Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Podsumowanie

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Streszczenie

W tym protokole najpierw opisujemy procedurę syntezy nanocząstek UCNP domieszkowanych lantanowcami. Następnie pokazujemy, jak generować amfifilowe polimery in situ i opisujemy protokół kapsułkowania przygotowanych UCNP i różnych cząsteczek barwników organicznych (porfiryn i diaryletenów) za pomocą otoczek polimerowych w celu utworzenia stabilnych, dyspergowalnych w wodzie nanozespołów. Próbki nanozespołów zawierające zarówno UCNP, jak i barwniki organiczne diaryletenu mają interesujące właściwości fotochemiczne i fotofizyczne. Po naświetlaniu promieniowaniem UV o długości fali 365 nm grupa diaryletenów ulega wizualnej zmianie koloru. Gdy próbki są naświetlane światłem widzialnym o innej określonej długości fali, kolor blaknie, a próbki wracają do początkowego stanu bezbarwnego. Próbki emitują również światło widzialne z UCNP po naświetlaniu światłem bliskiej podczerwieni o długości fali 980 nm. Intensywność emisji próbek można dostroić poprzez naprzemienne naświetlanie promieniowaniem UV i światłem widzialnym. Modulację fluorescencji można przeprowadzać przez wiele cykli bez zauważalnej degradacji próbek. Ta wszechstronna procedura enkapsulacji pozwala na przenoszenie cząsteczek hydrofobowych i nanocząstek z rozpuszczalnika organicznego do środowiska wodnego. Polimer pomaga w utrzymaniu mikrośrodowiska podobnego do lipidowego dla cząsteczek organicznych, aby pomóc w zachowaniu ich zachowania fotochemicznego w wodzie. Dlatego metoda ta idealnie nadaje się do przygotowania dyspergowalnych w wodzie systemów fotoczułych. Zastosowanie światła bliskiej podczerwieni do aktywacji nanocząstek konwertujących w górę pozwala na wykorzystanie światła o niższej energii do aktywacji fotoreakcji zamiast bardziej szkodliwego światła ultrafioletowego.

Wprowadzenie

Dzisiaj nadal istnieje pilna potrzeba opracowania nowych typów środków do obrazowania biologicznego. Wiele nowatorskich sond fluorescencyjnych zostało dobrze udokumentowanych. ^1-6 Wyzwaniem pozostaje jednak znaczna poprawa rozdzielczości obrazu. ⁷ Jedną z praktycznych metod jest bezpośrednia modulacja sond fluorescencyjnych między "jasnym" stanem emisyjnym a "ciemnym" stanem wygaszonym. ^8-12 Ta szczególna metoda została zastosowana do opracowania takich technologii, jak mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED)¹³ i stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM). ¹⁴

Innym podejściem do modulacji fluorescencji jest połączenie chromatoforów reagujących na światło z sondami fluorescencyjnymi. ^15,16 Przełączanie chromoforu światłoczułego między dwoma izomerami, z których tylko jeden może działać jako wydajny akceptor transferu energii, umożliwia kontrolę nad wygaszaniem fluorescencji z sondy poprzez rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) i inne mechanizmy. Rezultatem jest stworzenie stanu emisyjnego i stanu wygaszonego, które mogą być zmieniane przez ekspozycję chromoforu reagującego na światło o różnych długościach fal świetlnych.

Światłoczułe chromofory diaryletenu mogą być odwracalnie przełączane między bezbarwnym izomerem otwartym pierścieniem a kolorowym izomerem zamkniętym pierścieniowo po naświetlaniu UV i światłem widzialnym. ^17-19 Stabilność termiczna dwóch izomerów i przestrajalne widma absorpcyjne izomeru zamkniętego pierścieniem sprawiają, że diaryleteny są bardzo dobrymi kandydatami na kontrolowane akceptory FRET. ^20-23 Nanocząstki NaYF₄ domieszkowane lantanowcami są przydatne do bioobrazowania. ²⁴ Nanocząstki te pochłaniają światło bliskiej podczerwieni i emitują światło w kilku obszarach widma widzialnego. Przykłady modulacji fluorescencji poprzez połączenie światłoczułych chromoforów diaryletenu i nanocząstek zostały wcześniej zgłoszone przez naszą grupę. ^25-27 Systemy opisane w każdym przykładzie wymagały jednak dodatkowej modyfikacji syntetycznej w celu przyłączenia diaryletenów do powierzchni nanocząstek, co komplikuje rozwój bardziej zróżnicowanych systemów.

Tutaj demonstrujemy prostą metodę "plug-and-play" do przygotowania dyspergowalnych w wodzie organicznych cząsteczek barwnika i fotoczułych nanocząstek konwertujących w górę za pomocą strategii samoorganizacji. Wybór polimerów; Poli(bezwodnik styrenowo-alt-maleinowy) i polieteroamina 2070 zapewniają zarówno hydrofobowe, jak i hydrofilowe środowisko. Hydrofobowe sekcje polimeru pomagają utrzymać razem normalnie nierozpuszczalne w wodzie cząsteczki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę, podczas gdy hydrofilowy obszar polimeru ma kluczowe znaczenie dla utrzymania rozpuszczalności w wodzie. Najpierw zademonstrujemy syntezę nanocząstek przekształcających się w górę metodą zarodkowania termicznego. Następnie udowodnimy, w jaki sposób cząsteczki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę są zamknięte w hydrofobowych obszarach powłoki polimerowej i pozostają stabilne w środowisku wodnym, po prostu mieszając roztwór nanocząstek przekształcających się w górę, polimeru i różnych cząsteczek barwnika organicznego, a następnie stosując wygodną procedurę obróbki. Pokazujemy również, jak modulować emisję fluorescencji zespołów za pomocą zewnętrznego naświetlania światłem. Przewidujemy, że zakres stosowania tej metody "plug-and-play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów będzie się nadal rozszerzał.

Protokół

1. Synteza nanocząstek NaYF₄/yb³⁺/er³⁺ konwertujących w górę (UCNP)

1. Ustaw urządzenie w następujący sposób:
   1. Umieść płaszcz grzewczy o pojemności 250 ml na zwykłej płycie mieszającej i podłącz płaszcz do pary termicznej.
   2. Umieścić kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml wyposażoną w mieszadło magnetyczne na płaszczu grzewczym z odpowiednim zaciskiem.
   3. Podłącz adapter powietrza do lewej szyjki kolby z okrągłym dnem i podłącz ten adapter powietrza do przewodu Schlenk za pomocą plastikowej rurki.
   4. Przymocuj szklany adapter do prawej szyjki kolby z okrągłym dnem i przymocuj adapter termometru do szklanego adaptera. Włóż sondę temperatury do kolby przez adapter termometru i podłącz ją do termopary.
   5. Przymocować głowicę destylacyjną do środkowej szyjki kolby okrągłodennej. Umieść korek na górze głowicy destylacyjnej. Podłączyć głowicę do kondensatora, a następnie do adaptera do destylacji próżniowej i kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml. Podłącz adapter do destylacji próżniowej do bełkotki za pomocą plastikowej rurki.
2. Odważyć 1,17 g (3,9 mmol) octanu itru, 0,439 g octanu iterbu i 0,0727 g (0,1 mmol) octanu erbu i umieścić je w kolbie reakcyjnej okrągłodennej.
3. Dodać 30 ml kwasu oleinowego i 75 ml oktadecenu do kolby za pomocą cylindra miarowego.
4. Przepłukać bok kolby reakcyjnej okrągłodennej przy użyciu 5 ml metanolu, aby upewnić się, że kwas oleinowy i oktadecen nie przykleiły się do ścianek kolby reakcyjnej.
5. Podłączyć kolbę reakcyjną do przewodu Schlenka z podwójnym kolektorem i przekręcić odpowiedni zawór, aby kolba reakcyjna była podłączona do przewodu azotu.
6. Włącz termoparę, ustaw temperaturę na 80 °C i stopniowo podgrzewaj system do tej temperatury. W temperaturze 80 °C i po rozpuszczeniu wszystkich materiałów wyjściowych zdjąć płaszcz grzewczy i pozostawić reakcję do ochłodzenia do temperatury 30 °C.
7. Gdy temperatura osiągnie 30 °C, zdjąć głowicę destylacyjną, przełączyć adapter powietrza z lewej szyjki na środkową szyjkę i zamknąć lewą szyjkę korkiem. Powoli wprowadzać próżnię do kolby reakcyjnej, przekręcając zawór na linii Schlenka od przewodu azotu do przewodu próżniowego. W tym momencie wszystkie składniki o niskiej temperaturze wrzenia zostaną wyciągnięte z reakcji.
8. Gdy roztwór przestanie bulgotać, podnieś temperaturę do 115 °C z prędkością 5 °C/min.
9. Gdy temperatura osiągnie 115 °C, utrzymuj tę temperaturę przez 15 minut, a następnie zdejmij płaszcz grzewczy i schładzaj reakcję do 50 °C. Następnie szybko przełącz zestaw z powrotem do pierwotnej formy, ponownie mocując głowicę destylacyjną do środkowej szyjki i adapter powietrza do lewej głowicy.
10. Podczas procesu chłodzenia odważyć 0,74 g (12,5 mmol) NaOH i 0,50 g (20,0 mmol) NH₄F i rozpuścić je w 50 ml metanolu metodą sonikacji.
11. Po sonikacji wlać roztwór do kolby reakcyjnej okrągłodennej i przepłukać boki kolby 5 ml MeOH.
12. Pozostawić roztwór mieszany w temperaturze 50 °C na 30 minut.
13. Zwiększyć temperaturę do 75 °C, aby oddestylować metanol.
14. Podczas destylacji, w razie konieczności, opróżnić kolbę zbiorczą. Po zakończeniu destylacji podgrzać reakcję do temperatury 300 °C pod ochroną azotu tak szybko, jak to możliwe.
15. Gdy temperatura osiągnie 300 °C, utrzymuj tę temperaturę przez 1 godzinę. W razie potrzeby przykryj zestaw folią aluminiową, aby utrzymać temperaturę. Następnie usuń źródło ciepła i pozwól, aby reakcja ostygła do temperatury pokojowej.
16. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej należy równomiernie podzielić roztwór na trzy probówki wirówkowe (probówki 50 ml, około 35 ml roztworu na każdą probówkę) i uzupełnić probówkę do skali 50 ml za pomocą bezwodnego etanolu. Odwirować wszystkie probówki o masie 3 400 x g przez 15 minut. Po odwirowaniu UCNP należy obserwować z boku probówek w postaci białego osadu.
17. Odrzucić supernatant i ponownie rozproszyć granulki UCNP w heksanach (7,5 ml heksanów na każdą probówkę), a następnie uzupełnić probówkę etanolem do skali 50 ml. Ponownie odwirować probówki o stężeniu 3 400 x g przez 15 min.
18. Po zakończeniu wirowania odrzucić supernatant i ponownie rozproszyć stałe UCNP w 30 ml CHCl₃ do dalszego wykorzystania.

2. Składanie dyspersyjnych w wodzie nanozespołów zawierających cząsteczki barwnika organicznego i nanocząstki przekształcające się w górę

1. Rozpuścić 25 mg (0,0147 mmol) bezwodnika poli(styrenowo-alt-maleinowego) (PSMA) w 3 ml CHCl₃ w fiolce scyntylacyjnej wyposażonej w mieszadło magnetyczne. Ta ilość jest ilością zoptymalizowaną po wielu próbach.
2. Dodać 250 μl (47 mg/ml) roztworu podstawowego chloroformu nanocząstek przekształcającego się w górę do fiolki scyntylacyjnej.
3. Zakryć fiolkę i umieścić ją na magnetycznej płytce mieszającej, a następnie mieszać roztwór w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
4. Odważyć 160 mg (0,0773 mmol) polieteroaminy 2070 i rozpuścić ją w 1 ml CHCl₃. Następnie dodać ten roztwór do fiolki scyntylacyjnej w jednej porcji za pomocą pipety. Roztwór zmieni kolor na bladożółty, co wskazuje na reakcję polieteroaminy 2070 z grupami bezwodnikowymi na PSMA.
5. Kontynuuj mieszanie roztworu przez noc w temperaturze pokojowej.
6. Odmierz odpowiednią ilość cząsteczek barwnika organicznego, a następnie wlej go do fiolki scyntylacyjnej w jednej porcji, mieszaj powstały roztwór przez 1 godzinę.
   1. W przypadku próbki TPP-NP (nanozespół zawierający powłokę polimerową, tetrafenyloporfirynę i nanocząstki konwertujące w górę) bezpośrednio dodać 1 mg tetrafenyloporfiryny do fiolki scyntylacyjnej. Dla próbki DAE-UCNP (nanozespół zawierający powłokę polimerową, cząsteczki diaryletenu i nanocząstki przekształcające w górę) ilość każdej cząsteczki diaryletenu wynosi 2 × ^10-7 mol. Dodaj dwie cząsteczki diaryletenu do roztworu reakcyjnego. Objętości dwóch cząsteczek diaryletenu wynoszą: DAE-1o (1,8 mM), 111 μl i DAE-2o (1,6 mM), 125 μl.
7. Usunąć rozpuszczalnik_{CHCl 3} pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, następnie dodać 3 ml 0,001 M wodnego roztworu NaOH (pH ≈ 11) do fiolki scyntylacyjnej, a następnie poddać sonikacji fiolkę aż do powstania mlecznej zawiesiny.
8. Umieścić fiolkę z powrotem na wyparce obrotowej i ostrożnie usunąć pozostałą część_{CHCl 3} do momentu, aż zawiesina zamieni się w klarowny roztwór.
9. Przenieść roztwór z fiolki scyntylacyjnej do dwóch stożkowych probówek wirówek o pojemności 1,5 ml, a następnie odwirować roztwór o stężeniu 20 600 x g przez 25 minut.
10. Odrzucić supernatant, a następnie dodać łącznie 3 ml dejonizowanego_H2Odo dwóch probówek (1,5 ml na probówkę), poddać probówki sonifikacji w celu ponownego rozproszenia granulek w dejonizowanym_H2O.
11. Ponownie odwirować obie probówki o stężeniu 20 600 x g przez 25 minut.
12. Odrzucić sklarowany osad, a następnie dodać łącznie 3 ml dejonizowanego_H2Odo dwóch probówek (1,5 ml na probówkę). Sonikować probówki, aby ponownie rozproszyć granulki w dejonizowanym_H2O.
13. Przefiltrować wodną próbkę dyspersji nanocząstek przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby uzyskać próbkę końcową do dalszych badań.

Wyniki

Widma absorpcyjne i widma fotoluminescencji zostały zebrane dla próbki DAE-UCNP. Widma absorpcyjne służą do porównywania nakładania się widm między zamkniętymi chromoforami diaryletenu a nanocząstkami konwertującymi w górę. Dołączono również fotografie próbek (zarówno TPP-UCNP, jak i DAE-UCNP), aby zademonstrować udaną enkapsulację cząsteczek barwnika organicznego i nanocząstek konwertujących w górę, które znajdują się w amfifilowych otoczkach polimerowych w fazie wodnej. Modulację fotochemii i fluorescencji wykazano rów...

Dyskusja

Nanocząstki syntetyzowane zgodnie z tym protokołem mają rozkład wielkości od 20 do 25 nm wyśrodkowany na około 22,5 nm. ^26,27 Można je sklasyfikować jako cząstki kuliste o strukturze sieci macierzystej α-NaYF₄ . W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. W syntezie UCNP kluczowe znaczenie ma utrzymanie temperatury i czasu ogrzewania tak precyzyjnie, jak to możliwe, aby zapewnić wąski rozkład wielkości cząstek. Jednoczesne dodanie NaOH i NH₄F wraz z dodaniem jonów lantanowców na początk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Octan itru	Sigma	326046	Hydrat octanu itru(III)
Octan iterbu	Sigma	544973	Hydrat octanu iterbu(III)
Octan erbu	Sigma	325570	Hydrat octanu erbu(III)
Kwas oleinowy	Sigma	75096	norma analityczna
Octadecen	Sigma	O806	Techniczny klasa
NaOH	Sigma	S5881	odczynnik klasy
NH4F	Odczynnik Sigma	216011	ACS
Poli(bezwodnik styrenowo-ko-maleinowy)	Sigma	442399	Średnia Mn = 1700
JeffAmine 2070	Huntsman	M-2070
Varian Carry 300	Agilent
JDSU NIR laser	Laser diodowy JSDU	L4-9897510-100M	980 nm