Połączony trening w skrzynce wahadłowej z rejestracją i stymulacją kory elektrofizjologicznej jako narzędziem do badania percepcji i uczenia się

Podsumowanie

Nauka unikania shuttle-boxów jest dobrze ugruntowana w neuronauce behawioralnej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uczenie się w pudełku wahadłowym u gryzoni można połączyć z specyficzną dla miejsca elektryczną mikrostymulacją wewnątrzkorową (ICMS) i jednoczesnymi przewlekłymi zapisami in vivo jako narzędzie do badania wielu aspektów uczenia się i percepcji.

Streszczenie

Nauka unikania pudełek wahadłowych jest dobrze znaną metodą w neuronauce behawioralnej, a eksperymentalne konfiguracje były tradycyjnie wykonywane na zamówienie; niezbędny sprzęt jest teraz dostępny w kilku firmach komercyjnych. Protokół ten zawiera szczegółowy opis paradygmatu uczenia się unikania dwukierunkowych skrzynek wahadłowych u gryzoni (tutaj myszoskoczki mongolskie; Meriones unguiculatus) w połączeniu z miejscową elektryczną mikrostymulacją wewnątrzkorową (ICMS) i jednoczesnymi przewlekłymi zapisami elektrofizjologicznymi in vivo. Szczegółowy protokół ma zastosowanie do badania wielu aspektów uczenia się, zachowania i percepcji u różnych gatunków gryzoni.

Specyficzny dla miejsca ICMS obwodów kory słuchowej jako bodźce warunkowe jest tutaj używany jako narzędzie do testowania percepcyjnej trafności konkretnych połączeń aferentnych, odprowadzających i wewnątrzkorowych. Wyraźne wzorce aktywacji mogą być wywołane przez zastosowanie różnych układów elektrod stymulacyjnych dla lokalnych, zależnych od warstwy ICMS lub odległych miejsc ICMS. Wykorzystując analizę wykrywania sygnałów behawioralnych, można określić, która strategia stymulacji jest najskuteczniejsza w wywoływaniu behawioralnie wykrywalnego i istotnego sygnału. Co więcej, równoległe wielokanałowe nagrania wykorzystujące różne konstrukcje elektrod (elektrody powierzchniowe, elektrody głębokościowe itp.) pozwalają na badanie neuronalnych obserwabli w czasie trwania takich procesów uczenia się. Omówione zostanie, w jaki sposób zmiany w projekcie behawioralnym mogą zwiększyć złożoność poznawczą (np. wykrywanie, dyskryminacja, uczenie się odwrócone).

Wprowadzenie

Podstawowym celem neuronauki behawioralnej jest ustanowienie konkretnych powiązań między strukturalnymi i funkcjonalnymi właściwościami neuronów, uczeniem się i percepcją. Aktywność neuronalna związana z percepcją i uczeniem się może być badana poprzez elektrofizjologiczny zapis potencjałów czynnościowych i lokalnych potencjałów pola w różnych strukturach mózgu w wielu miejscach. Podczas gdy zapisy elektrofizjologiczne dostarczają skorelowanych powiązań między aktywnością neuronalną a zachowaniem, bezpośrednia elektryczna mikrostymulacja wewnątrzkorowa (ICMS) od ponad wieku jest najbardziej bezpośrednią metodą badania związków przyczynowych pobudzonych populacji neuronów oraz ich skutków behawioralnych i percepcyjnych ^1-3. Wiele badań wykazało, że zwierzęta są w stanie wykorzystać różne przestrzenne i czasowe właściwości bodźców elektrycznych w zadaniach percepcyjnych, w zależności od miejsca stymulacji w np. regionach retinotopowych⁴, tonotopowych⁵ lub somatotopowych⁶ w korze mózgowej. Propagacja elektrycznie wywołanej aktywności w korze mózgowej jest zdeterminowana głównie przez układ włókien aksonalnych i ich rozproszoną łączność synaptyczną², która w korze jest wyraźnie zależna od warstwy⁷. Wynikowa aktywacja polisynaptyczna wywołana przez ICMS jest odtąd znacznie bardziej rozpowszechniona niż bezpośrednie efekty pola elektrycznego^2,8,9. To wyjaśnia, dlaczego progi efektów percepcyjnych wywoływanych przez mikrostymulację wewnątrzkorową mogą być silnie zależne od warstwy^8,10,11 i zależne od miejsca⁹. Niedawne badanie wykazało szczegółowo, że stymulacja górnych warstw powodowała szerszą aktywację obwodów korowo-korowych głównie w warstwach nadziarnistych, podczas gdy stymulacja głębszych warstw kory powodowała ogniskową, nawracającą korowo-odprowadzającą aktywację wewnątrzkolumnową. Równoległe eksperymenty behawioralne wykazały, że ten ostatni ma znacznie niższe progi wykrywania percepcyjnego⁸. W związku z tym wykorzystano przewagę specyficznych dla miejsca ICMS jako bodźców warunkowych w połączeniu z zapisami elektrofizjologicznymi, aby przyczynowo powiązać określone aktywacje obwodów korowych⁸ z behawioralnymi pomiarami uczenia się i percepcji w loży.

Paradygmat dwukierunkowej skrzynki wahadłowej jest dobrze znanym urządzeniem laboratoryjnym do badania uczenia się unikania¹². Skrzynka wahadłowa składa się z 2 przedziałów oddzielonych płotkiem lub drzwiami. Po bodźcu warunkowym (CS), który jest reprezentowany przez odpowiedni sygnał, taki jak światło lub dźwięk, następuje warunkowo bodziec awersyjny bezwarunkowy (US), jak na przykład uderzenie stopy o podłogę z metalowej siatki. Badani mogą nauczyć się unikać Stanów Zjednoczonych poprzez przemieszczanie się z jednego przedziału wahadłowca do drugiego w odpowiedzi na CS. Uczenie się w skrzynce wahadłowej obejmuje sekwencję rozróżnialnych faz uczenia się^13,14: Po pierwsze, badani uczą się przewidywać Stany Zjednoczone z CS poprzez warunkowanie klasyczne i uciekać z USA poprzez warunkowanie instrumentalne, ponieważ Stany Zjednoczone są przerywane po przeniesieniu. W następnej fazie, badani uczą się całkowicie unikać Stanów Zjednoczonych poprzez przemieszczanie się w odpowiedzi na CS przed wystąpieniem USA (reakcja unikania). Ogólnie rzecz biorąc, uczenie się w skrzynce wahadłowej obejmuje warunkowanie klasyczne, warunkowanie instrumentalne, a także zachowanie ukierunkowane na cel, w zależności od fazy^{uczenia się 14}.

Procedura shuttle-box może być łatwo skonfigurowana i zazwyczaj zapewnia solidne zachowanie po kilku codziennych sesjach treningowych^15-17. Oprócz prostego warunkowania unikania (wykrywania), shuttle-box może być dalej wykorzystywany do badania dyskryminacji bodźców poprzez zastosowanie paradygmatów go/nogo. Tutaj zwierzęta są szkolone, aby unikać USA poprzez reakcję warunkową (CR) (zachowanie go; przemieszczanie się do przeciwległego przedziału) w odpowiedzi na bodziec go (CS+) i zachowanie nogo (pozostawanie w obecnym przedziale; brak CR) w odpowiedzi na bodziec nogo (CS-). Równoległa mikrostymulacja i rejestracja aktywności neuronalnej za pomocą układów wieloelektrodowych o dużej gęstości pozwala na badanie mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw skutecznego uczenia się. Omówionych zostanie kilka szczegółów technicznych, które mają fundamentalne znaczenie dla udanego połączenia treningu w loży, ICMS i elektrofizjologii równoległej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przedstawione w tej pracy zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi przez niemiecką ustawę o ochronie zwierząt doświadczalnych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyczną kraju związkowego Saksonia-Anhalt.

1. Wykonane na zamówienie wielokanałowe matryce elektrod do mikrostymulacji i nagrywania

1. Matryca mikrostymulacji na zamówienie
   1. Do dostarczania ICMS należy przygotować elektrody stymulacyjne w pożądanym układzie przestrzennym (tutaj boczny układ 2 kanałów) za pomocą drutów ze stali nierdzewnej izolowanych teflonem o długości 3 cm (Ø z izolacją = 50 μm). Zobacz rysunek 2.
   2. Zaciśnij jeden koniec przewodów do męskiego systemu pinów (raster 1.25 mm).
   3. W przypadku układu 2-kanałowego z odległością elektrod ~0,5 mm lub ~0,7 mm przewody przechodzą prostopadle przez dwie pionowo ustawione siatki uchwytów obiektów mikroskopii elektronowej (odległość siatek ~5 mm) prowadząc przewody (raster 0,1654 mm).
   4. Sklej druty razem z małą kroplą akrylu dentystycznego około 4 mm powyżej końcówek drutów, które ostatecznie służą jako końcówki elektrod.
   5. Włóż męskie piny do obudowy wtyczki.
   6. Umieść elektrodę w naczyniu z roztworem elektrolitycznym (np. 0,9% chlorku sodu) i zmierz impedancję każdego kanału za pomocą odpowiedniego urządzenia do pomiaru impedancji (np. modułu kondycjonowania impedancji FHC). Dążyć do impedancji w zakresie od 100 do 500 kΩ.
      1. Jeśli impedancja jest zbyt wysoka, dostarcz krótki prąd elektryczny (1 s, 1 mA) przez kanały, aby ją obniżyć. Sprawdź ponownie impedancję.
2. Wykonane na zamówienie wielokanałowe tablice nagrań w wysokiej rozdzielczości
   Uwaga: niniejszy protokół opisuje wytwarzanie matryc powierzchniowych do rejestracji danych z elektrokortykogramu (ECoG). Projekty mogą być jednak dostosowane do wymagań danego pytania badawczego (nagrania głębi itp.). Matryce wielokanałowe o wysokiej rozdzielczości zbudowane są z drutów ze stali nierdzewnej w izolacji teflonowej (Ø z izolacją = 50 μm) zaciśniętych na męskim układzie pinów (raster 1,25 mm).
   1. W przypadku układów elektrod powierzchniowych należy przeprowadzić 18 przewodów przez matrycę 3 x 6 składającą się z dwóch przygotowanych siatek uchwytów do mikroskopii elektronowej.
   2. Osadź układ przewodów 6 x 3 między siatkami za pomocą akrylu dentystycznego i umieść kołki w obudowie wtyczki.
   3. Zmiel akryl dentystyczny w prostokątny blok za pomocą szlifierki dołączonej do ręcznej wiertarki.
   4. Sprawdzić, czy impedancja wszystkich kanałów (patrz 1.1.6) mieści się w zakresie 100 – 500 kΩ.
   5. Przed implantacją (patrz krok 2) należy przeszlifować powierzchnię matryc, aby dopasować ją do wypukłości powierzchni korowej.

2. Chirurgiczne wszczepienie matryc do kory słuchowej u znieczulonych mongolskich zioskoczków do przewlekłego stosowania

1. Posiadać oficjalną zgodę na wykonanie wszystkich niezbędnych etapów eksperymentalnych, które są zaplanowane. Nosić odpowiednią odzież ochronną (płaszcz, sterylne rękawiczki, maska chirurgiczna, kaptur).
2. Używaj dorosłych samców myszoskoczków mongolskich (Meriones unguiculatus) lub innych gatunków gryzoni. Nosić rękawice ochronne i płaszcz i zawsze używać wysterylizowanych i dobrze zidentyfikowanych narzędzi chirurgicznych.
3. W przypadku myszoskoczków znieczulenie zwierząt poprzez wstrzyknięcie dożylnie mieszaniny ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) rozcieńczonej w 0,9% sterylnym roztworze chlorku sodu. Utrzymać w infuzji 0,6 ml/godz./kg mieszaniny składającej się z ketaminy:ksylazyny:chlorku sodu (0,9%) w stosunku 9:1:10.
4. Umieść zwierzę na płycie grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C za pomocą systemu sprzężenia zwrotnego sondy doodbytniczej (np. World Precision Instruments).
5. Golenie futra pokrywającego kości międzypotyliczne, ciemieniowe i skroniowe. Aseptycznie przygotuj miejsce nacięcia skutecznym środkiem dezynfekującym (np. naprzemiennie Betadine lub Nolvasan i 70% peelingi alkoholowe 3 razy). Chroń oczy przed wysuszeniem maścią do oczu.
6. Przeciąć skórę czaszki pokrywającą kości międzypotyliczne, ciemieniowe i czołowe za pomocą skalpela i usunąć okostną, delikatnie przesuwając wiertło po powierzchni kości.
7. Wywierć małe otwory w przeciwległej kości ciemieniowej i czołowej tak bocznie, jak to możliwe, aby nie utrudniać późniejszego montażu głowy. Teraz mocno wkręć w otwory dwie kościane o średnicy około 1 mm. Upewnij się, że śruba ciemieniowa ma dobry kontakt z oponą twardą, ponieważ będzie używana jako wspólne odniesienie i masa, a także elektroda powrotna do późniejszej stymulacji elektrycznej.
8. Przyklej mały aluminiowy pręt przyśrodkowo do kości czołowych i użyj go jako mocowania głowy podczas implantacji przez uchwyt na głowę.
9. Usuń skórę pokrywającą mięsień skroniowy z jednej strony za pomocą nożyczek.
10. Odetnij grzbietową część mięśnia skroniowego, aby uzyskać dostęp do kości skroniowej.
11. Odsłonić korę słuchową przez kraniotomię (~3 mm x 4 mm) kości skroniowej za pomocą wiertła dentystycznego. Zidentyfikuj lokalizację kory słuchowej na podstawie typowej sygnatury krew-mózg-naczynie^18,19.
12. Ostrożnie wykonaj nacięcie opony twardej mikroskalpelem w miejscu, w którym elektroda stymulacyjna jest wszczepiona w mózg. Delikatnie przesuwaj po powierzchni, aż opona twarda pęknie, aby zapobiec uszkodzeniu leżącego pod spodem neuropilu.
13. Włóż matrycę stymulacji pod kontrolą mikromanipulatora. Wybierz styczny kąt wprowadzenia, aby umożliwić umieszczenie matrycy zewnątrzoponowej nad obszarem zainteresowania. W zależności od kąta i pozycji wprowadzenia oraz docelowego miejsca stymulacji, dokładnie rozważ głębokość wprowadzenia.
14. Umieścić matrycę zapisu powierzchni zewnątrzoponowej z dobrym kontaktem z powierzchnią mózgu pokrywającą obszar zainteresowania (w tym przypadku korę słuchową) za pomocą drugiego mikromanipulatora. Zwróć uwagę, aby tablica pasowała do krzywizny kory mózgowej, aby nie wciskać opony twardej.
15. Przymocuj obie matryce elektrod i ich obudowy zatyczek za pomocą akrylu dentystycznego do czaszki.
16. Przykryj odsłoniętą powierzchnię kory antyseptycznym lubrykantem (np. KY-Jelly) i zamknij kraniotomię akrylowym zębem (np. Paladur, Heraeus Ulzer). Należy pamiętać, że polimeryzacja może wytwarzać ciepło. Między neuropilem a akrylem dentystycznym należy użyć wystarczającej ilości smaru, aby zapobiec kontaktowi akrylu dentystycznego z powierzchnią kory zębowej, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.
17. Teraz pozwól zwierzętom dojść do siebie przed rozpoczęciem jakiejkolwiek dalszej procedury. Czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od gatunku (np. myszoskoczki: ≥3 dni, myszy: ≥7 dni). Należy uważnie monitorować stan zwierzęcia i w razie potrzeby podać mu leczenie przeciwbólowe w kolejnych dniach (np. meloksykam; 1 mg/kg mc. po operacji i 24 godziny po zabiegu).

3. Dwukierunkowe konstrukcje wahadłowców wykorzystujące ICMS jako bodziec warunkowany

1. Trening z wózkiem wahadłowym
   1. Umieść shuttle-box (zbudowany na zamówienie lub dowolny produkt komercyjny, np. E10–E15, Coulbourn Instruments) w komorze ekranowanej akustycznie i elektrycznie. Pudełko zawiera dwie przegrody oddzielone płotkiem. Weź pod uwagę wysokość przeszkody, ponieważ wpływa ona na stronniczość behawioralną odpowiedzi go. Stosuj odpowiednie wysokości dla konkretnych gatunków (np. ~2 cm dla myszy, ~3 cm dla myszoskoczków).
   2. Aby zastosować amortyzator nożny (US), należy użyć podłogi z siatką z odległością między prętami odpowiednią dla badanego gatunku^12,15. Zawsze uważaj, aby nic nie skracało elektrycznie poszczególnych prętów (kał, włosy, krem elektrodowy).
   3. Po upływie znacznego czasu rekonwalescencji zwierzęcia (patrz 2.17), należy podłączyć badanego do do nagrywania i stymulacji, najlepiej bez stosowania znieczulenia krótkotrwałego. Spróbuj przykryć zwierzę ręcznikiem i delikatnie weź zwierzę w ręce. Drugą ręką odsłoń głowę i złącza zwierzęcia i podłącz.
   4. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się do komory treningowej na 3 minuty przed rozpoczęciem każdej sesji.
   5. Na sesję treningową (1 - 2 dziennie) zastosuj od 30 do 90 prób. Korzystaj z okresów trwania prób do 15 sekund i interwałów między próbami, które zmieniają się losowo w zakresie od 25 do 30 sekund.
   6. Do dostarczania ICMS do stymulacji kondycjonowanej do elektrod stymulacyjnych należy użyć stymulatora wielokanałowego (np. MCS STG2000). Aby uzyskać efekty behawioralne bez uszkadzania tkanki mózgowej, należy zastosować ciągi impulsów (np. 300 ms długości, 100 pps) dwufazowych, zrównoważonych ładunkiem impulsów (najpierw katodowych) o czasie trwania fazy 200 μs. Powtarzanie pociągów z przerwą 700 ms przez 4 sekundy (okno obserwacyjne).
   7. Do prezentacji dźwiękowych CS użyj karty PCI z wyjściem analogowym (np. NI PCI-6733). Zaprogramuj te urządzenia za pomocą Matlaba, aby elastycznie sterować i sprzętowo uruchamiać system shuttle-box za pośrednictwem cyfrowych linii wyjściowych.
   8. Przekieruj analogowy sygnał wyjściowy do głośników shuttle-box przez audio amplifier.
   9. Warunkowo dostarczyć amortyzator stopy US przez podłogę siatki. Aby uzyskać optymalną jakość nagrania elektrofizjologicznego, wygeneruj wstrząs za pomocą drugiego wysokiej klasy stymulatora wielokanałowego (MCS STG2000).
   10. Aby zastosować trening wykrywania, obecne są tylko bodźce CS+. W tym miejscu przedstawiono ślepe próby bez CS i US przeplatane między próbami testowymi (~10%), aby skorygować stronnicze zachowanie wahadłowca (patrz 3.2). W przypadku bardziej wymagającego zadania wytrenuj zwierzęta do rozróżniania bodźców CS+ i CS- prezentowanych podczas tej samej sesji w kolejności losowej.
   11. Sklasyfikuj zmianę przedziału po wystąpieniu CS+ w krytycznym oknie czasowym wynoszącym 4 sekundy (CR) jako reakcję na trafienie. W próbach CS+ bez CR w krytycznym oknie czasowym (chybione), natychmiast dostarcz łagodny wstrząs stopy przez 6 do 10 sekund jako bodziec bezwarunkowy (US).
       Uwaga: powtarzająca się stymulacja CS+, która pokrywa się z amerykańską stymulacją, zmniejszy wysiłek związany z nauką u zwierząt oraz poprawi szybkość i wydajność uczenia się (warunkowanie "opóźnienie" vs. "ślad", patrz dyskusja).
   12. W przypadku prób CS należy sklasyfikować zmianę przedziału w krytycznym oknie czasowym jako reakcję na fałszywy alarm i zastosować US na maksymalnie 10 sekund natychmiast po tym nieodpowiednim CR. Nie należy stosować US po CS-, gdy zwierzę pozostaje w komorze (bez CR) w krytycznym oknie czasowym i klasyfikować to badanie jako prawidłowe odrzucenie.
       Uwaga: Co ważne, amortyzator nożny US jest zawsze wyłączony, gdy zwierzę w odpowiedzi na niego zmienia przedział (ucieczka). Stosować dłuższe krytyczne okna czasowe dla prób CS, np. jeśli stosowana jest powtarzalna stymulacja warunkowa, chociaż narzuci to bardziej konserwatywne kryterium uczenia się, ponieważ zapewnia zwierzęciu większy wysiłek w celu zahamowania CR.
   13. Aby uzyskać skuteczne skojarzenie CS i US, dostosuj siłę wstrząsu w umiarkowanym zakresie, aby był awersyjny, ale nie bolesny. Optymalna początkowa siła prądu różni się w zależności od gatunku (np. 50 μA dla myszy, 200 μA dla myszoskoczków). W związku z tym zapoznaj się z dwoma następnymi punktami, aby uzyskać więcej informacji technicznych:
       1. Indywidualnie dostosuj siłę uderzenia podczas pierwszej sesji treningowej, zaczynając od łagodnych amplitud (~200 μA dla myszoskoczków). Jeśli siła uderzenia stopy jest zbyt niska, opóźnienia ucieczki jitter i skojarzenie między CS a US nie jest optymalne.
       2. Zawsze zwracaj uwagę, jeśli zwierzęta zaczynają wokalizować i zastygać w bezruchu w odpowiedzi na CS. W takim przypadku siła wstrząsów stopy jest zbyt wysoka. Ta uwarunkowana reakcja strachu zakłóca uczenie się unikania.
   14. Dokładnie określ opóźnienia ucieczki. Zwiększaj siłę uderzenia stopy krok po kroku, jeśli opóźnienia ucieczki są dłuższe niż 2 sekundy po pierwszych 20 próbach. Po każdym treningu sprawdzaj, czy zwierzę jest pod kontrolą wstrząsu, tj. wykazuje opóźnienia ucieczki znacznie poniżej 2 sek.
       Uwaga: Należy jednak unikać zbyt szybkiego zwiększania siły uderzenia stopy, ponieważ strategia behawioralna bardzo zestresowanego zwierzęcia może powrócić do czystych reakcji ucieczki. Dlatego uważnie obserwuj zachowanie, a zwłaszcza opóźnienia odpowiedzi podczas dostosowywania amplitudy US. Przykład znajduje się na rysunku 3E.
   15. Jeśli zwierzę pokaże CR, natychmiast przerwij prezentację CS. Ma to zasadnicze znaczenie dla wzmocnienia reakcji unikania.
   16. Jeśli zwierzęta nabyły strategię unikania, tj. wykazują odpowiednią CR dla wszystkich CS, zmieniaj parametry (amplituda ICMS, czas trwania fazy, częstotliwość powtarzania itp.), aby przeprowadzić analizy psychometryczne. Zastosuj parametryczną zmienność CS w sposób blokowy z parowaniem US, co jednak spowoduje uczenie się i adaptację.
       1. Aby tego uniknąć, zacznij od 15 do 30 prób oryginalnego treningu, a następnie losowo przeplataj warianty CS bez US jako próby testowe między regularnymi próbami treningowymi z oryginalnymi CS. Maksymalnie wykorzystaj 25% prób testowych.
   17. Po treningu wyjmij zwierzę z komory treningowej i dokładnie wyczyść całe pudełko przed treningiem następnego zwierzęcia. Staraj się unikać trenowania różnych gatunków na raz w tym samym pudełku, ponieważ ich naturalny zapach może zakłócać wydajność treningu.
2. Analiza danych treningowych
   1. Rejestruj wszystkie zmiany w kompartmencie w fazie habituacji.
   2. Rejestruj wszystkie zmiany w przedziale podczas szkolenia i podziel je na trafienia i fałszywe alarmy, reakcje ewakuacyjne (chybienia i powroty po fałszywym alarmie) oraz spontaniczne wahadłowce międzypróbne (ITS).
   3. Oblicz współczynniki CR dla CS+ i CS- w następujący sposób: współczynniki trafień = trafienia / liczba prób CS+; wskaźniki fałszywych alarmów = liczba prób CS-.
   4. Uzyskaj stawki CR dla sesji. Jednak, aby ocenić dynamikę uczenia się przy wyższej rozdzielczości czasowej, należy obliczyć współczynniki CR z krótszych bloków o tej samej liczbie prób CS+ i CS- (np. odpowiednio n = 10).
   5. Wykreśl wskaźniki CR jako funkcję sesji lub bloku próbnego w celu oceny postępów w treningu i dynamiki uczenia się.
   6. W celu ilościowego określenia wrażliwości behawioralnej niezależnej od warunków eksperymentalnych wpływających na reakcję zwierzęcia, należy wyprowadzić wartości d' w oparciu o teorię wykrywania sygnału^8,9,17.
   7. Do analizy d' należy użyć Z-score odpowiadających im wskaźników trafień i fałszywych alarmów (uczenie się dyskryminacji) lub współczynników trafień i ITS (uczenia się wykrywania) pochodzących z odwrotności standaryzowanej funkcji rozkładu normalnego i odejmić te z-score. Ustaw kryterium progowe wykrywania bodźca na poziomie d' = 1,0, co odpowiada sile sygnału o jedno odchylenie standardowe powyżej szumu. Zobacz rysunek 3 jako przykład.
   8. Dodatkowo określ czasy reakcji CR i ucieczki w odpowiedzi na różne CS, mierząc okres czasu między wystąpieniem CS a reakcją behawioralną (całkowita zmiana przedziału).
   9. Uzyskaj bardziej szczegółową analizę behawioralną, nagrywając zachowanie wahadłowca. Osiągnij synchronizację czasową między systemami wideo i nagrywania, rejestrując impulsy wyzwalające z centrali lub systemu stymulacji na ścieżce audio wideo. Analiza wideo pozwala na ocenę reakcji uwagi i orientacji zwierzęcia poprzedzającego CR.

4. Techniki elektrofizjologiczne in vivo w nauce zwierząt

1. Zapis elektrofizjologiczny podczas treningu
   1. Podczas treningu należy rejestrować sygnały elektrofizjologiczne (np. z opisanymi układami ECoG) z wielu elektrod monopolarnie względem wspólnej elektrody odniesienia/masy.
   2. Przesyłaj sygnały ze wszystkich elektrod do wzmacniacza czołowego podłączonego bezpośrednio lub za pomocą krótkiego adaptera do złączy głowicy.
   3. Podłącz scenę czołową do głównego wzmacniacza za pomocą wiązki cienkich, elastycznych owiniętych metalową siatką, aby chronić ją przed uszkodzeniem przez gryzące zwierzęta.
      Uwaga: Naprężenia mechaniczne w wiązce przewodów mogą być rozładowywane przez sprężynę, która dodatkowo umożliwia swobodne przemieszczanie się i obracanie zwierzęcia w pudełku. Idealne jest zastosowanie obrotowego i zmotoryzowanego krętlika. Jednak w przypadku eksperymentów słuchowych umieść krętlik na zewnątrz komory dźwiękoszczelnej lub osłonij go pianką, aby zmniejszyć hałas słuchowy o wysokiej częstotliwości wytwarzany przez jego silnik.
   4. Użyj przedwzmacniacza w ekranowanej skrzynce, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i przefiltrować pasmowo-przepustowe sygnał w żądanym zakresie częstotliwości.
   5. Próbkuj dane z częstotliwością próbkowania większą niż 1 kHz (w przypadku nagrań potencjału pola lokalnego) i co najmniej 40 kHz (w przypadku nagrań potencjału czynnościowego) i przechowuj je na komputerze w celu analizy w trybie offline. Stosować odpowiednie ustawienia filtra dla obu typów (np. 2 - 300 Hz dla lokalnego potencjału pola; 300 - 4 000 Hz dla potencjałów czynnościowych).
   6. Dokładnie sprawdź jakość nagrania przed rozpoczęciem treningu (brak szumów i artefaktów ruchowych). Zastosuj filtr FFT online do sygnału, aby określić amplitudę szumu 50 Hz. W razie potrzeby sprawdź dokładnie wszystkie połączenia między złączem głowicy, adapterami, stopnami głównymi, wiązką kablową i amplifiery.
   7. W celu redukcji artefaktów w zarejestrowanych danych wywołanych przez stymulację elektryczną należy zastosować procedurę interpolacji, aby zrekonstruować wszystkie punkty danych, na które wpływa artefakt 1 ms przed ~5 ms po rozpoczęciu każdego impulsu. W tym celu należy wstawić zera między niedotkniętymi punktami danych i zastosować symetryczny filtr FIR, który minimalizuje błędy średniokwadratowe między interpolowanymi punktami a ich idealnymi wartościami (funkcja interp.m Matlaba). Zastosuj tę procedurę do sygnału surowego, oddzielnie na każdym kanale przed dalszą analizą⁹.
2. Szczegóły techniczne równoległego szkolenia w zakresie shuttle-box, ICMS i nagrywania
   1. Ogólnie rzecz biorąc, upewnij się, że zwierzęta czują się komfortowo w otoczeniu boksu. Pozwól zwierzęciu swobodnie się poruszać i dotrzeć do wszystkich zakątków pudełka. Korzystny jest odpowiedni czas na przyzwyczajenie się dzień przed pierwszym treningiem (20 min) i przed każdą sesją (3 min).
   2. Po każdym leczeniu chirurgicznym należy dać zwierzęciu wystarczająco dużo czasu na powrót do zdrowia, w tym leki w razie potrzeby (patrz powyżej 2.17) i rozpocząć szkolenie zwierzęcia tylko wtedy, gdy zwierzęta nie wykazują żadnych typowych objawów cierpienia lub bólu (zamknięte oczy, ospały fenotyp, niechlujna sierść²⁰).
   3. Upewnij się, że dno sieci jest prawidłowo uziemione pod kątem elektrycznym. Należy unikać zapętleń uziemienia między systemem rejestracji, loterią wahadłową a zwierzęciem. Uziemić zwierzę tylko za pomocą wspólnej elektrody uziemiającej, pozostawiając podłogę siatki przy zmiennym napięciu.
   4. Podłącz stymulator wielokanałowy (MCS STG2000) do złącza głowicy wszczepionego układu elektrod stymulacyjnych za pomocą oddzielnych linii zmotoryzowanego krętlika.
   5. Użyj również wspólnej elektrody masowej do nagrywania jako elektrody masowej lub powrotnej dla ICMS.

5. Analiza histologiczna pozycji elektrod

1. Po wykonaniu kompletnego zestawu treningowego należy sprawdzić stabilną pozycję układu elektrod stymulacyjnych za pomocą analizy histologicznej.
2. Znieczulić zwierzęta iniekcją domięśniową mieszaniny ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) rozcieńczonej w 0,9% sterylnym chlorku sodu. Następnie należy zastosować monopolarny prąd katodowy (30 μA przez 60 sekund) dostarczany przez wszystkie kanały stymulacji w celu uzyskania złogu żelaza w tkance w miejscu implantacji⁸.
3. Po tej procedurze należy uśmiercić zwierzę za pomocą odpowiedniej i zatwierdzonej metody eutanazji (np. wstrzyknięcie dootrzewnowe przedawkowania pentobarbitalu w dawce 100 mg/kg).
4. Natychmiast usunąć mózg zwierzęcia i zamrozić go w 2-metylobutanie schłodzonym do temperatury -70 °C w ciekłym azocie.
5. Teraz przetnij obszar zainteresowania na mikrotomie kriostatu na odcinki poziome o długości 50 μm.
6. Histologia: barwienie Nissl i "błękit pruski"
   1. W celu identyfikacji warstw korowych należy potraktować co drugi plasterek barwieniem Nissl. Najpierw wykąpać plastry 5 minut w 0,05 M buforze trójwodzianu octanu sodu (pH 4,0 -4,2).
   2. Kąpać plastry przez 5 - 10 minut w 5% octanie fioletu krezylowego. Opłucz plastry wodą destylowaną.
   3. Plastry kąpać kolejno przez 2 minuty w 0,05 M buforze trójwodzianu octanu sodu (pH 4,0 - 4,2) oraz w roztworach odpowiednio 50%, 70% i 90% etanolu.
   4. Kąpać plastry dwukrotnie w izopropanolu : 96% etanolu (2:1) przez 5 minut każdy.
   5. Na koniec wykąp plastry w Roticlear trzy razy przez 5 minut.
   6. Lokalizacja kanałów stymulacji jest możliwa dzięki barwieniu "błękitu pruskiego" co drugiego przekroju, co sprawia, że widoczne jest osadzanie się żelaza wywołane długimi prądami monofazowymi po eksperymentach.
   7. Przygotować świeży roztwór 1% trójwodzianu heksacyjanoferratu(II) potasu_K4[Fe(CN)₆], mieszając 2 g_K4[Fe(CN)₆] w 200 ml 1% HCl.
   8. Dodać 800 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7.4).
   9. Kąpać plastry mózgu przez 10 minut w wodzie destylowanej, a następnie przez 10 minut w roztworze heksacyjanoferratu.
   10. Kąpać plastry dwukrotnie przez 10 minut w 0,1 M buforze fosforanowym i na koniec przez 5 minut w wodzie destylowanej.

Wyniki

Ta sekcja ilustruje reprezentatywny przykład nauki jazdy w skrzynce wahadłowej u mongolskiego myszoskoczka. Badany został przeszkolony w zakresie rozróżniania miejsca ICMS między dwiema elektrodami stymulacyjnymi wszczepionymi w korze słuchowej w odległości 700 μm od siebie (ryc. 1 i 2). Matryce stymulacyjne można dostosować do różnych projektów przestrzennych (ilustracja 1). W tym przypadku rozróżnienie dwóch lokalizacji ICMS zostało nauczone w ciągu 3 sesji szkoleniowych, z których każ...

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnego specyficznego dla miejsca ICMS i wielokanałowych zapisów elektrofizjologicznych u uczącego się zwierzęcia przy użyciu dwukierunkowego systemu wahadłowców sterowanych wstrząsem stopowym. W protokole podkreślono kluczowe pojęcia techniczne dla takiej kombinacji i zwrócono uwagę na znaczenie uziemienia zwierzęcia wyłącznie za pomocą wspólnej elektrody uziemiającej, pozostawiając dno siatki przy zmiennym napięciu. W tym przypadku uczenie się przez czółenka słuchowe zostało zastosowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut ze stali nierdzewnej izolowany teflonem	California Fine Wire		o średnicy 50&mikro; m z izolacją
System złączy pinowych	Molex Holding GmbH	510470200	Siatka PicoBlade TEM o podziałce 1,25 mm
Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Akryl dentystyczny Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Wiertarka ręczna OmniDrill35	WPI
Ketamina 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Chlorek sodu 0,9%, 10ml	B.Braun AG
Smar KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Generator bodźców MCS STG 2000	Systemy
Plexon do stacji czołowej 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32V-G20
Scena czołowa Plexon  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32V-G20
PBX przedwzmacniacz 32-kanałowy	Plexon Inc.	32PBX box
Wielokanałowy system akwizycji	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Karta przetwarzania sygnału Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Instrumenty stereotaktyczne	Stoelting Co.
Tłumik dźwięku g.pah	g.pah Guger technologies
Octan fioletu kresylowego	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Trójwodny octan sodu	Roth GmbH	6779.1
Trójwodzian heksacyjanożelazratu(II) potasu	Roth GmbH	7974.2
Dihydrat wodorofosforanu disodowego	Merck	1,065,801,000
ICM Moduł kondycjonowania impedancji	FHC	55-70-0
Regulator temperatury zwierząt	Światowe Instrumenty Precyzyjne	ATC2000