Artykuł metodologiczny

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52986

⸱

31 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 2Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, School of Pharmacy, University of Nottingham, 3Division of Immunology and Allergy, School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 4Division of Respiratory Medicine, School of Clinical Sciences, University of Nottingham, 5NIHR Respiratory Biomedical Research Unit, University of Leicester, 6School of Sport, Exercise, and Health Sciences, Loughborough University

W tym artykule

Podsumowanie

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Streszczenie

Elektroprzędzenie to wysoce elastyczna metoda wytwarzania porowatych rusztowań włóknistych 3D, które mogą być wykorzystane w hodowli komórkowej in vitro. Zmiany parametrów wewnętrznych w procesie pozwalają na wysoki stopień kontroli nad cechami rusztowania, w tym średnicą włókien, wyrównaniem i porowatością. Opracowując rusztowania o rozmiarach i topografii podobnych do matryc zewnątrzkomórkowych specyficznych dla narządów lub tkanek (ECM), można stworzyć mikrośrodowiska reprezentatywne dla tych, na które narażone są komórki in situ.

Ściana oskrzelików dróg oddechowych, składająca się z trzech głównych mikrośrodowisk, została wybrana jako tkanka modelowa. Korzystając z bezkomórkowego ECM dróg oddechowych jako przewodnika, elektroprzędziliśmy niedegradowalny polimer, politereftalan etylenu (PET), za pomocą trzech różnych protokołów, aby wytworzyć trzy indywidualne elektroprzędzone rusztowania zoptymalizowane pod kątem hodowli komórek nabłonka, fibroblastów lub mięśni gładkich. Korzystając z dostępnego na rynku systemu bioreaktorów, stabilnie przeprowadziliśmy wspólną hodowlę trzech typów komórek, aby zapewnić model ściany dróg oddechowych in vitro przez dłuższy czas.

Ten model podkreśla potencjał takich metod do wykorzystania w badaniach diagnostycznych in vitro badających ważne mechanizmy międzykomórkowe lub oceniających nowe cele farmaceutyczne, dostarczając odpowiednią platformę umożliwiającą hodowlę w pełni zróżnicowanych dorosłych komórek w 3D, specyficznych dla tkanek środowiskach.

Wprowadzenie

Dziedzina medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej szybko się rozwija, z przełomowymi odkryciami w regeneracji tchawicy i nerek, dwoma godnymi uwagi osiągnięciami ostatnich lat. Biomateriały opracowane w inżynierii tkankowej stają się coraz bardziej dostępne, z możliwością przeniesienia takich protokołów do mniej specjalistycznych laboratoriów. Jedną z dziedzin, która może przynieść korzyści dzięki rosnącemu wykorzystaniu biomateriałów, jest diagnostyka in vitro.

Badania in vitro są ważną platformą do badania wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w obrębie pojedynczych typów komórek i pomogły nakreślić mechanizmy leżące u podstaw wielu patofizjologii chorób. Badania te na ogół opierają się na hodowli pojedynczego typu komórki jako monowarstwy na plastiku do hodowli tkankowej (TCP); dwuwymiarowa (2D) sztywna powierzchnia znacznie mniej elastyczna i porowata niż trójwymiarowe (3D) środowisko, na które narażone są komórki w tkance lub narządzie. Modele zwierzęce są tradycyjnie wykorzystywane do potwierdzania, że efekty stwierdzone in vitro przekładają się również na całą tkankę i mogą być również wykorzystywane jako platformy przedkliniczne do badania chorób ludzkich. Jednak różnice międzygatunkowe podważają tę zależność od modeli zwierzęcych w naszym rozumieniu chorób ludzkich. Na przykład, wiele informacji na temat choroby płuc astmy opiera się na modelu mysim, pomimo nieodłącznych różnic między stanem ludzkim a tym modelem, w tym niewielkich dowodów na naciekanie komórek tucznych w pęczku mięśni gładkich dróg oddechowych lub zdolności do spontanicznego rozwoju choroby w modelu zwierzęcym3,4. Istnieją również względy etyczne dotyczące korzystania z modeli zwierzęcych, przy czym w Wielkiej Brytanii i innych krajach zachęca się do stosowania standardu "3R" "wymiany, udoskonalenia i redukcji" w eksperymentach na zwierzętach.

Atrakcyjną alternatywą byłaby rekapitulacja tkanek ludzkich in vitro, tworzenie struktur do badania kooperatywnego charakteru między typami komórek dorosłych ludzi w jednej jednostce. Komórki istnieją w wielokomórkowych strukturach 3D w tkance, z których każda znajduje się w unikalnym mikrośrodowisku. Hodowla komórek na TCP pozwala tylko na hodowlę monowarstw komórkowych, które nie są w stanie replikować tego środowiska ani zapewnić zdolności do hodowli wielokomórkowej. Postęp w dziedzinie biomateriałów daje możliwość opracowania zarówno naturalnych, jak i syntetycznych platform 3D do hodowli komórek. Zdecellularyzacja ECM może być stosowana do hodowli komórek 3D po recellularizacji z innymi typami komórek, w tym komórkami macierzystymi1, jednak takie protokoły mogą być złożone i czasochłonne, a dostępność tkanek jest ograniczona i w dużej mierze nie pochodzi od człowieka. Inne protokoły pozwalają na większą kontrolę nad tworzonymi środowiskami komórkowymi, takimi jak nanoimprinting, osadzanie ECM, technologie arkuszy komórkowych lub elektroprzędzenie. Elektroprzędzenie tworzy włókninowe porowate maty 3D z włókien o średnicach od nanometrów do mikrometrów, odwzorowując naturalne wymiary ECM. Rusztowania elektroprzędzone są coraz częściej stosowane jako platformy do hodowli komórek 3D. Manipulowanie parametrami elektroprzędzenia pozwala na skomplikowaną kontrolę nad cechami rusztowania, takimi jak wielkość porów, średnica włókien, topografia i wyrównanie oraz skład chemiczny powierzchni. Wykazano, że zmiany tych parametrów bezpośrednio wpływają na adhezję i wzrost komórek, gdy komórki były hodowane w izolacji.

Te zalety zostały wykorzystane w obecnym badaniu, aby umożliwić hodowlę wielu typów komórek jako pojedynczego konstruktu tkanki 3D, wykorzystując oskrzelik dróg oddechowych jako modelową strukturę tkankową 3D. Ściana oskrzelików składa się z trzech głównych obszarów (ryc. 1). Błona śluzowa to miejsce, w którym komórki nabłonka dróg oddechowych znajdują się na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), stanowiąc ważną barierę dla środowiska zewnętrznego. Znajdują się one na siatkowatej błonie podstawnej (RBM), ściśle zwartym ECM składającym się głównie z kolagenu IV, perlekanów i laminin. Warstwa podśluzówkowa znajduje się bezpośrednio pod błoną śluzową, bardziej porowatym regionem składającym się z wielu typów komórek, w tym fibroblastów, miofibroblastów i naciekających leukocytów w warunkach chorobowych. Wreszcie wiązki mięśni gładkich owijają się wokół dróg oddechowych w spiralny sposób i składają się z wyrównanych arkuszy mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM). Jest to względny stan kurczliwości mięśni gładkich, który kontroluje napięcie dróg oddechowych. Zastosowanie rusztowań elektroprzędzonych w układzie oddechowym do niedawna ograniczało się do celów regeneracyjnych; z pomyślnym przeszczepieniem elektroprzędzonej tchawicy. Chociaż takie zabiegi są skuteczne, ich liczba jest ograniczona i koncentrują się na tchawicy ze względu na stosunkowo prostą naturę funkcji tkanki. Istnieją ograniczone przykłady modeli dróg oddechowych stosowanych w diagnostyce in vitro, które koncentrują się głównie na pomiarach skurczu mięśni gładkich. Nietoksyczny i niedegradowalny polimer politereftalan etylenu (PET) był wcześniej przędzony elektrolitycznie i został zastosowany w niniejszym badaniu, aby zapewnić, że wyprodukowane rusztowania mogą być przechowywane przez długi czas bez degradacji (co pozwala na ich użycie "z półki"), a także nadają się do stabilnej hodowli komórkowej przez dłuższy czas. Wcześniejsze badania naszej grupy wykazały, że wykorzystując trzy warianty podstawowego protokołu elektroprzędzenia, można wyprodukować trzy indywidualne rusztowania elektroprzędzone PET, aby zapewnić optymalną topografię do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych, fibroblastów i mięśni gładkich w izolacji21,22 oraz kokultury komórek nabłonka dróg oddechowych i fibroblastów22. Stwierdzono, że średnica włókien znacznie wpływa na funkcjonalność nabłonka22, a wyrównanie włókien pozwoliło na wygenerowanie wyrównanych arkuszy mięśni gładkich21. Badania te prowadzono niezależnie od siebie w warunkach statycznych. W niniejszym badaniu te różne rusztowania, zawierające w pełni zróżnicowane dorosłe komórki ludzkie, były hodowane przez tydzień w ALI w dostępnym na rynku bioreaktorze jako przekrój 3D ściany drogi oddechowej, zapewniając fizjologicznie istotny model in vitro do badania odpowiedzi międzykomórkowych dróg oddechowych. Chociaż protokół ten wykorzystuje oskrzeliki dróg oddechowych jako system modelowy, może on zostać zaadaptowany jako platforma do kokultury 3D jednostek błony śluzowej z innych narządów.

Protokół

Pierwotne komórki ASM od osób bez astmy zostały wyizolowane z biopsji oskrzeli w Glenfield Hospital (Leicester, Wielka Brytania), jak opisano wcześniej. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną w Leicestershire, a pacjenci wyrazili pisemną, świadomą zgodę.

1. Rusztowania PET do elektroprzędzenia (Rysunek 2)

  1. Przygotować roztwór (10 ml) PET z butelki do napojów w roztworze 1:1 dichlorometanu (DCMro) – kwasu trifluorooctowego (TFA). Stężenia PET wynoszące 8%, 30% i 10% wagowo-objętościowe (wt/vol) są wymagane odpowiednio dla nanowłókien, mikrowłókien i wyrównanych rusztowań, a następnie miesza się roztwór O/N w temperaturze pokojowej, aby PET się rozpuścił.
  2. Przenieść roztwór PET do strzykawki i przymocować igłę 23-G (dla nanowłókna) lub 18-G (dla mikrofibry i wyrównanej) do strzykawki i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej z napędem. Upewnij się, że czubek igły jest obrócony do dołu.
  3. Umieść trzpień w odległości 15 cm od końcówki igły, upewniając się, że igła jest skierowana na środek bębna.
  4. Przymocuj zasilanie elektryczne do końcówki igły za pomocą zacisków krokodylkowych i uziemij trzpień (przez gniazdo bananowe) do ziemi. Włącz zasilanie trzpienia i ustaw prędkość na 60 obr./min (co odpowiada około 13,2 m·min-1) dla rusztowań z nanowłókien i mikrofibry. Ustaw prędkość na 2 000 obr./min (co odpowiada około 440 m·min-1) dla wyrównanych rusztowań.
  5. Ustawić pompę strzykawkową na natężenie przepływu 0,5 ml·hr-1 dla rusztowań z nanowłókien losowych i wyrównanych lub 2,0 ml·hr-1 dla rusztowań z mikrofibry. Pozwól pompie pracować do momentu, gdy roztwór zostanie wyciśnięty z końcówki igły w celu usunięcia powietrza z igły. Następnie zatrzymaj pompę.
  6. Na pompie strzykawkowej ustawić całkowitą objętość roztworu do wydalenia na 2 ml i uruchomić pompę.
  7. Ustaw napięcie zasilania na 14 kV i włącz zasilanie.
  8. Elektrowirować do momentu, aż 2 ml roztworu zostanie elektroprzędzone (4 godziny w przypadku rusztowań z nanowłókien i wyrównanych, 1 godzina w przypadku rusztowań z mikrofibry).
  9. Przetnij rusztowanie ostrzem wzdłuż szerokości trzpienia. W ten sposób powstaje arkusz rusztowania 2D o wielkości powierzchni trzpienia (w tym przypadku prostokątny arkusz o wymiarach 22 cm x 11 cm), który można ostrożnie odkleić od trzpienia). Przechowuj rusztowanie w folii aluminiowej, aby zmniejszyć ładunek elektrostatyczny).
    Uwaga: Rusztowania dwufazowe są wytwarzane przez sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania z nanowłókien bezpośrednio na rusztowaniu z mikrofibry.

2. Sterylizacja rusztowań przed użyciem w hodowli komórkowej

  1. Z arkusza rusztowania wybij krążki dwufazowych lub wyrównanych rusztowań za pomocą pisaka do biopsji o średnicy 0,8 mm i przyklej do uszczelki za pomocą nietoksycznego kleju akwariowego.
  2. Sterylizować rusztowania za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut z każdej strony rusztowań przed namoczeniem w roztworze antybiotyku/antybiotyku / antybiotyku o stężeniu 20% obj. (2x105 jednostek ml-1 penicyliny G, 2 000 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 500 μg ml-1 amfoterycyny B) O/N w temperaturze 4 °C.
  3. Umyć rusztowania PBS 3 razy, a następnie przechowywać rusztowania w płytkach studzienkowych TCP w PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Składniki pożywek do hodowli komórkowych

  1. Hodowla komórek nabłonka CALU3 w pożywce DMEM-F12 uzupełnionej 10% obj. / obj. płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 nM roztworu L-glutaminy, 1% obj. / roztworu antybiotyku / roztworu przeciwgrzybiczego (10 000 jednostek ml-1 penicyliny G, 100 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 25 μg ml-1 amfoterycyny B).
  2. Hodowla fibroblastów MRC5 i komórek ASM w pożywkach DMEM uzupełnionych 10% obj./obj. płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 nM roztworem L-glutaminy, 1% obj. antybiotykiem/roztworem przeciwgrzybiczym (10 000 jednostek ml-1 penicyliny G, 100 mg ml-1 siarczanu streptomycyny i 25 μg ml-1 amfoterycyny B).
  3. Hodowla komórek nabłonka-fibroblast-ASM w mieszaninie pożywek 70:30 DMEM-F12:DMEM.

4. Wysiewanie komórek fibroblastów i nabłonka na dwufazowe rusztowanie

  1. Na płytce do hodowli tkankowej namoczyć rusztowania w pożywce uzupełnionej DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed wysiewem komórek.
  2. Usuń pożywkę uzupełnioną DMEM, umieść fazę mikrofibry rusztowania wierzchołkowo i wysiewaj 1,5 x104 komórki fibroblastów MRC5 w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM. Mieszać płytkę na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny, przed pozostawieniem w inkubatorze w temperaturze 37 °C 5% CO2 w powietrzu O/N.
  3. Odwrócić rusztowanie tak, aby faza nanowłókien rusztowania była skierowana wierzchołkowo, wysiać 3,0 x104 komórki nabłonkowe CALU3 w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM-F12 na fazę nanowłókien rusztowania i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu przed zanurzeniem rusztowania w 70:30 DMEM-F12: Pożywki O / N uzupełnione DMEM przed przeniesieniem do bioreaktora.

5. Wysiewanie komórek ASM na wyrównane rusztowanie

  1. Na płytce do hodowli tkankowej namoczyć rusztowania w pożywce z dodatkiem DMEM i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przed wysiewem 2,5 x104 komórek w 30 μl pożywki uzupełnionej DMEM i inkubować przez 2 godziny (37 °C, 5% CO2 w powietrzu). Zanurz rusztowanie w pożywce uzupełnionej DMEM, wróć do inkubatora i opuść O/N przed założeniem trójkulturowości w bioreaktorze.

6. Konfiguracja Tri-Culture za pomocą Systemu Bioreaktora (Rysunek 7)

  1. Umieść dwufazową uszczelkę rusztowania w rowku w jednej komorze z fazą nabłonkową skierowaną do góry do komory.
  2. Umieść wyrównane rusztowanie pod rusztowaniem dwufazowym (tak, aby przylegało do fazy mikrofibry rusztowania dwufazowego) i zablokuj ze sobą dwie komory bioreaktora.
  3. Zmontuj dwa obwody przepływu perfuzyjnego połączone z dwoma zbiornikami pożywki (pożywka uzupełniona DMEM-F12 w zbiorniku wierzchołkowym, pożywka uzupełniona DMEM-F12/DMEM w zbiorniku podstawowym) i pompuj media wokół dwóch obwodów z prędkością około 0,1 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej (40 ml pożywki jest zawracane przez każdy obwód). Wszystkie części systemu należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu.
  4. Po tygodniu usuń pożywkę z komory wierzchołkowej i hoduj komórki nabłonkowe w ALI przez kolejny tydzień przed analizą.

Wyniki

Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego tkanki dróg oddechowych po decelularyzacji lub obrazy immunohistologiczne z biopsji dróg oddechowych pozwoliły zidentyfikować pożądane cechy ECM dróg oddechowych, które chcieliśmy wprowadzić do topografii rusztowań wytworzonych metodą elektroprzędzenia: Natywna macierz RBM składa się z włókien o średnicy około 153 nm ± 30.6 nm (średnia ± SD n=50 pomiarów) (Rycina 3A i 5A), podczas gdy macierz otaczająca RBM miała charakter bardziej porowaty (Rycina 3C). Przekroje immunohistologiczne wiązek mięśni gładkich pokazują, że ASM występuje w formie wyrównanych arkuszy komórek21 (Rycina 3E). Informacje te posłużyły do określenia charakterystyk wprowadzonych do rusztowań elektroprzędzionych. Obracający się trzpień mógł stabilnie rotować z dużymi prędkościami (>2,000 rpm/ 440 m·min-1), co pozwoliło na wytworzenie rusztowań z wyrównanymi włóknami. Powolna rotacja trzpienia (60 rpm 13.2 m·min-1) nie wpływała na orientację włókien, ale pozwalała na uzyskanie rusztowań o bardziej jednolitej grubości niż w przypadku elektroprzędzenia na statyczną płytkę. Poprzez zmianę parametrów elektroprzędzenia (stężenie PET i szybkość przepływu roztworu) możliwe było stworzenie rusztowań z włóknami o średnicach rzędu kilku mikrometrów lub setek nanometrów (parametry elektroprzędzenia podano w Tabeli 1).

Włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia o średnicach odpowiadających naturalnym włóknom RBM (150 nm) zostały wytworzone przy użyciu 6% roztworu PET, jednak przy tak niskich stężeniach PET dochodziło do tworzenia się kropel na włóknach (Rysunek 4A). Zjawisko to wyeliminowano poprzez zwiększenie stężenia roztworu PET do 8%, co pozwoliło na otrzymanie jednorodnych nanowłókien o średniej średnicy 255 nm ± 2.4 nm (średnia ± SEM) i średniej wielkości porów 1.43 µm ± 0.02 µm (Rysunki 4B, 5A&B). Aby przeprowadzić elektroprzędzenie nanowłókien, konieczne było zmniejszenie rozmiaru igły z 18 G na 23 G, co pozwoliło na zastosowanie wolniejszych przepływów przy zachowaniu wyższej prędkości przepływu i ograniczeniu zapychania się igły, co było powtarzającym się problemem przy użyciu większej igły. Podczas elektroprzędzenia mikrowłókien zwiększenie stężenia roztworu do >30% PET doprowadziło do braku jednorodności średnicy włókien (Rysunek 4F) oraz do wielokrotnych zatorów w końcówce igły ze względu na wysoką lepkość roztworu. Jednorodne maty z mikrowłókien o średniej średnicy włókien 2.50 µm ± 0.02 µm (średnia ± SEM) i średniej wielkości porów 10.45 µm ± 0.13 µm zostały otrzymane podczas elektroprzędzenia 30% wt/vol roztworu PET przy szybkości przepływu 2 mL/h-1 (Rysunki 4F, 5A&B). Sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania z nanowłókien bezpośrednio na rusztowaniu z mikrowłókien (nadal przymocowanym do trzpienia) pozwoliło na stworzenie rusztowania bifazowego (Rysunek 3D). Średnie średnice włókien dla fazy nanowłókien i mikrowłókien wynosiły odpowiednio 280 nm ± 20 nm oraz 2.30 µm ± 0.06 µm, co jest porównywalne z wymiarami poszczególnych rusztowań z nanowłókien i mikrowłókien. Dodatkowo grubość rusztowania bifazowego była zbliżona do sumy grubości pojedynczych rusztowań z nanowłókien i mikrowłókien (Rysunek 5C). Poprzez zwiększenie prędkości obrotowej trzpienia (2,000 rpm/440 m·min-1) otrzymano wysoce uporządkowane rusztowania z nanowłókien lub mikrowłókien. 8% wt/vol roztwór PET nie był optymalny do wytwarzania uporządkowanych nanowłókien i prowadził do powstania włókien o morfologii falistej (Rysunek 3F). Zwiększenie stężenia do 10% PET zniosło ten efekt, ale nadal skutkowało zmniejszoną średnicą włókien (216 nm ± 2.2 nm (średnia ± SEM)) w porównaniu do przypadkowo zorientowanych rusztowań z nanowłókien. Uporządkowanie włókien obliczono poprzez wyznaczenie odchylenia kąta każdego włókna od średniego kąta włókien. W uporządkowanych rusztowaniach z nanowłókien 79% włókien było zorientowanych (± 10° średniego kąta włókien) w porównaniu do 10,2% włókien w przypadkowo zorientowanych rusztowaniach z nanowłókien (Rysunek 5D).

Do odtworzenia błony piasecznej (RBM), na której znajdują się komórki nabłonkowe, wykorzystano rusztowanie z nanowłókien o stężeniu 8%, które posłużyło do hodowli komórek CALU3 (linii komórkowej nabłonka dróg oddechowych). Rusztowanie z mikrowłókien o stężeniu 30% wt/vol, charakteryzujące się większą porowatością, zastosowano do imitacji obszaru podśluzowego i hodowano na nim komórki MRC5 (linii komórkowej fibroblastów dróg oddechowych). Rusztowanie z uporządkowanych nanowłókien o stężeniu 10% wt/vol zapewniło referencję topologiczną, aby zagwarantować uporządkowanie komórek mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM) podczas hodowli na rusztowaniu. Wszystkie trzy typy komórek wykazały wzrost żywotności podczas hodowli na poszczególnych rusztowaniach w okresie 2 tygodni (Ryc. 6A) oraz wykazywały ekspresję białek specyficznych dla danego typu komórek po 2-tygodniowym okresie hodowli (Ryc. 6B, 6C i 6D). Dalsza charakterystyka oddziaływań poszczególnych komórek z rusztowaniami została opisana w innym opracowaniu21,. Sekwencyjne elektroprzędzenie rusztowania nanowłóknistego na rusztowaniu mikrowłóknistym pozwoliło na wytworzenie rusztowania dwufazowego do kokultury komórek nabłonkowych CALU3 oraz komórek fibroblastycznych MRC5 odpowiednio na fazie nanowłóknistej i mikrowłóknistej. Hodowla obu typów komórek razem w warunkach statycznych została opisana w innym opracowaniu22. Dalsze próby dodania innych warstw komórkowych lub przedłużenia czasu hodowli dwufazowej powyżej 2 tygodni w warunkach statycznych zakończyły się niepowodzeniem (dane nie zostały przedstawione). W celu hodowli modelu trójwarstwowego przez dłuższy czas zastosowano bioreaktor przepływowy. Komórki CALU3 i MRC5 zasiano na rusztowaniu dwufazowym, a komórki ASM na rusztowaniu uporządkowanym; obie grupy hodowano oddzielnie przez 2 dni. Następnie oba rusztowania połączono w bioreaktorze, tworząc trójwarstwowy model ściany dróg oddechowych (Ryc. 7). Obie komory przepływowo nawodniono pożywką przez 7 dni, po czym z komory nabłonkowej (apikalnej) usunięto pożywkę i hodowano komórki nabłonkowe w warunkach interfejsu powietrze-ciecz (ALI) przez kolejne 7 dni. Rusztowania utrwalono, a następnie albo wykonano ich przekroje i zabarwiono, albo przeprowadzono immunostaining całych rusztowań pod kątem markerów specyficznych dla komórek. Przekroje przez kulturę trójwarstwową wykazały obecność jąder komórkowych we wszystkich trzech warstwach kokultury (Ryc. 8B). Podczas immunostainingu na markery specyficzne dla komórek stwierdzono, że komórki nabłonkowe zasiedliły apikalną fazę nanowłóknistą, tworząc zbitą warstwę komórkową i wykazując pozytywne barwienie na cytokeratynę (Ryc. 8C); w fazie mikrowłóknistej fibroblasty barwiły się pozytywnie na S100A4 (Ryc. 8D), a na uporządkowanym rusztowaniu 10% komórki ASM barwiły się pozytywnie na SM22α (Ryc. 8E), co wskazuje na dobrą przeżywalność każdego typu komórek w obrębie 3D modelu ściany dróg oddechowych.

Schemat histologiczny; oznaczone warstwy tkanki płucnej: śluzówka, podśluzówka, mięśnie gładkie, nabłonek.
Rycina 1. Bronchiolka dróg oddechowych. Biopsja oskrzeli z dróg oddechowych pacjenta z ciężką astmą, przedstawiająca nabłonek na błonie podstawnej siateczkowatej (RBM), z leżącym pod nią obszarem podśluzówką z populacją komórek mezenchymalnych oraz otaczającymi pęczkami mięśni gładkich z komórkami mięśni gładkich wybarwionymi na alfa-aktynę mięśni gładkich (kolor brązowy). Pasek skali wskazuje 200 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat układu do elektroprzędzenia; pompa strzykawkowa, źródło napięcia 14kV, mandrel do produkcji włókien.
Rysunek 2. Schemat urządzenia do elektroprzędzenia. Strzykawka zawierająca roztwór polimeru w rozpuszczalniku (z przymocowaną igłą) jest umieszczona na pompie strzykawkowej naprzeciwko mandrelu. Między igłą a mandrelem wytworzony zostaje potencjał elektryczny, co powoduje wyrzut włókien z końcówki igły i ich osadzanie się na obracającym się mandrelu. Podczas przemieszczania się włókna przez atmosferę rozpuszczalnik odparowuje, co prowadzi do osadzenia włókien polimerowych na mandrelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy SEM tkanek i włókien rusztowania; porównanie mikrostrukturalne w materiale biologicznym.
Rysunek 3. Porównanie rusztowań elektroprządlanych z natywnym ECM dróg oddechowych. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego zdecelularyzowanej błony podstawnej (A), przekroju poprzecznego zdecelularyzowanego oskrzelika (C) oraz przekroju histologicznego wiązki mięśni gładkich dróg oddechowych (barwienie hematoksyliną i eozyną, pasek skali 40 µm) (E) w porównaniu z rusztowaniami z PET z nanowłókien (B), dwufazowymi (D) oraz uporządkowanymi (F). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1. Parametry zastosowane do elektroprzędzenia w oddzielności mikrowłókien, nanowłókien i rusztowań uporządkowanych oraz dla rusztowania dwufazowego.

SEM nanowłókien i mikrowłókien; porównanie orientacji losowej i uporządkowanej; analiza strukturalna.
Rysunek 4. Zmiana stężeń PET wpływa na charakterystykę włókien. Obrazy z scanning electron microscope rusztowań elektroprząśniczych otrzymanych z roztworów PET o stężeniach 6%, 8%, 10% (A-C), 25%, 30% i 35% (E-G) (wt/vol). Przedstawiono również rusztowania uporządkowane otrzymane z roztworów PET o stężeniach 8% (D) i 30% (H) wt/vol. A-D obrazowane przy powiększeniu 5,000X, E-H obrazowane przy powiększeniu 1,000X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza średnicy włókien, wielkości porów, grubości i odchylenia kąta włókien; cztery wykresy porównawcze.
Rycina 5. Właściwości rusztowań PET otrzymanych metodą elektroprzędzenia. (A) Krzywe rozkładu średnicy włókien dla macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej siateczkowej (RBM ECM), rusztowań z nano- i mikrowłókien o przypadkowym ułożeniu oraz rusztowania z nanowłókien uporządkowanych. (B) Histogram przedstawiający względny rozkład wielkości porów w rusztowaniach z nano- i mikrowłókien. (C) Średnia grubość rusztowań z nanowłókien, mikrowłókien, dwufazowych i uporządkowanych (średnia±odchylenie standardowe, n=6). (D) Wykres histogramowy przedstawiający odchylenie od średniej orientacji włókien w rusztowaniach z nanowłókien o ułożeniu przypadkowym lub uporządkowanym. Analiza włókien rusztowań została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania ImageJ. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres absorbancji wzrostu komórek i obrazy SEM; barwienie E-kadheryny, winkuliny i SM22α na rusztowaniach.
Rycina 6. Hodowla poszczególnych typów komórek na poszczególnych rusztowaniach. (A>) wyniki testu żywotności komórek alamarBlue dla komórek ASM na rusztowaniach wyrównanych, komórek CALU3 na rusztowaniach nanowłóknistych i komórek MRC5 na rusztowaniach mikrowłóknistych (średnia±SEM, n=3-20). Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla rusztowań nanowłóknistych, mikrowłóknistych i wyrównanych włókien (odpowiednio B, C i D) oraz obrazy immunofluorescencyjne komórek CALU3 barwionych na E-kadherynę (czerwony), komórek MRC5 barwionych na winkulinę (czerwony) i komórek ASM barwionych na SM22α (czerwony), każda z nich na odpowiednim specjalistycznym rusztowaniu (odpowiednio E, F i G). Do barwienia jąder komórkowych użyto barwnika Hoechst (niebieski), pasek skali wskazuje 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ kokultury trójfazowej z pompą perystaltyczną, zbiornikiem na medium, filtrem 0,2 µm i 3DKube.
Rysunek 7. System perfuzji dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych. (A) Zdjęcie naczynia bioreaktora połączonego z pompą perystaltyczną i dwoma zbiornikami na medium. (B) Schemat trójwarstwowych rusztowań. (C) Schemat dwóch obwodów bioreaktora w sytuacji, gdy model dróg oddechowych znajduje się na styku powietrze-ciecz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat histologiczny; analiza nabłonka, cytokeratyny i fibroblastów; mikroskopia, badanie struktury tkanki.
Rysunek 8. Kompletny trójwymiarowy model ściany dróg oddechowych. (A) Biopsja oskrzelowa ściany dróg oddechowych z zaznaczoną na czerwono warstwą błony śluzowej, na zielono obszarem podśluzowym oraz na złoto pęczkiem mięśni gładkich. (B) Przekrój przez trójwarstwową ścianę dróg oddechowych składającą się z dwufazowych i wyrównanych rusztowań zasiedlonych komórkami nabłonkowymi, fibroblastami i komórkami mięśni gładkich, utrwalonych po 2 tygodniach kokultury. Jądra komórkowe barwiono DAPI (niebieski), jednocześnie obrazując refleksyjność rusztowań (szary). Rusztowania utrwalono i poddano również immunostynowaniu pod kątem markerów specyficznych dla komórek po 2 tygodniach: komórki CALU3 barwiono na cytokeratynę (zielony) (C), komórki MRC5 barwiono na S100A4 (zielony) (D), a komórki mięśni gładkich barwiono na SM22α (czerwony) (E). Pasek skali wskazuje 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela wytwarzania rusztowania polimerowego, szczegółowo opisująca parametry mikrowłókien, nanowłókien i warunki ustawień.
Tabela 1.

Dyskusja

Zdolność do elektrowirowania włókien polimerowych o właściwościach strukturalnych porównywalnych z naturalnym ECM doprowadziła do powstania wielu naturalnych lub syntetycznych polimerów lub mieszanek polimerowych przędzonych elektrolitycznie w celu odtworzenia tych środowisk. Manipulowanie parametrami procesu (w tym wybór polimeru, stężenie polimeru, rozpuszczalnik, odległość końcówki igły i temperatura) może mieć wpływ na charakterystykę rusztowania; Jednak niektóre parametry mogą mieć większy wpływ na właściwości rusztowania niż inne25,. Podczas modyfikowania średnicy włókna PET stwierdziliśmy, że kluczowymi parametrami są stężenie użytego polimeru, szybkość, z jaką roztwór polimeru był elektroprzędzony oraz średnica igły. Podczas elektroprzędzenia wyrównanych włókien kluczowymi parametrami są zastosowana metoda zbierania (trzpień obrotowy) oraz prędkość, z jaką obraca się trzpień. Dzięki zmniejszeniu prędkości trzpienia do 60 obr./min stwierdziliśmy, że losowo wyrównane rusztowania wykazały większą jednorodność rusztowania w porównaniu z elektroprzędzeniem na płaskiej płycie kolektora.

Przeanalizowano charakterystykę pozbawionej komórek tkanki dróg oddechowych, aby dostarczyć wskazówek dla różnych topografii rusztowań opracowanych dla hodowli każdego typu komórek dróg oddechowych. Elektroprzędzone nanowłókna są atrakcyjnym rusztowaniem do replikowania struktur błony podstawnej ze względu na mały rozmiar porów, ale wysoką porowatość ogólną, która pozwala na zwiększoną dyfuzję metabolitów przy jednoczesnym ograniczeniu ruchu komórek. 9 Optymalizując parametry elektroprzędzenia, przetestowano szereg stężeń PET i natężeń przepływu. Najcieńsze włókna uzyskano przy użyciu roztworu PET o stężeniu 6% wag./obj ., stosowanego wcześniej przez inne grupy. Jednak wysoki poziom ściegania i brak jednorodności były stałymi problemami. Początkowe próby usunięcia perełek obejmowały dodanie kationowego środka powierzchniowo czynnego, bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB), do roztworu w celu obniżenia napięcia powierzchniowego oraz testowanie różnych źródeł PET. Dodatek środka powierzchniowo czynnego zmniejszył ilość perlienia, ale nie w pełni. Po wypróbowaniu wielu komercyjnych źródeł granulek PET, użyto butelki PET do napojów spożywczych, przecinając butelki z napojami i rozpuszczając je w roztworze rozpuszczalnika DCM:TFA. Wykorzystanie tego jako źródła PET spowodowało wzrost jednorodności włókien i zmniejszenie koralików włókien. Zwiększając nieznacznie stężenie roztworu do 8% wag./obj . i zmniejszając średnicę igły (z 18G do 23G), konsekwentnie wytwarzaliśmy wolne od wad nanowłókna o średnicy włókna około 250 nm. Rusztowania z nanowłókien przędzonych elektrycznie mogą być silnie elektrostatyczne po pobraniu z trzpienia, co utrudnia ręczną obsługę rusztowań. Udało się to poprawić dzięki przechowywaniu rusztowań w folii aluminiowej po wirowaniu i namoczeniu w 70% IMS przed użyciem. Wydaje się, że pomogło to w rozproszeniu szczątkowego ładunku elektrostatycznego pozostawionego na rusztowaniu w procesie elektroprzędzenia.

Aby zapewnić topografie podobne do indywidualnych mikrośrodowisk napotykanych przez trzy główne typy komórek dróg oddechowych w ścianie dróg oddechowych, dostosowano podstawowy protokół elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech unikalnych rusztowań dla tych typów komórek: poprzez powolne elektroprzędzenie roztworu PET o niskim stężeniu, wygenerowano losowo ułożone nanowłókna, na które komórki nabłonkowe zostały zasiane (naśladując RBM). Poprzez elektrowirowanie roztworu PET o wyższym stężeniu w szybszym tempie, wygenerowano losowo wyrównane mikrowłókna (wytwarzając bardziej porowate rusztowanie), do których wstrzyknięto fibroblasty (naśladując obszar podśluzówkowy bezpośrednio pod RBM). Poprzez elektroprzędzenie roztworu PET o niskim stężeniu na obracający się trzpień o dużej prędkości wyprodukowano nanowłókna wyrównane w poziomie, na których komórki mięśni gładkich zorientowały się w kierunku włókien, tworząc wyrównane arkusze komórek.

Zwiększone średnice włókien prowadzą do zwiększenia wielkości porów, umożliwiając większą penetrację komórek do rusztowań, a tym samym pomagają stworzyć prawdziwe środowisko 3D. Rusztowania z mikrofibry zastosowano do hodowli fibroblastów w badaniu, aby upewnić się, że komórki znajdują się na wielu płaszczyznach rusztowania. Dzięki zwiększeniu stężenia PET do 30% wag./obj. uzyskano włókna PET o średniej średnicy 2,5 μm. Włókna o większej średnicy (≈ 4 μm) wyprodukowano przy użyciu roztworu PET o stężeniu 35% wag/obj ., ale utracono jednorodność grubości rusztowania i widoczna była większa zmienność między poszczególnymi włóknami. Pory w rusztowaniu z mikrofibry były ponad 7 razy większe niż te mierzone w rusztowaniach z nanowłókien (odpowiednio 10,45 μm vs 1,43 μm), ale nadal statyczne wysiewanie komórek zapewniało ograniczoną penetrację komórkową. Udało się to poprawić dzięki dynamicznemu rozsiewaniu komórek za pomocą miksera orbitalnego, metody, która wcześniej okazała się skuteczna.

Wysoce wyrównane rusztowania z nanowłókien zostały stworzone przez elektroprzędzenie roztworu PET o stężeniu 10% wag./obj . na trzpieniu obracającym się z prędkością 2 000 obr./min (≈ 440 m·min-1). Stężenie PET zwiększono z 8%, aby zapobiec nieregularnej morfologii przypominającej falę, którą włókna wykazywały przy niższych stężeniach. Pomimo wzrostu stężenia, wyrównanie włókien zmniejszyło średnią średnicę włókna (216 nm vs. 255 nm, wyrównane vs. losowe). Duża prędkość trzpienia wyciągającego włókna przed ich wyschnięciem może powodować ten efekt. Ułożenie włókien wpłynęło na ułożenie komórek ASM, a także ma inne fizjologiczne skutki dla komórek ASM, które zostały scharakteryzowane w innym miejscu21.

Głównym ograniczeniem tego protokołu jest brak możliwości obrazowania żywych komórek na rusztowaniach / w rusztowaniach, co uniemożliwia określenie początkowego przyczepiania się lub różnicowania komórek w dłuższym okresie czasu bez poświęcania próbek. Oznacza to, że większość optymalizacji następuje po okresie hodowli; tj. utrwalanie próbek, a następnie mierzenie, czy hodowla komórkowa zakończyła się sukcesem po tym, jak nie była w trakcie hodowli komórkowej. Obserwowanie zmiany koloru w rusztowaniach inkubowanych w alamarBlue (od niebieskiego do różowego) wskazuje, że komórki są obecne i żywotne, ale nie jest idealne. Elektroprzędzenie bardziej przezroczystych polimerów, takich jak żelatyna, może pomóc w wizualizacji komórek na rusztowaniach. Elektroprzędzenie rusztowania nanowłóknistego w naszym modelu pozwoliło na replikację RBM dróg oddechowych, podobnie składających się z gęstych nanowłókien, na których znajdują się komórki nabłonkowe. Wcześniej wykazano, że komórki strukturalne nie mogą migrować przez rusztowanie z nanowłókien22, chociaż komórki odpornościowe są do tego zdolne (dane nie pokazane). Chociaż jest to korzystne dla hodowli określonych typów komórek na powierzchni 3D (takich jak komórki nabłonka i śródbłonka), to zapobieganie strukturalnej migracji komórek przez nanowłókna może być szkodliwe dla hodowli innych typów komórek. Ponieważ mięśnie gładkie nie są w stanie migrować przez wyrównane rusztowanie z nanowłókien, zmontowaliśmy trójwarstwową kokulturę z warstwami mięśni gładkich i fibroblastów zwróconymi do siebie (w przeciwieństwie do wyrównanego rusztowania oddzielającego dwa typy komórek). Chociaż pozwala to na bliskie przyleganie komórek, obecne badanie nie może stwierdzić, czy jeden typ komórek (fibroblasty lub mięśnie gładkie) wyprzedzi całą warstwę w dłuższym okresie hodowli. Pomimo tych ograniczeń opracowano realny trójwarstwowy model ściany dróg oddechowych, który stanowi alternatywną platformę do badania interakcji między tymi wieloma typami komórek. Podobne trójwarstwowe badanie zostało niedawno opublikowane, w którym fibroblasty były osadzone w cylindrycznym hydrożelu kolagenu I z mięśniami gładkimi wysianymi na zewnętrznej powierzchni i komórkami nabłonkowymi na powierzchni światła17. Stabilność mechaniczna opracowanych tu rusztowań elektroprzędzonych pozwoliłaby na formowanie podobnych konstrukcji rurowych i pozostaje aktualnym celem badawczym naszej grupy. Chociaż badanie koncentrowało się na drogach oddechowych, kilka narządów w ciele dzieli tę podstawową jednostkę strukturalną błony śluzowej, a poprzez modyfikację lokatorów wyróżnionych w tym badaniu, podobne platformy można opracować dla tkanek zawierających jednostkę błony podstawnej, w tym naczynia krwionośne, pęcherz moczowy i rogówkę, w których zastosowano wielowarstwowe modele oparte na kolagenie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania prowadzące do tych wyników AirPROM otrzymały finansowanie z Unii Europejskiej na podstawie umowy o grant nr 270194.Ta praca była również finansowana przez Narodowe Centrum Wymiany, Udoskonalania i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs) oraz Centrum Kształcenia Doktorantów (EPSRC) w Medycynie Regeneracyjnej, Wielka Brytania

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelki z politereftalanu etylenu (PET)Lucozade (GSK)Nie dotyczyŹródło PET do elektroprzędzenia. Pokroić na małe kawałki i w razie potrzeby odważyć
Dichlorometan (DCM)Rozpuszczalnik do PET
Kwas trifluorooctowy (TFA)SigmaRozpuszczalnik do PET
Trzpień obrotowyWbudowany w domuSłuży do zbierania włókien elektroprzędzonych. Obracając się z różnymi prędkościami, włókna mogą być wyrównane lub zorientowane losowo
Pompa strzykawkowaAparaturaHarvarda stosowana w procesie elektroprzędzenia
DMEM-F12Pożywka hodowlana Gibcodla komórek CALU3
DMEMGibcoPożywka hodowlana dla komórek HASM
MEMGibcoPożywka hodowlana dla komórek MRC5
Antybiotyk/antybiotyk rozwiązanieSuplement GibcoMedia
FCSSuplement GibcoMedia
Mieszalnik orbitalny (Orbital shake 503)Stuart ScientificDo dynamicznego wysiewu komórek na rusztowaniach z mikrofibry
Pompa perystaltyczna Watson MarlowZa zapewnienie przepływu mediów przez bioreaktor
Bioreaktor 3DKubeKiyatecdo hodowli komórek 3D

Bibliografia

  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  3. Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
  4. Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
  5. Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
  6. Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
  7. Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
  8. Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
  9. Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
  10. Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
  11. Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
  12. Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
  13. Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
  14. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
  15. Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
  16. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  17. Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
  18. West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
  19. Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
  20. Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
  21. Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
  22. Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014(2014).
  23. Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
  24. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
  25. Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171(2013).
  26. Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
  27. Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
  28. Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
  29. Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460(2008).
  30. Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
  31. Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
  32. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  33. Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
  34. Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
  35. Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
  36. Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
  37. Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwarstwowy rusztowaniemodel ciany dr g oddechowychroztw r polimeru PETmikrow kna o losowym u o eniurusztowanie z uporz dkowanymi nanow knamibioreaktorowy system kokulturywysiew typ w kom rekskaningowa mikroskopia elektronowakomunikacja mi dzykom rkowa
Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.