Artykuł metodologiczny

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

DOI:

10.3791/52986

⸱

31 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 2Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, School of Pharmacy, University of Nottingham, 3Division of Immunology and Allergy, School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 4Division of Respiratory Medicine, School of Clinical Sciences, University of Nottingham, 5NIHR Respiratory Biomedical Research Unit, University of Leicester, 6School of Sport, Exercise, and Health Sciences, Loughborough University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroprzędzenie to wysoce elastyczna metoda wytwarzania porowatych rusztowań włóknistych 3D, które mogą być wykorzystane w hodowli komórkowej in vitro. Zmiany parametrów wewnętrznych w procesie pozwalają na wysoki stopień kontroli nad cechami rusztowania, w tym średnicą włókien, wyrównaniem i porowatością. Opracowując rusztowania o rozmiarach i topografii podobnych do matryc zewnątrzkomórkowych specyficznych dla narządów lub tkanek (ECM), można stworzyć mikrośrodowiska reprezentatywne dla tych, na które narażone są komórki in situ.

Ściana oskrzelików dróg oddechowych, składająca się z trzech głównych mikrośrodowisk, została wybrana jako tkanka modelowa. Korzystając z bezkomórkowego ECM dróg oddechowych jako przewodnika, elektroprzędziliśmy niedegradowalny polimer, politereftalan etylenu (PET), za pomocą trzech różnych protokołów, aby wytworzyć trzy indywidualne elektroprzędzone rusztowania zoptymalizowane pod kątem hodowli komórek nabłonka, fibroblastów lub mięśni gładkich. Korzystając z dostępnego na rynku systemu bioreaktorów, stabilnie przeprowadziliśmy wspólną hodowlę trzech typów komórek, aby zapewnić model ściany dróg oddechowych in vitro przez dłuższy czas.

Ten model podkreśla potencjał takich metod do wykorzystania w badaniach diagnostycznych in vitro badających ważne mechanizmy międzykomórkowe lub oceniających nowe cele farmaceutyczne, dostarczając odpowiednią platformę umożliwiającą hodowlę w pełni zróżnicowanych dorosłych komórek w 3D, specyficznych dla tkanek środowiskach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedzina medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej szybko się rozwija, z przełomowymi odkryciami w regeneracji tchawicy i nerek, dwoma godnymi uwagi osiągnięciami ostatnich lat. Biomateriały opracowane w inżynierii tkankowej stają się coraz bardziej dostępne, z możliwością przeniesienia takich protokołów do mniej specjalistycznych laboratoriów. Jedną z dziedzin, która może przynieść korzyści dzięki rosnącemu wykorzystaniu biomateriałów, jest diagnostyka in vitro.

Badania in vitro są ważną platformą do badania wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w obrębie pojedynczych typów komórek i pomogły nakreślić mechanizmy leżące u podstaw wielu patofizjologii chorób. Badania te na ogół opierają się na hodowli pojedynczego typu komórki jako monowarstwy na plastiku do hodowli tkankowej (TCP); dwuwymiarowa (2D) sztywna powierzchnia znacznie mniej elastyczna i porowata niż trójwymiarowe (3D) środowisko, na które narażone są komórki w tkance lub narządzie. Modele zwierzęce są tradycyjnie wykorzystywane do potwierdzania, że efekty stwierdzone in vitro przekładają się również na całą tkankę i mogą być również wykorzystywane jako platformy przedkliniczne do badania chorób ludzkich. Jednak różnice międzygatunkowe podważają tę zależność od modeli zwierzęcych w naszym rozumieniu chorób ludzkich. Na przykład, wiele informacji na temat choroby płuc astmy opiera się na modelu mysim, pomimo nieodłącznych różnic między stanem ludzkim a tym modelem, w tym niewielkich dowodów na naciekanie komórek tucznych w pęczku mięśni gładkich dróg oddechowych lub zdolności do spontanicznego rozwoju choroby w modelu zwierzęcym3,4. Istnieją również względy etyczne dotyczące korzystania z modeli zwierzęcych, przy czym w Wielkiej Brytanii i innych krajach zachęca się do stosowania standardu "3R" "wymiany, udoskonalenia i redukcji" w eksperymentach na zwierzętach.

Atrakcyjną alternatywą byłaby rekapitulacja tkanek ludzkich in vitro, tworzenie struktur do badania kooperatywnego charakteru między typami komórek dorosłych ludzi w jednej jednostce. Komórki istnieją w wielokomórkowych strukturach 3D w tkance, z których każda znajduje się w unikalnym mikrośrodowisku. Hodowla komórek na TCP pozwala tylko na hodowlę monowarstw komórkowych, które nie są w stanie replikować tego środowiska ani zapewnić zdolności do hodowli wielokomórkowej. Postęp w dziedzinie biomateriałów daje możliwość opracowania zarówno naturalnych, jak i syntetycznych platform 3D do hodowli komórek. Zdecellularyzacja ECM może być stosowana do hodowli komórek 3D po recellularizacji z innymi typami komórek, w tym komórkami macierzystymi1, jednak takie protokoły mogą być złożone i czasochłonne, a dostępność tkanek jest ograniczona i w dużej mierze nie pochodzi od człowieka. Inne protokoły pozwalają na większą kontrolę nad tworzonymi środowiskami komórkowymi, takimi jak nanoimprinting, osadzanie ECM, technologie arkuszy komórkowych lub elektroprzędzenie. Elektroprzędzenie tworzy włókninowe porowate maty 3D z włókien o średnicach od nanometrów do mikrometrów, odwzorowując naturalne wymiary ECM. Rusztowania elektroprzędzone są coraz częściej stosowane jako platformy do hodowli komórek 3D. Manipulowanie parametrami elektroprzędzenia pozwala na skomplikowaną kontrolę nad cechami rusztowania, takimi jak wielkość porów, średnica włókien, topografia i wyrównanie oraz skład chemiczny powierzchni. Wykazano, że zmiany tych parametrów bezpośrednio wpływają na adhezję i wzrost komórek, gdy komórki były hodowane w izolacji.

Te zalety zostały wykorzystane w obecnym badaniu, aby umożliwić hodowlę wielu typów komórek jako pojedynczego konstruktu tkanki 3D, wykorzystując oskrzelik dróg oddechowych jako modelową strukturę tkankową 3D. Ściana oskrzelików składa się z trzech głównych obszarów (ryc. 1). Błona śluzowa to miejsce, w którym komórki nabłonka dróg oddechowych znajdują się na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), stanowiąc ważną barierę dla środowiska zewnętrznego. Znajdują się one na siatkowatej błonie podstawnej (RBM), ściśle zwartym ECM składającym się głównie z kolagenu IV, perlekanów i laminin. Warstwa podśluzówkowa znajduje się bezpośrednio pod błoną śluzową, bardziej porowatym regionem składającym się z wielu typów komórek, w tym fibroblastów, miofibroblastów i naciekających leukocytów w warunkach chorobowych. Wreszcie wiązki mięśni gładkich owijają się wokół dróg oddechowych w spiralny sposób i składają się z wyrównanych arkuszy mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM). Jest to względny stan kurczliwości mięśni gładkich, który kontroluje napięcie dróg oddechowych. Zastosowanie rusztowań elektroprzędzonych w układzie oddechowym do niedawna ograniczało się do celów regeneracyjnych; z pomyślnym przeszczepieniem elektroprzędzonej tchawicy. Chociaż takie zabiegi są skuteczne, ich liczba jest ograniczona i koncentrują się na tchawicy ze względu na stosunkowo prostą naturę funkcji tkanki. Istnieją ograniczone przykłady modeli dróg oddechowych stosowanych w diagnostyce in vitro, które koncentrują się głównie na pomiarach skurczu mięśni gładkich. Nietoksyczny i niedegradowalny polimer politereftalan etylenu (PET) był wcześniej przędzony elektrolitycznie i został zastosowany w niniejszym badaniu, aby zapewnić, że wyprodukowane rusztowania mogą być przechowywane przez długi czas bez degradacji (co pozwala na ich użycie "z półki"), a także nadają się do stabilnej hodowli komórkowej przez dłuższy czas. Wcześniejsze badania naszej grupy wykazały, że wykorzystując trzy warianty podstawowego protokołu elektroprzędzenia, można wyprodukować trzy indywidualne rusztowania elektroprzędzone PET, aby zapewnić optymalną topografię do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych, fibroblastów i mięśni gładkich w izolacji21,22 oraz kokultury komórek nabłonka dróg oddechowych i fibroblastów22. Stwierdzono, że średnica włókien znacznie wpływa na funkcjonalność nabłonka22, a wyrównanie włókien pozwoliło na wygenerowanie wyrównanych arkuszy mięśni gładkich21. Badania te prowadzono niezależnie od siebie w warunkach statycznych. W niniejszym badaniu te różne rusztowania, zawierające w pełni zróżnicowane dorosłe komórki ludzkie, były hodowane przez tydzień w ALI w dostępnym na rynku bioreaktorze jako przekrój 3D ściany drogi oddechowej, zapewniając fizjologicznie istotny model in vitro do badania odpowiedzi międzykomórkowych dróg oddechowych. Chociaż protokół ten wykorzystuje oskrzeliki dróg oddechowych jako system modelowy, może on zostać zaadaptowany jako platforma do kokultury 3D jednostek błony śluzowej z innych narządów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne komórki ASM od osób bez astmy zostały wyizolowane z biopsji oskrzeli w Glenfield Hospital (Leicester, Wielka Brytania), jak opisano wcześniej. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną w Leicestershire, a pacjenci wyrazili pisemną, świadomą zgodę.

1. Rusztowania PET do elektroprzędzenia (Rysunek 2)

  1. Przygotować roztwór (10 ml) PET z butelki do napojów w roztworze 1:1 dichlorometanu (DCMro) – kwasu trifluorooctowego (TFA). Stężenia PET wynoszące 8%, 30% i 10% wagowo-objętościowe (wt/vol) są wymagane odpowiednio dla nanowłókien, mikrowłókien i wyrównanych rusztowań, a następnie miesza się roztwór O/N w temperaturze pokojowej, aby PET się rozpuścił.
  2. Przenieść roztwór PET do strzykawki i przymocować igłę 23-G (dla nanowłókna) lub 18-G (dla mikrofibry i wyrównanej) do strzykawki i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej z napędem. Upewnij się, że czubek igły jest obrócony do dołu.
  3. Umieść trzpień w odległości 15 cm od końcówki igły, upewniając się, że igła jest skierowana na środek bębna.
  4. Przymocuj zasilanie elektryczne do końcówki igły za pomocą zacisków krokodylkowych i uziemij trzpień (przez gniazdo bananowe) do ziemi. Włącz zasilanie trzpienia i ustaw prędkość na 60 obr./min (co odpowiada około 13,2 m·min-1) dla rusztowań z nanowłókien i mikrofibry. Ustaw prędkość na 2 000 obr./min (co odpowiada około 440 m·min-1) dla wyrównanych rusztowań.
  5. Ustawić pompę strzykawkową na natężenie przepływu 0,5 ml·hr-1 dla rusztowań z nanowłókien losowych i wyrównanych lub 2,0 ml·hr-1 dla rusztowań z mikrofibry. Pozwól pompie pracować do momentu, gdy roztwór zostanie wyciśnięty z końcówki igły w celu usunięcia powietrza z igły. Następnie zatrzymaj pompę.
  6. Na pompie strzykawkowej ustawić całkowitą objętość roztworu do wydalenia na 2 ml i uruchomić pompę.
  7. Ustaw napięcie zasilania na 14 kV i włącz zasilanie.
  8. Elektrowirować do momentu, aż 2 ml roztworu zostanie elektroprzędzone (4 godziny w przypadku rusztowań z nanowłókien i wyrównanych, 1 godzina w przypadku rusztowań z mikrofibry).
  9. Przetnij rusztowanie ostrzem wzdłuż szerokości trzpienia. W ten sposób powstaje arkusz rusztowania 2D o wielkości powierzchni trzpienia (w tym przypadku prostokątny arkusz o wymiarach 22 cm x 11 cm), który można ostrożnie odkleić od trzpienia). Przechowuj rusztowanie w folii aluminiowej, aby zmniejszyć ładunek elektrostatyczny).
    Uwaga: Rusztowania dwufazowe są wytwarzane przez sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania z nanowłókien bezpośrednio na rusztowaniu z mikrofibry.

2. Sterylizacja rusztowań przed użyciem w hodowli komórkowej

  1. Z arkusza rusztowania wybij krążki dwufazowych lub wyrównanych rusztowań za pomocą pisaka do biopsji o średnicy 0,8 mm i przyklej do uszczelki za pomocą nietoksycznego kleju akwariowego.
  2. Sterylizować rusztowania za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut z każdej strony rusztowań przed namoczeniem w roztworze antybiotyku/antybiotyku / antybiotyku o stężeniu 20% obj. (2x105 jednostek ml-1 penicyliny G, 2 000 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 500 μg ml-1 amfoterycyny B) O/N w temperaturze 4 °C.
  3. Umyć rusztowania PBS 3 razy, a następnie przechowywać rusztowania w płytkach studzienkowych TCP w PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Składniki pożywek do hodowli komórkowych

  1. Hodowla komórek nabłonka CALU3 w pożywce DMEM-F12 uzupełnionej 10% obj. / obj. płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 nM roztworu L-glutaminy, 1% obj. / roztworu antybiotyku / roztworu przeciwgrzybiczego (10 000 jednostek ml-1 penicyliny G, 100 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 25 μg ml-1 amfoterycyny B).
  2. Hodowla fibroblastów MRC5 i komórek ASM w pożywkach DMEM uzupełnionych 10% obj./obj. płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 nM roztworem L-glutaminy, 1% obj. antybiotykiem/roztworem przeciwgrzybiczym (10 000 jednostek ml-1 penicyliny G, 100 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 25 μg ml-1 amfoterycyny B).
  3. Hodowla komórek nabłonka-fibroblast-ASM w mieszaninie pożywek 70:30 DMEM-F12:DMEM.

4. Wysiewanie komórek fibroblastów i nabłonka na dwufazowe rusztowanie

  1. Na płytce do hodowli tkankowej namoczyć rusztowania w pożywce uzupełnionej DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed wysiewem komórek.
  2. Usuń pożywkę uzupełnioną DMEM, umieść fazę mikrofibry rusztowania wierzchołkowo i wysiewaj 1,5 x104 komórki fibroblastów MRC5 w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM. Mieszać płytkę na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny, przed pozostawieniem w inkubatorze w temperaturze 37 °C 5% CO2 w powietrzu O/N.
  3. Odwrócić rusztowanie tak, aby faza nanowłókien rusztowania była skierowana wierzchołkowo, wysiać 3,0 x104 komórki nabłonkowe CALU3 w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM-F12 na fazę nanowłókien rusztowania i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu przed zanurzeniem rusztowania w 70:30 DMEM-F12: Pożywki O / N uzupełnione DMEM przed przeniesieniem do bioreaktora.

5. Wysiewanie komórek ASM na wyrównane rusztowanie

  1. Na płytce do hodowli tkankowej namoczyć rusztowania w pożywce z dodatkiem DMEM i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przed wysiewem 2,5 x104 komórek w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM i inkubować przez 2 godziny (37 °C, 5% CO2 w powietrzu). Zanurz rusztowanie w pożywce uzupełnionej DMEM, wróć do inkubatora i opuść O/N przed założeniem trójkulturowości w bioreaktorze.

6. Konfiguracja Tri-Culture za pomocą Systemu Bioreaktora (Rysunek 7)

  1. Umieść dwufazową uszczelkę rusztowania w rowku w jednej komorze z fazą nabłonkową skierowaną do góry do komory.
  2. Umieść wyrównane rusztowanie pod rusztowaniem dwufazowym (tak, aby przylegało do fazy mikrofibry rusztowania dwufazowego) i zablokuj ze sobą dwie komory bioreaktora.
  3. Zmontuj dwa obwody przepływu perfuzyjnego połączone z dwoma zbiornikami pożywki (pożywka uzupełniona DMEM-F12 w zbiorniku wierzchołkowym, pożywka uzupełniona DMEM-F12/DMEM w zbiorniku podstawowym) i pompuj media wokół dwóch obwodów z prędkością około 0,1 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej (40 ml pożywki jest zawracane przez każdy obwód). Wszystkie części systemu należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu.
  4. Po tygodniu usuń pożywkę z komory wierzchołkowej i hoduj komórki nabłonkowe w ALI przez kolejny tydzień przed analizą.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego zdecelularizowanej tkanki dróg oddechowych lub obrazy immunohistologiczne z biopsji dróg oddechowych zidentyfikowały pożądane cechy ECM dróg oddechowych, które chcieliśmy wprowadzić do topografii rusztowań elektroprzędzonych: Natywna matryca RBM składa się z włókien o średnicy około 153 nm ± 30,6 nm (średnia ± SD n=50 pomiarów) (Rysunek 3A i 5A), podczas gdy matryca otaczająca RBM była z natury bardziej porowata (Rysunek 3C). Skrawki immunohistologiczne przez pęczki mięśni gładkich wykazują ASM obecne jako wyrównane arkusze komórek21 (ryc. 3E). Informacje te posłużyły do określenia charakterystyk wprowadzonych do rusztowań elektroprzędzonych. Obrotowy trzpień był w stanie stabilnie obracać się przy dużych prędkościach (>2 000 obr./min/ 440 m·min-1) w celu wytworzenia rusztowań z wyrównanymi włóknami. Powolne obracanie trzpienia (60 obr./min 13,2 m·min-1) nie wpływało na orientację włókien, ale wytwarzało rusztowania o bardziej jednolitej grubości niż podczas elektroprzędzenia na płycie statycznej. Poprzez zmianę parametrów elektroprzędzenia (stężenie PET i szybkość przepływu roztworu) możliwe było wytworzenie włókien rusztowań o średnicach kilku mikrometrów lub setek nanometrów (parametry elektroprzędzenia podano w tabeli 1).

Elektroprzędzone włókna o średnicach równoważnych naturalnym włóknom RBM (150 nm) zostały wyprodukowane przy użyciu 6% roztworu PET, jednak przy tak niskich stężeniach PET wystąpiło perlenia włókien (Rysunek 4A). Zostało to wyeliminowane poprzez zwiększenie stężenia roztworu PET do 8%, co pozwoliło na uzyskanie jednolitych nanowłókien o średniej średnicy 255 nm ± 2,4 nm (średnia ± SEM) i średniej wielkości porów 1,43 μm ± 0,02 μm (ryc. 4B, 5A&B). Aby elektroprzędzić nanowłókna, konieczne było zmniejszenie rozmiaru igły z 18 G do 23 G, co pozwoliło na wolniejsze natężenie przepływu przy jednoczesnym utrzymaniu większej prędkości przepływu i zmniejszeniu blokowania igły, co było powtarzającym się problemem w przypadku większej igły. Podczas elektroprzędzenia mikrowłókien zwiększenie zawartości roztworu PET do >30% PET prowadzi do braku jednorodności średnicy włókien (rysunek 4F), a także do wielokrotnych zatorów na końcówce igły spowodowanych wysoką lepkością roztworu. Jednolite maty z mikrofibry o średniej średnicy włókna 2,50 μm ± 0,02 μm (średnia ± SEM) i średniej wielkości porów 10,45 μm ± 0,13 μm zostały wyprodukowane podczas elektroprzędzenia roztworu PET o stężeniu 30% wag/obj. przy natężeniu przepływu 2 mL/h-1 (rysunki 4F, 5A&B). Sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania z nanowłókien bezpośrednio na rusztowaniu z mikrofibry (nadal przymocowanym do trzpienia) stworzyło rusztowanie dwufazowe (ryc. 3D). Średnie średnice włókien wynosiły 280 nm ± 20 nm oraz 2,30 μm ± 0,06 μm odpowiednio dla fazy nanowłókien i mikrowłókien, porównywalne z wymiarami pojedynczych rusztowań z nanowłókien i mikrofibr. Dodatkowo grubość rusztowania dwufazowego była zbliżona do sumy pojedynczych rusztowań z nanowłókien i mikrowłókien (ryc. 5C). Dzięki zwiększeniu prędkości obrotowej trzpienia (2 000 obr./min/440 m·min-1) uzyskano wysoce wyrównane rusztowania z nano- lub mikrofibry. Roztwór PET o stężeniu 8% wag./obj. nie był optymalny do wytwarzania wyrównanych nanowłókien i wytwarzał włókna o morfologii falowej (ryc. 3F). Wzrost do 10% PET zniwelował ten efekt, ale nadal skutkował zmniejszoną średnicą włókna (216 nm ± 2,2 nm (średnio ± SEM)) w porównaniu z losowo ułożonymi rusztowaniami z nanowłókien. Wyrównanie włókien obliczono, określając odchylenie kąta każdego włókna od średniego kąta włókna. W wyrównanych rusztowaniach z nanowłókien 79% włókien było wyrównanych (± średni kąt włókien 10°) w porównaniu do 10,2% włókien w losowo ustawionych rusztowaniach z nanowłókien (ryc. 5D).

Rusztowanie z 8% nanowłókien zostało użyte do podsumowania RBM, na którym znajdują się komórki nabłonkowe, i zostało użyte do wsparcia hodowli komórek CALU3 (linia komórkowa nabłonka dróg oddechowych). Rusztowanie z mikrofibry o zawartości 30% wag. / obj., które ma bardziej porowaty charakter, zostało użyte do naśladowania regionu podśluzówkowego i zostało wyhodowane z komórkami MRC5 (linia komórkowa fibroblastów dróg oddechowych). Rusztowanie z nanowłókien wyrównane w 10% wag./obj. zapewniało odniesienie topologiczne, aby zapewnić wyrównanie komórek ASM podczas hodowli na rusztowaniu. Wszystkie trzy typy komórek wykazały wzrost żywotności, gdy były hodowane na indywidualnych rusztowaniach przez okres 2 tygodni (Figura 6A) i wyrażały białka specyficzne dla typu komórki po 2-tygodniowym okresie hodowli (Figura 6B, 6C i 6D). Dalsza charakterystyka indywidualnych oddziaływań komórka-rusztowanie została opisana w innym miejscu21,. Sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania z nanowłókien na rusztowaniu z mikrofibry wytworzyło dwufazowe rusztowanie do kokultury komórek nabłonka CALU3 i komórek fibroblastów MRC5 odpowiednio na fazach nanowłókien i mikrowłókien. Hodowla dwóch komórek razem w warunkach statycznych została opisana w innym miejscu22. Dalsze prace mające na celu dodanie innych warstw komórkowych lub wydłużenie czasu hodowli dwufazowej powyżej 2 tygodni w warunkach statycznych okazały się nieskuteczne (dane nie pokazane). Aby wyhodować trójwarstwowy model przez dłuższy czas, użyliśmy bioreaktora perfuzyjnego przepływowego. Komórki CALU3 i MRC5 wysiewano na rusztowaniu dwufazowym, a komórki ASM wysiewano na wyrównanym rusztowaniu i oba hodowano oddzielnie przez 2 dni. Dwa rusztowania zostały następnie zakupione razem, aby utworzyć trójwarstwowy model ściany dróg oddechowych w bioreaktorze (ryc. 7). Obie komory były perfundowane pożywką przez 7 dni, zanim komora nabłonka wierzchołkowego została usunięta, a komórki nabłonkowe hodowano w ALI przez kolejne 7 dni. Rusztowania były mocowane i albo cięte i barwione, albo całe rusztowania były barwione immunologicznie pod kątem markerów specyficznych dla komórek. Sekcje przez hodowlę trójwarstwową wykazały jądra komórkowe rozmieszczone we wszystkich trzech warstwach kokultury (ryc. 8B). Gdy komórki były barwione immunologicznie pod kątem markerów specyficznych dla komórki, komórki nabłonkowe wypełniały wierzchołkową fazę nanowłókien jako zlewającą się warstwę komórkową i barwione dodatnio na obecność cytokeratyny (Figura 8C), w fazie mikrowłókien fibroblasty wybarwione dodatnio dla S100A4 (Figura 8D), a na wyrównanym 10% rusztowaniu komórki ASM wybarwione dodatnio dla SM22α (Figura 8E), wskazując na dobre przeżycie każdego typu komórki w modelu 3D ściany dróg oddechowych.

figure-results-1
Rycina 1. Oskrzelik w drogach oddechowych. Biopsja oskrzeli z ciężkich astmatycznych dróg oddechowych pokazująca nabłonek na siatkowatej błonie podstawnej (RBM), z leżącym poniżej obszarem podśluzówkowym wypełnionym komórkami mezenchymalnymi i otaczającymi wiązkami mięśni gładkich wypełnionymi komórkami mięśni gładkich barwionymi na obecność alfa-aktyny mięśni gładkich (brązowy). Podziałka wskazuje 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Schemat urządzeń do elektroprzędzenia. Strzykawkę zawierającą roztwór polimeru/rozpuszczalnika (z założoną igłą) umieszcza się na pompie strzykawkowej skierowanej w stronę trzpienia. Między igłą a trzpieniem powstaje potencjał elektryczny, który powoduje wyrzucanie włókien z końcówki igły i osadzanie się na obracającym się trzpieniu. Gdy włókno przechodzi przez atmosferę, rozpuszczalnik odparowuje, powodując osadzanie się włókien polimerowych na trzpieniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Porównanie rusztowań elektroprzędzonych z natywnym ECM dróg oddechowych. Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego zdecelularizowanej błony podstawnej (A), pozbawionego komórek przekroju poprzecznego oskrzelików dróg oddechowych (C) i przekroju histologicznego pęczka mięśni gładkich dróg oddechowych (barwionego hematoksyliną i eozyną, podziałka 40 μm) (E) w porównaniu z dwufazowymi (D) i wyrównanymi (F) rusztowaniami PET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Parametry używane do elektroprzędzenia mikrowłókien, nanowłókien i wyrównanych rusztowań indywidualnie oraz dla rusztowania dwufazowego.

figure-results-4
Rysunek 4. Zmiany stężeń PET wpływają na właściwości włókien. Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego rusztowań elektroprzędzonych z roztworów PET o stężeniu 6%, 8%, 10% (A-C), 25%, 30% i 35% (E-G) (wag./obj.). Pokazano również rusztowania wyrównane wykonane z roztworów PET o stężeniu 8% (D) i 30% (H) wag./obj. A-D obrazowane w powiększeniu 5000x, E-H obrazowane w powiększeniu 1000x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Właściwości rusztowań elektroprzędzonych PET. (A) Krzywe rozkładu przedstawiające rozkład średnicy włókien z siatkowatej błony podstawnej macierzy zewnątrzkomórkowej (RBM ECM), losowo ustawionych rusztowań z nano- i mikrowłókien oraz wyrównanego rusztowania z nanowłókien. (B) Histogram przedstawiający względny rozkład wielkości porów w rusztowaniach z nano- i mikrowłókien. (C) Średnia grubość rusztowań z nanowłókien, mikrowłókien, dwufazowych i wyrównanych (średnia±odchylenie standardowe, n=6). (D) Wykres histogramu przedstawiający odchylenie od średniej orientacji włókien w losowych lub wyrównanych rusztowaniach z nanowłókien Analizę włókien rusztowania przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6. Hodowla poszczególnych typów komórek na poszczególnych rusztowaniach. (A) wyniki testu żywotności komórek alamarBlue dla komórek ASM na wyrównanych rusztowaniach, komórek CALU3 na rusztowaniach z nanowłókien i komórek MRC5 na rusztowaniach z mikrofibry (średnia±SEM, n = 3-20). Obrazy rusztowań z nanowłókien, mikrowłókien i wyrównanych włókien (odpowiednio B, C i D) oraz obrazy immunofluorescencyjne komórek CALU3 wybarwionych na obecność E-kadheryny (na czerwono), komórek MRC5 wybarwionych na obecność winkuliny (na czerwono) i komórek ASM wybarwionych na obecność SM22α (na czerwono) na ich specjalistycznym rusztowaniu (E, F i G odpowiednio). Hoechst został użyty do barwienia jąder (kolor niebieski), podziałka wskazuje 40 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. System perfuzyjny dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych. (A) Fotografia zbiornika bioreaktora podłączonego do pompy perystaltycznej i 2x zbiorników mediów. (B) Schemat rusztowań trójwarstwowych. (C) Schemat dwóch obwodów bioreaktora, gdy model dróg oddechowych jest utrzymywany na granicy faz powietrze-ciecz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Kompletny model 3D ściany dróg oddechowych. (A) Biopsja oskrzeli ściany dróg oddechowych z warstwą błony śluzowej zaznaczoną na czerwono, obszarem podśluzówkowym zaznaczonym na zielono i pęczkiem mięśni gładkich zaznaczonym na złoto. (B) Przekrój przez trójwarstwową ścianę dróg oddechowych składającą się z dwufazowych i wyrównanych rusztowań wypełnionych komórkami nabłonka, fibroblastów i mięśni gładkich, utrwalonymi po 2 tygodniach kokultury. Jądra komórkowe barwiono DAPI (kolor niebieski) z równoczesnym obrazowaniem współczynnikiem odbicia rusztowania (kolor szary). Rusztowania zostały również utrwalone i wybarwione immunologicznie pod kątem markerów specyficznych dla komórek po 2 tygodniach, z komórkami CALU3 wybarwionymi na obecność cytokeratyny (zielony) (C), komórkami MRC5 wybarwionymi na S100A4 (zielony) (D) i komórkami mięśni gładkich wybarwionymi na SM22α (czerwony) (E). Podziałka wskazuje 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Tabela 1.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do elektrowirowania włókien polimerowych o właściwościach strukturalnych porównywalnych z naturalnym ECM doprowadziła do powstania wielu naturalnych lub syntetycznych polimerów lub mieszanek polimerowych przędzonych elektrolitycznie w celu odtworzenia tych środowisk. Manipulowanie parametrami procesu (w tym wybór polimeru, stężenie polimeru, rozpuszczalnik, odległość końcówki igły i temperatura) może mieć wpływ na charakterystykę rusztowania; Jednak niektóre parametry mogą mieć większy wpływ na właściwości rusztowania niż inne25,. Podczas modyfikowania średnicy włókna PET stwierdziliśmy, że kluczowymi parametrami są stężenie użytego polimeru, szybkość, z jaką roztwór polimeru był elektroprzędzony oraz średnica igły. Podczas elektroprzędzenia wyrównanych włókien kluczowymi parametrami są zastosowana metoda zbierania (trzpień obrotowy) oraz prędkość, z jaką obraca się trzpień. Dzięki zmniejszeniu prędkości trzpienia do 60 obr./min stwierdziliśmy, że losowo wyrównane rusztowania wykazały większą jednorodność rusztowania w porównaniu z elektroprzędzeniem na płaskiej płycie kolektora.

Przeanalizowano charakterystykę pozbawionej komórek tkanki dróg oddechowych, aby dostarczyć wskazówek dla różnych topografii rusztowań opracowanych dla hodowli każdego typu komórek dróg oddechowych. Elektroprzędzone nanowłókna są atrakcyjnym rusztowaniem do replikowania struktur błony podstawnej ze względu na mały rozmiar porów, ale wysoką porowatość ogólną, która pozwala na zwiększoną dyfuzję metabolitów przy jednoczesnym ograniczeniu ruchu komórek. 9 Optymalizując parametry elektroprzędzenia, przetestowano szereg stężeń PET i natężeń przepływu. Najcieńsze włókna uzyskano przy użyciu roztworu PET o stężeniu 6% wag./obj ., stosowanego wcześniej przez inne grupy. Jednak wysoki poziom ściegania i brak jednorodności były stałymi problemami. Początkowe próby usunięcia perełek obejmowały dodanie kationowego środka powierzchniowo czynnego, bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB), do roztworu w celu obniżenia napięcia powierzchniowego oraz testowanie różnych źródeł PET. Dodatek środka powierzchniowo czynnego zmniejszył ilość perlienia, ale nie w pełni. Po wypróbowaniu wielu komercyjnych źródeł granulek PET, użyto butelki PET do napojów spożywczych, przecinając butelki z napojami i rozpuszczając je w roztworze rozpuszczalnika DCM:TFA. Wykorzystanie tego jako źródła PET spowodowało wzrost jednorodności włókien i zmniejszenie koralików włókien. Zwiększając nieznacznie stężenie roztworu do 8% wag./obj . i zmniejszając średnicę igły (z 18G do 23G), konsekwentnie wytwarzaliśmy wolne od wad nanowłókna o średnicy włókna około 250 nm. Rusztowania z nanowłókien przędzonych elektrycznie mogą być silnie elektrostatyczne po pobraniu z trzpienia, co utrudnia ręczną obsługę rusztowań. Udało się to poprawić dzięki przechowywaniu rusztowań w folii aluminiowej po wirowaniu i namoczeniu w 70% IMS przed użyciem. Wydaje się, że pomogło to w rozproszeniu szczątkowego ładunku elektrostatycznego pozostawionego na rusztowaniu w procesie elektroprzędzenia.

Aby zapewnić topografie podobne do indywidualnych mikrośrodowisk napotykanych przez trzy główne typy komórek dróg oddechowych w ścianie dróg oddechowych, dostosowano podstawowy protokół elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech unikalnych rusztowań dla tych typów komórek: poprzez powolne elektroprzędzenie roztworu PET o niskim stężeniu, wygenerowano losowo ułożone nanowłókna, na które komórki nabłonkowe zostały zasiane (naśladując RBM). Poprzez elektrowirowanie roztworu PET o wyższym stężeniu w szybszym tempie, wygenerowano losowo wyrównane mikrowłókna (wytwarzając bardziej porowate rusztowanie), do których wstrzyknięto fibroblasty (naśladując obszar podśluzówkowy bezpośrednio pod RBM). Poprzez elektroprzędzenie roztworu PET o niskim stężeniu na obracający się trzpień o dużej prędkości wyprodukowano nanowłókna wyrównane w poziomie, na których komórki mięśni gładkich zorientowały się w kierunku włókien, tworząc wyrównane arkusze komórek.

Zwiększone średnice włókien prowadzą do zwiększenia wielkości porów, umożliwiając większą penetrację komórek do rusztowań, a tym samym pomagają stworzyć prawdziwe środowisko 3D. Rusztowania z mikrofibry zastosowano do hodowli fibroblastów w badaniu, aby upewnić się, że komórki znajdują się na wielu płaszczyznach rusztowania. Dzięki zwiększeniu stężenia PET do 30% wag./obj. uzyskano włókna PET o średniej średnicy 2,5 μm. Włókna o większej średnicy (≈ 4 μm) wyprodukowano przy użyciu roztworu PET o stężeniu 35% wag/obj ., ale utracono jednorodność grubości rusztowania i widoczna była większa zmienność między poszczególnymi włóknami. Pory w rusztowaniu z mikrofibry były ponad 7 razy większe niż te mierzone w rusztowaniach z nanowłókien (odpowiednio 10,45 μm vs 1,43 μm), ale nadal statyczne wysiewanie komórek zapewniało ograniczoną penetrację komórkową. Udało się to poprawić dzięki dynamicznemu rozsiewaniu komórek za pomocą miksera orbitalnego, metody, która wcześniej okazała się skuteczna.

Wysoce wyrównane rusztowania z nanowłókien zostały stworzone przez elektroprzędzenie roztworu PET o stężeniu 10% wag./obj . na trzpieniu obracającym się z prędkością 2 000 obr./min (≈ 440 m·min-1). Stężenie PET zwiększono z 8%, aby zapobiec nieregularnej morfologii przypominającej falę, którą włókna wykazywały przy niższych stężeniach. Pomimo wzrostu stężenia, wyrównanie włókien zmniejszyło średnią średnicę włókna (216 nm vs. 255 nm, wyrównane vs. losowe). Duża prędkość trzpienia wyciągającego włókna przed ich wyschnięciem może powodować ten efekt. Ułożenie włókien wpłynęło na ułożenie komórek ASM, a także ma inne fizjologiczne skutki dla komórek ASM, które zostały scharakteryzowane w innym miejscu21.

Głównym ograniczeniem tego protokołu jest brak możliwości obrazowania żywych komórek na rusztowaniach / w rusztowaniach, co uniemożliwia określenie początkowego przyczepiania się lub różnicowania komórek w dłuższym okresie czasu bez poświęcania próbek. Oznacza to, że większość optymalizacji następuje po okresie hodowli; tj. utrwalanie próbek, a następnie mierzenie, czy hodowla komórkowa zakończyła się sukcesem po tym, jak nie była w trakcie hodowli komórkowej. Obserwowanie zmiany koloru w rusztowaniach inkubowanych w alamarBlue (od niebieskiego do różowego) wskazuje, że komórki są obecne i żywotne, ale nie jest idealne. Elektroprzędzenie bardziej przezroczystych polimerów, takich jak żelatyna, może pomóc w wizualizacji komórek na rusztowaniach. Elektroprzędzenie rusztowania nanowłóknistego w naszym modelu pozwoliło na replikację RBM dróg oddechowych, podobnie składających się z gęstych nanowłókien, na których znajdują się komórki nabłonkowe. Wcześniej wykazano, że komórki strukturalne nie mogą migrować przez rusztowanie z nanowłókien22, chociaż komórki odpornościowe są do tego zdolne (dane nie pokazane). Chociaż jest to korzystne dla hodowli określonych typów komórek na powierzchni 3D (takich jak komórki nabłonka i śródbłonka), to zapobieganie strukturalnej migracji komórek przez nanowłókna może być szkodliwe dla hodowli innych typów komórek. Ponieważ mięśnie gładkie nie są w stanie migrować przez wyrównane rusztowanie z nanowłókien, zmontowaliśmy trójwarstwową kokulturę z warstwami mięśni gładkich i fibroblastów zwróconymi do siebie (w przeciwieństwie do wyrównanego rusztowania oddzielającego dwa typy komórek). Chociaż pozwala to na bliskie przyleganie komórek, obecne badanie nie może stwierdzić, czy jeden typ komórek (fibroblasty lub mięśnie gładkie) wyprzedzi całą warstwę w dłuższym okresie hodowli. Pomimo tych ograniczeń opracowano realny trójwarstwowy model ściany dróg oddechowych, który stanowi alternatywną platformę do badania interakcji między tymi wieloma typami komórek. Podobne trójwarstwowe badanie zostało niedawno opublikowane, w którym fibroblasty były osadzone w cylindrycznym hydrożelu kolagenu I z mięśniami gładkimi wysianymi na zewnętrznej powierzchni i komórkami nabłonkowymi na powierzchni światła17. Stabilność mechaniczna opracowanych tu rusztowań elektroprzędzonych pozwoliłaby na formowanie podobnych konstrukcji rurowych i pozostaje aktualnym celem badawczym naszej grupy. Chociaż badanie koncentrowało się na drogach oddechowych, kilka narządów w ciele dzieli tę podstawową jednostkę strukturalną błony śluzowej, a poprzez modyfikację lokatorów wyróżnionych w tym badaniu, podobne platformy można opracować dla tkanek zawierających jednostkę błony podstawnej, w tym naczynia krwionośne, pęcherz moczowy i rogówkę, w których zastosowano wielowarstwowe modele oparte na kolagenie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania prowadzące do tych wyników AirPROM otrzymały finansowanie z Unii Europejskiej na podstawie umowy o grant nr 270194.Ta praca była również finansowana przez Narodowe Centrum Wymiany, Udoskonalania i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs) oraz Centrum Kształcenia Doktorantów (EPSRC) w Medycynie Regeneracyjnej, Wielka Brytania

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelki z politereftalanu etylenu (PET)Lucozade (GSK)Nie dotyczyŹródło PET do elektroprzędzenia. Pokroić na małe kawałki i w razie potrzeby odważyć
Dichlorometan (DCM)Rozpuszczalnik do PET
Kwas trifluorooctowy (TFA)SigmaRozpuszczalnik do PET
Trzpień obrotowyWbudowany w domuSłuży do zbierania włókien elektroprzędzonych. Obracając się z różnymi prędkościami, włókna mogą być wyrównane lub zorientowane losowo
Pompa strzykawkowaAparaturaHarvarda stosowana w procesie elektroprzędzenia
DMEM-F12Pożywka hodowlana Gibcodla komórek CALU3
DMEMGibcoPożywka hodowlana dla komórek HASM
MEMGibcoPożywka hodowlana dla komórek MRC5
Antybiotyk/antybiotyk rozwiązanieSuplement GibcoMedia
FCSSuplement GibcoMedia
Mieszalnik orbitalny (Orbital shake 503)Stuart ScientificDo dynamicznego wysiewu komórek na rusztowaniach z mikrofibry
Pompa perystaltyczna Watson MarlowZa zapewnienie przepływu mediów przez bioreaktor
Bioreaktor 3DKubeKiyatecdo hodowli komórek 3D

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  3. Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
  4. Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
  5. Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
  6. Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
  7. Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
  8. Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
  9. Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
  10. Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
  11. Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
  12. Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
  13. Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
  14. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
  15. Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
  16. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  17. Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
  18. West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
  19. Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
  20. Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
  21. Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
  22. Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014(2014).
  23. Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
  24. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
  25. Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171(2013).
  26. Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
  27. Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
  28. Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
  29. Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460(2008).
  30. Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
  31. Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
  32. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  33. Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
  34. Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
  35. Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
  36. Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
  37. Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Electrospinning ProcessTri layered ScaffoldAirway Wall ModelPET Polymer SolutionRandomly Aligned MicrofiberAligned Nanofiber ScaffoldBioreactor Co culture SystemCell Type SeedingScanning Electron MicroscopyIntercellular Cross talk

Powiązane artykuły