożność dokładnego pomiaru zawartości białka ani wykrycia modyfikacji potranslacyjnej. Poprawa kwantyfikacji poprzez pomiar gęstości rybosomów wzdłuż ciała mRNA, a tym samym w sposób specyficzny dla typu komórki, może sprawić, że TRAP w połączeniu ze śladami rybosomów stanie się bardzo potężnym narzędziem. W niedawnym artykule34 ta kombinacja została przeprowadzona na ludzkich embrionalnych komórkach nerki 293. Autorzy przeprowadzili ślad nukleazy, a następnie oczyścili powinowactwo indukowalnej biotynylowanej formy RpL10A za pomocą kulek streptawidyny. Jest to dowód na słuszność zasady, że możliwe jest wykonanie śladu rybosomu w całym organizmie przy jednoczesnym ukierunkowaniu na określony typ komórki, przy czym ograniczeniem jest ilość materiału biologicznego wymaganego do tego celu.

Przeprowadzanie eksperymentów TRAP równolegle z globalnymi analizami transkryptomicznymi umożliwi śledzenie proporcji między nowo transkrybowanym a aktywnie translującym RNA. Będzie to bardzo pouczające na temat potencjalnych mechanizmów potranskrypcyjnych zachodzących w określonych kontekstach rozwojowych lub określonych populacjach komórek – na przykład przez mikroRNA.

Podsumowując, TRAP jest wysoce wydajną, specyficzną i czułą metodą identyfikacji RNA związanych z rybosomami ulegającymi aktywnej translacji w sposób specyficzny dla komórki. Metoda ta może być stosowana w wielu różnych organizmach i typach tkanek. Opisany tutaj nowy protokół TRAP-rc został zoptymalizowany pod kątem rzadkich populacji komórek (mniej niż 1% całkowitej liczby komórek) oraz ilości materiału końcowego wystarczającej do kolejnych analiz na poziomie całego genomu.

Możliwym ograniczeniem tej metody jest wymóg silnego czynnika napędzającego do wytwarzania znakowanych rybosomów w ilości wystarczającej do konkurowania z endogennymi rybosomami nieoznakowanymi w docelowym typie komórki. W niedawnym badaniu25 autorzy oszacowali na 10-30% stosunek rybosomów znakowanych do nieoznakowanych.

Aby rozwiązać ten problem, zwiększenie liczby kopii UAS-RpL10A-EGFP powinno znacznie poprawić tę równowagę. Alternatywnie, dodanie do opisanego tła genetycznego transgenu UAS-GAL4 wzmocni produkcję białka GAL4 i pośrednio zwiększy ekspresję RpL10A-EGFP. Powinno to sprzyjać lepszemu zajęciu znakowanych rybosomów na mRNA.

Należy zauważyć, że to już skuteczne podejście może stać się jeszcze bardziej skuteczne poprzez dostosowanie uzupełniających się metod w celu wprowadzenia bardziej ilościowego aspektu lub odkrycia i rozwikłania mechanizmów molekularnych, które są niezbędne do kontroli ekspresji genów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Nicolasowi Allegre, Maud Peyny i Jean-Philippe'owi Da Ponte za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), grant startowy INSERM, grant ANR ID-CELL-SPE, Equipe FRM oraz grant AFM 15845.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HEPESSigma H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocholina Avanti Polar Lipids850306P
Glikogentermo naukowy R0561
Oczyszczony BSA 100X BiolabsB9001
TRNA drożdży SigmaR5636
Super RNase w Przeciwciało AmbionAM2694
Klon GFP N86/38UC DAVIS / NIH Neuromab Faculty Przeciwciała Włączone75-132 
Nonidet P40 Roche11754595001
Precellys 24 Homogenizacja Lysis Technologia
Woda wolna od nukleaz Nalgene
Dynabeads BiałkoGInvitrogen10004D
Chlorek potasu (KCl)Applied Biosystem 
Chlorek magnezu (MgCl2) Biosystem stosowany 
Celuloza waddyna niebielona VWR115-2597 
Sita 112, 355, 710 um Retsch
TRiZol Invitrogen15596-018
MagRack 6GE HealthCare 
Końcówki filtrów o niskim poziomie wiązania ClearLine
Tubka bez rnazy 1,5 ml ClearLine390689DD
Animacja 20 Bioodczynnik Fischera BP337-500
Cykloheksymid Sigma C1985
Tabletki z inhibitorem proteazy, Mini-Complete, wolne od EDTA Roche11836170001
BertinAM96406AM9530628948964

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014(2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605(2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965(2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419(2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276(2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok TRAP rckompleks RNA rybosomalnegoprzygotowanie polisom wpodjednostka rybosomalna z oznakowaniem GFPkulki do oczyszczania powinowactwemekstrakcja i oczyszczanie RNAkontrola jako ci Bioanalyzeremanaliza RT qPCRspecyficzna dla typu kom rek

Powiązane artykuły