Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Podsumowanie

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Streszczenie

Splot naczyniówkowy znajduje się w ścianie komorowej mózgu, której główną funkcją uważa się za produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego. Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CPEC) pokrywające powierzchnię tkanki splotu naczyniówkowego zawierają wiele unikalnych rzęsek, ale większość funkcji tych rzęsek pozostaje do zbadania. Aby odkryć funkcję rzęsek CPEC ze szczególnym uwzględnieniem ich ruchliwości, opracowano system obserwacji ex vivo do monitorowania ruchliwości rzęsek w okresie embrionalnym, okołoporodowym i poporodowym. Splot naczyniówkowy wypreparowano z komory mózgowej i obserwowano pod mikroskopem kontrastowym ze wzmocnieniem wideo, wyposażonym w dyferencyjną optykę kontrastową. W tych warunkach opracowano prostą i ilościową metodę analizy profili ruchliwych rzęsek CPEC przez kilka godzin ex vivo. Następnie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej obserwowano zmiany morfologiczne rzęsek podczas ich rozwoju, aby wyjaśnić związek między dojrzałością morfologiczną rzęsek a ruchliwością. Co ciekawe, metoda ta może nakreślić zmiany w liczbie i długości rzęsek, które osiągnęły szczyt w dniu pourodzeniowym (P) 2, podczas gdy częstotliwość bicia osiągnęła maksimum w P10, po którym nastąpiło nagłe ustanie w P14. Techniki te umożliwią wyjaśnienie funkcji rzęsek w różnych tkankach. Podczas gdy podobne techniki zostały opublikowane w poprzednim raporcie¹, obecne badanie koncentruje się na szczegółowych technikach obserwacji ruchliwości i morfologii rzęsek CPEC ex vivo.

Wprowadzenie

Rzęski to przypominające włosy wypustki na powierzchni większości komórek kręgowców, które przyciągnęły uwagę badaczy medycznych ze względu na klasę chorób określanych jako ciliopatie ^2-4. Pomimo wszechobecnej ekspresji organelli odnotowano szeroką gamę funkcji rzęskowych, w tym ruchliwość i bioczujniki. Na przykład ruchliwe rzęski na powierzchni błony śluzowej transportują śluz⁵ i resztki nabłonka do ujścia przewodów, zapobiegając w ten sposób chorobie poprzez oczyszczanie powierzchni nabłonka. Ponadto we wczesnych okresach rozwojowych i stadiach embrionalnych rzęski regulują proliferację komórek macierzystych⁶ i biorą udział w określaniu asymetrii lewo-prawej strony ciała kręgowców⁷.

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CPECs) są pochodnymi komórek neuroepitelialnych, które pokrywają powierzchnię tkanki splotu naczyniówkowego w mózgu, które odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy środowiska wewnątrzczaszkowego poprzez produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Wcześniej wykazano, że CPEC mają wiele nieruchliwych rzęsek, które regulują produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez receptory sprzężone z białkiem G, które są specyficznie skoncentrowane na rzęskach⁸. Chociaż rzęski te były uważane za spokojne rzęski nieruchome, odkryto, że niektóre rzęski CPEC wykazują przejściową ruchliwość w okresie noworodkowym¹. Odkrycie to było dość ważne, ponieważ ujawniło, że tak zwane rzęski nieruchome niekoniecznie są nieruchome od początku rozwoju i mogą wykazywać przejściową ruchliwość w określonych oknach czasowych, prawdopodobnie w odpowiedzi na określone wymagania i funkcje fizjologiczne⁹. Aby precyzyjnie opisać ruchliwą naturę rzęsek CPEC, konieczne jest opracowanie systemu obserwacji ex vivo, który obejmuje analizę profili kinetycznych unikalnych dla rzęsek CPEC.

Jeśli chodzi o ruchliwość, chociaż kilka raportów technicznych opisywało obserwacje ruchliwych rzęsek nabłonka tchawicy^5,10, ruchliwych jednokomórkowych wici¹¹, tak zwanych konwencjonalnych rzęsek ruchliwych¹² i rzęsek węzłowych¹³, szczegółowe metody analityczne mające zastosowanie do stosunkowo pofałdowanych struktur, takich jak splot naczyniówkowy, nie zostały do tej pory dobrze udokumentowane. Co więcej, do analizy ruchu rzęsek CPEC wymagana jest wysoka rozdzielczość czasowa, w której niezbędne są drogie kamery szybkoobrotowe. Aby obejść tę konieczność i uprościć monitorowanie ruchliwości rzęsek różnych typów komórek, wprowadzono tanią, szybką kamerę oraz opracowano łatwo dostępną i wygodną metodę rejestrowania ruchliwości rzęsek, zwłaszcza w celu opisania prędkości i wzorca ruchu każdej rzęski¹. Ponadto zastosowano tu autorskie oprogramowanie do analizy obrazu "TI Workbench", które ułatwia szczegółową analizę ruchliwości. Podsumowując, metoda ta zapewnia nową, zwięzłą strategię analizy ruchu rzęsek wraz z korelacyjną skaningową mikroskopią elektronową (SEM), która może być zastosowana w szerokim zakresie badań rzęsek.

Protokół

Protokoły i wykorzystanie zwierząt doświadczalnych zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Yamanashi i Uniwersytecie Waseda. Opieka nad zwierzętami odbywała się zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Przygotowanie do CPEC

1. Przygotuj następujące aparaty i materiały: mikroskop stereoskopowy, najlepiej zdolny do przekazywania światła od dołu; parę kleszczyków zegarmistrzowskich (Dumont #3 lub #4), sterylizowane płomieniem, proste nożyczki do sterylizacji płomieniowej; dwie sterylne 10 cm plastikowe naczynia zawierające 20 ml lodowatego podłoża Leibovitz L-15; naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające 2 ml pożywki RT Leibovitz L-15; zlewkę o pojemności 100 ml zawierającą 70% etanolu; nowonarodzone młode myszy.
2. Zanurz na krótko nowonarodzoną mysz w 70% etanolu i szybko poddaj eutanazji przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek operacyjnych.
3. Natychmiast umieść głowę w lodowatym podłożu Leibovitz L-15 w sterylnym naczyniu o średnicy 10 cm.
4. Usuń skórę z kalwarii za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich, rozetnij czaszkę, aby odsłonić mózg, a następnie przetnij nerwy czaszkowe, aby odizolować cały mózg.
5. Przenieś mózg do nowego naczynia zawierającego lodowatą pożywkę Leibovitz L-15 i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym, upewniając się, że mózg jest całkowicie zanurzony w pożywce.
6. Ustaw grzbietową część mózgu skierowaną do góry i ustaw mózg tak, aby opuszki węchowe znajdowały się w pozycji godziny trzeciej (dla osób praworęcznych). Chwyć delikatnie mózg kleszczami w lewej ręce.
7. Za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych (Dumont #3 lub #4) w prawej ręce, przeciąć ciało modzelowate i pod spodem miąższ łączący półkule mózgowe, wzdłuż podłużnej szczeliny mózgu.
8. Delikatnie odepchnij półkule mózgowe na boki i odsłoń poprzeczną szczelinę mózgowia.
9. Oddziel półkule, ściskając miąższ między półkulą a wzgórzem.
10. Delikatnie wyciągnij boczny splot naczyniówkowy komory, który jest przymocowany do bocznej strony hipokampa za pomocą blaszki afiksa.
11. Przenieść izolowany splot naczyniówkowy do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierającego świeżą pożywkę Leibovitz L-15 i delikatnie nałożyć na nią ciężarek (Wykaz materiałów), aby utrzymać tkankę na miejscu.

2. Obrazowanie na żywo rzęsek CPEC

1. Upewnij się, że filtry odcinające w ultrafiolecie (UV) i wywnioskowanym (IR) są prawidłowe w celu zablokowania światła krótszego niż 400 nm i dłuższego niż 700 nm oraz że filtry o neutralnej gęstości (ND) (25% i 6%) są umieszczone na ścieżce światła mikroskopu odwróconego.
2. Wyreguluj ostrość soczewki obiektywu mniej więcej na oko, a następnie wyreguluj kondensor tak, aby środek i ostrość były zgodne z oświetleniem Köhlera. Włóż odpowiedni pryzmat różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), element DIC, a także elementy analizatora i polaryzatora w ścieżce światła, aby zachować zgodność z optyką DIC.
3. Dostosuj kontrast widoku przez położenie pryzmatu DIC, aby struktura powierzchni tkanki była jak najbardziej rozpoznawalna. Jeśli wszystkie rzęski komórek docelowych są ruchliwe, nie można uzyskać wyraźnego obrazu ruchliwych rzęsek na oko ze względu na ich ruch.
4. Zmień ścieżkę światła do kamery wideo i usuń filtry ND, aby zwiększyć moc światła.
5. Użyj aparatu w trybie ustawiania ostrości, aby dostosować pole view i ostrość. Podczas ustawiania ostrości, w którym obrazy wideo są wyświetlane w czasie rzeczywistym na monitorze, wyraźny widok ruchliwych rzęsek nie jest dostępny.
6. Używaj aparatu przy 200 Hz z czasem naświetlania 0.1 ms przez żądany okres (sekundy do minut). Po pozyskaniu stosu obrazów, pojedyncze klatki będą wyświetlać wyraźne struktury rzęskowe. Jeśli krawędzie rzęsek są rozmyte, zwiększ liczbę klatek na sekundę lub użyj krótszego czasu ekspozycji.
7. Rejestruj ruch rzęsek CPEC w ciągu 25–60 minut po eutanazji w pożywce Leibovitz L-15.

3. Analiza ruchu rzęsek

1. Ręcznie śledź wzorce dudnienia każdej rzęski na monitorze komputera. Zaznacz pozycje końcówek rzęsek w każdej ramce za pomocą wskaźnika myszy, który jest zmontowany w celu uzyskania informacji o trajektorii każdej rzęski. Albo przeanalizuj informacje o trajektorii za pomocą tego samego oprogramowania, albo wyeksportuj je do innych, bardziej ogólnych aplikacji w celu dalszej analizy. Skuteczność tego etapu analizy została opisana w Dyskusji.
2. Sklasyfikuj trajektorie na dwa tryby ruchu, w przód iw tył lub obrotowy, na oko.
3. Oblicz częstotliwość dudnienia rzęsek (CBF) za pomocą następującego wzoru: [CBF = (liczba klatek na sekundę)/(średnia liczba klatek na jedno uderzenie)]¹⁴, którą można uzyskać z diagramu ruchu końcówki rzęski (rysunek 3). Powtórz to obliczenie dla wielu cykli dudnienia rzęsek, ponieważ inne rzęski na tej samej komórce mogą zakłócać ruch każdej rzęski, powodując nieregularność.
4. Aby przeanalizować jednorodność kątową osi dudnienia rzęsek w pojedynczej komórce, zdefiniuj kąt dudnienia θ dla każdej trajektorii (ryc. 4). W przypadku trajektorii tam iz powrotem dopasuj położenie końcówki rzęsek do linii prostej i zdefiniuj θ jako kąt, jaki tworzy linia z osią x. W przypadku trajektorii obrotowych dopasuj pozycje do elipsy i zdefiniuj θ jako kąt, pod jakim oś główna elipsy tworzy się z osią x. Szczegóły dotyczące dopasowania są opisane w sekcji Reprezentatywne wyniki.
5. Aby uzyskać ilościowy opis każdej trajektorii, oblicz uogólniony współczynnik kształtu AR. Krótko mówiąc, obróć trajektorię o -θ i zdefiniuj AR jako stosunek szerokości rozkładu wzdłuż osi x i y (rysunek 4B). Szczegóły są przedstawione w sekcji Reprezentatywne wyniki, a interpretacja, znaczenie i ograniczenie parametru są opisane w Dyskusji.

4. Przygotowanie próbki do SEM

Uwaga: SEM jest ważną metodą oceny stanu rzęsek na CPEC w kompleksowy sposób. Do przygotowania próbek do SEM stosuje się standardową procedurę opisaną wcześniej¹⁵ z niewielkimi modyfikacjami.

1. Przed wycięciem tkanki z mózgu należy przygotować utrwalacz w szklanej fiolce o pojemności 5 ml z polietylenową nakrętką. Utrwalacz składa się z 2% paraformaldehydu, 2,5% aldehydu glutarowego (połowa roztworu Karnovsky'ego¹⁶) w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4.
2. Wypreparuj tkankę z mózgu, jak opisano w kroku 1.
3. Krótko przepłucz wyizolowaną tkankę zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) w nowym naczyniu, a następnie utrwal tkankę w utrwalaczu w szklanej fiolce na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Używaj jednorazowych pipet transferowych i delikatnie obchodź się z próbkami. Po spłukaniu w HBSS tkanka staje się lepka.
   1. Aby przenieść próbki do roztworu utrwalającego, należy powoli usunąć niewielką ilość roztworu zawierającego tkankę z pipety transferowej w postaci kropelki i dodać do utrwalacza.
4. Po utrwaleniu wyrzucić utrwalacz i trzykrotnie przepłukać tkankę buforem fosforanowym.
5. Zanurz tkankę w 10% roztworze sacharozy, aby wypłukać pozostałe aldehydy. Aby zapewnić całkowitą eliminację aldehydów, zanurz próbki w roztworze na 10 minut, a następnie powtórz dwukrotnie ze świeżą 10% sacharozą. Ten krok jest ważny, aby osiągnąć prawidłowe utrwalenie w kolejnych krokach.
6. Zanurz tkankę w roztworze 1% tetratlenku osmu w buforze fosforanowym na 30 minut, a następnie umieść na lodzie w celu utrwalenia. Oceń stopień osmizacji na podstawie koloru próbki: gdy aldehydy zostaną całkowicie usunięte, próbka jest.
7. Kilkakrotnie dokładnie przemyć próbki tkanek po utrwaleniu wodą podwójnie destylowaną.
8. Odwodnić próbki przez zanurzenie w stopniowanych stężeniach etanolu, zwykle 65%, 75%, 85%, 95%, 99% i 100%, przez 10 minut każda. Otrzymaj bezwodny etanol, umieszczając sita molekularne w 99,5% etanolu z nowo zakupionej butelki. Powtórz odwodnienie bezwodnym etanolem trzy razy.
9. Odwodnione próbki należy umieścić w octanie izoamylu, odczynniku podstawienia do suszenia w punkcie krytycznym, na 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie. Odczynnik ten szybko odparowuje, a próbka może stać się sucha, co powoduje zniszczenie przez napięcie powierzchniowe. Dlatego nie należy całkowicie suszyć próbki.
10. Po ostatecznej wymianie octanu izoamylu należy usunąć większość rozpuszczalnika, natychmiast owinąć otwartą szklaną fiolkę folią aluminiową i umieścić fiolkę na suchym lodzie. Za pomocą igły lub cienkich kleszczyków należy wykonać kilka otworów w folii zakrywającej otwór fiolki, tak aby ciekły dwutlenek węgla łatwo spływał do fiolki w suszarce w punkcie krytycznym. Przejdź do następnego kroku tak szybko, jak to możliwe.
11. Na tym etapie należy zminimalizować przenoszenie octanu izoamylu do komory osuszacza, ale nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia próbki przed wysuszeniem w punkcie krytycznym. Ponadto nie należy pozostawiać próbki na suchym lodzie przez niepotrzebnie długi czas, aby uniknąć tworzenia się szronu na fiolce.
12. Szklane fiolki owinięte folią zawierające próbki tkanek należy przenieść do suszarki w punkcie krytycznym, która zapewnia, że struktura powierzchniowa tkanki pozostaje nienaruszona, jednocześnie usuwając wodę zawartą w tkance. Szczegółowe informacje na temat obsługi osuszacza punktu krytycznego można uzyskać w instrukcji producenta.
13. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie za pomocą wykałaczki, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne. Powstałe w ten sposób wysuszone próbki tkanek są delikatne. Zamontuj próbki na metalowych klockach i pokryj złotem-palladem za pomocą rozpylania jonowego.

5. Obserwacja przez SEM

1. Obserwuj za pomocą SEM i rejestruj obrazy za pomocą kamery cyfrowej wyposażonej w skaningowy mikroskop elektronowy.
2. Przesyłaj cyfrowe dane obrazu do komputera w celu analizy.

Wyniki

Przegląd przepływu pracy jest pokazany na rysunku 1, łącznie ze zdjęciami urządzeń.

Obserwacje ruchu na żywo CPEC

Film 1 pokazuje film przedstawiający CPEC wyizolowane z myszy okołoporodowej, a Film 2 pokazuje rozszerzony widok obrazów z filmu 1. Należy zauważyć, że poszczególne końcówki rzęsek są mniej wyraźne na nieruchomych obrazach w porównaniu z tymi na filmach. Rysunek 2 przed...

Dyskusja

Perspektywy tej metody

Chociaż opisana tutaj technika nie zapewnia bardziej szczegółowej analizy rzęsek niż wcześniej opublikowane metody, znaczenie tej techniki polega na prostocie systemu i efektywności kosztowej, które można łatwo zastosować do badań przesiewowych każdego rodzaju ruchliwości rzęsek ex vivo. W szczególności TI Workbench zapewnia prosty i przyjazny dla użytkownika interfejs, który umożliwia badaczom łatwiejszą obserwację i analizę ruchliwości rzęsek. Nie opracowano s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wymagane odczynniki
do obrazowania żywych komórek
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
do przygotowania SEM
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Zrównoważony roztwór soli Hanka	Life Technologies	14170112
paraformaldehyd	Merck	1040051000
aldehyd glutarowy	Nacalai tesque	17003-05
octan izoamylu	Nacalai tesque	02710-95
Sita molekularne 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	do przygotowania bezwodnego
buforu fosforanowego etanolu soli fizjologicznej (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
bufor fosforanowy, 0,1 M			Aby przygotować 100 ml, wymieszaj 19,0 ml 0,1  M NaH2PO4 i 81,0 ml 0,1  M Na2HPO4
monosodium fosforan (dwuwodny)	Nacalai tesque	31718-15
fosforan disodowy (bezwodny)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
tetratlenek osmu	Nisshin EM	300
suchy lód
[nagłówek]
Narzędzia i materiały do sekcji
zarówno do obrazowania na żywo, jak i przygotowania SEM
stereoskop	Olympus	SZX7
płaski ręcznik
Φ Naczynie
cm Zlewka
Nożyczki proste	Sansyo	S-2B
	Dumont	No.DU-3 lub -4, INOX
do obrazowania żywych komórek
szklane naczynie dolne	Matsunami Glass	D110300
do przygotowania SEM
alminum flainka
szklana 5 ml z polietylenowym nasadką	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
pipeta transferowa	Samco	Scientific SM251-1S	do transportu próbek
Wykałaczka			do przenoszenia próbek
Napylanie jonowe ze złotem i palladem	Hitachi	Suszarka punktu krytycznego E-1030
	Hitachi	HCP-2
[header]
Mikroskopijny sprzęt i materiały
do obrazowania żywych komórek
mikroskop odwrócony	Olympus	IX81
100 W obudowa i zasilacz z bryłami rtęci	Olympus	Lampa rtęciowa U-ULH i BH2-RFL-T3
100 W		Kondensator Ushio
DIC, nie dotyczy 0,55	Olympus	IX-LWUCD
	Associates	VS35S22M1R3-24 i VMM-D1	.
filtr pasmowo-przepustowy (400-700  nm, Φ 45  mm)	Filtr ND Koshin Kagaku	C10-110621-1
(Φ 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	kombinacja filtrów 25% i 6% ND to soczewka
obiektywu (zanurzenie w wodzie) z elementem DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 z szybką kamerą wideo IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ Częstotliwość odświeżania 200 Hz i czas naświetlania 1 ms
oprogramowanie do akwizycji / analizy obrazu	domu, oprogramowanie	TI Workbench	zdolne do akwizycji z dużą liczbą klatek na sekundę.
Komputer do sterowania / analizy kamery	Stół	Mac Pro
	Meiritsu Seiki	AD0806
waga do tkanek	Zestawy kotew krojonych	Warner Instruments	Może być wykonany z nylonowej siatki przyklejonej do zgniecionego w kształcie litery U i Phi; 0,5  mm drut platynowy.
Szkło nakrywkowe (alternatywna waga dla chusteczek)	Matsunami	na zamówienie	Szkło nakrywkowe może być używane jako odważnik do chusteczek.
dla SEM
inverted mikroskop	Olympus	IX81
	JEOL	JSM-6510