Zdobycie wysoce precyzyjnego zadania dosięgania kończyn przednich u szczurów

Podsumowanie

Paradygmat jest prezentowany w celu analizy nabywania u szczurów umiejętności sięgania kończynami przednimi do bardzo precyzyjnego dosięgnięcia.

Streszczenie

Ruchy są główną mierzalną wydajnością funkcji ośrodkowego układu nerwowego. Opracowanie paradygmatów behawioralnych, które umożliwiają szczegółową analizę uczenia się motorycznego i jego wykonywania, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zasad i procesów leżących u podstaw funkcji motorycznych. W tym miejscu przedstawiamy paradygmat badania akwizycji ruchu w ramach codziennej sesji treningu (w trakcie sesji), reprezentujący komponent szybkiego uczenia się i nabywania podstawowego, a także umiejętne uczenie się motoryczne w ciągu kilku sesji treningowych (między sesjami), reprezentujące komponent powolnego uczenia się i konsolidację wyuczonego zadania. Ten paradygmat behawioralny zwiększa stopień trudności i złożoności zadania umiejętności motorycznych ze względu na dwie cechy: Po pierwsze, zwierzę ustawia swoje ciało przed każdym pobraniem granulki, wymuszając nową orientację i uniemożliwiając wykonanie ruchu pod tym samym kątem. Po drugie, pelety są chwytane z pionowego słupka, który pasuje do średnicy pelletu i jest umieszczany przed klatką. Wymaga to precyzyjnego chwytania w celu pomyślnego wyjęcia śrutu, a tym samym zapobiega prostemu ciągnięciu śrutu w kierunku zwierzęcia. W połączeniu z nowatorskimi technologiami genetycznymi, obrazowymi i elektrofizjologicznymi, ta metoda behawioralna pomoże zrozumieć morfologiczne, anatomiczne i molekularne podstawy uczenia się motorycznego i pamięci.

Wprowadzenie

Kontrola ruchu jest podstawową funkcją ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Motoryczność jest głównym mierzalnym wynikiem funkcji OUN i główną możliwością interakcji jednostek ze światem zewnętrznym. Zrozumienie zasad funkcjonowania funkcji motorycznych i mechanizmów, które leżą u podstaw uczenia się zadania motorycznego, jest obecnie jednym z największych wyzwań w neurobiologii. Zmiany morfologiczne, fizjologiczne i molekularne stwierdzono po nabyciu nowego zadania motorycznego. Na przykład kształt i liczba synaps zmieniają się w odpowiedzi na wykwalifikowany trening motoryczny^1-5, a zmiany funkcjonalne maszynerii synaptycznej obserwowano po uczeniu się motorycznym. Odpowiedzi synaptyczne były wyższe w połączeniach regionu wytrenowanej kory ruchowej reprezentującego kończyny przednie w porównaniu z niewytrenowaną półkulą tego samego zwierzęcia lub z odpowiedziami zwierząt niewyszkolonych^6,7. Obserwacje elektrofizjologiczne sugerują również, że mechanizmy podobne do długotrwałego wzmocnienia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD) zachodzą podczas uczenia się nowej umiejętności motorycznej, a zakres operacji synaptycznej, który jest zdefiniowany między granicami wysycenia LTP i LTD,^{ulega modyfikacji8}. Ponadto wykazano, że markery aktywności i cząsteczki promujące plastyczność, takie jak c-fos, GAP-43 lub BDNF, ale także cząsteczki hamujące plastyczność, takie jak Nogo-A, pełnią rolę regulacyjną dla plastyczności neuronalnej związanej z uczeniem się^9-16.

Te postępy w kierunku lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw uczenia się motorycznego można osiągnąć tylko dzięki zastosowaniu paradygmatów behawioralnych, które pozwalają na precyzyjną kontrolę nabywania nowej umiejętności motorycznej, np. umiejętnego sięgania kończynami przednimi. Tylko dobrze skonstruowane zadanie behawioralne pozwala monitorować i rejestrować skorelowane zmiany, które zachodzą po nauczeniu się i wykonaniu danego zadania. Tutaj wizualnie demonstrujemy zmodyfikowaną wersję wykwalifikowanego zadania sięgania pojedynczą kulką kończyny przedniej u szczurów zaadaptowanych z Buitrago i wsp.¹⁷ Prezentowany paradygmat pozwala na analizę akwizycji ruchu w ramach codziennej sesji treningowej (w ramach sesji) reprezentującej komponent szybkiego uczenia się i akwizycji podstawowej, a także umiejętne uczenie się motoryczne w ciągu kilku sesji (między sesjami) reprezentujących komponent powolnego uczenia się i utrzymanie wyuczonego zadania¹⁸. Co ważne, ten paradygmat behawioralny zwiększa stopień trudności i złożoności zadania umiejętności motorycznych ze względu na dwie cechy: Po pierwsze, szczury są szkolone, aby obracać się wokół własnej osi po każdym chwycie, a tym samym ustawiać swoje ciało przed następnym sięgnięciem granulki i odnawiać orientację ciała, zapobiegając ciągłemu wykonywaniu ruchów pod tym samym kątem. Po drugie, pelety są pobierane z pionowego słupka umieszczonego przed klatką. Ze względu na małą średnicę słupka, śrut można łatwo wykopać, co wymaga precyzyjnego chwytania w celu pomyślnego odzyskania i zapobiega prostemu ciągnięciu śrutu w kierunku zwierzęcia.

Tak złożone testy behawioralne pozwalają na głębszy wgląd w mechanizmy leżące u podstaw uczenia się motorycznego. W porównaniu z myszami, szczury są lepsze w wykonywaniu złożonych zadań behawioralnych, a zatem lepiej nadają się do złożonych paradygmatów, jak przedstawiono w tym badaniu. Biorąc pod uwagę rosnące możliwości genetyczne dostępne dla szczurów^19,20, połączenie precyzyjnych i dobrze kontrolowanych metod testów behawioralnych z manipulacjami genetycznymi, obrazowaniem i technikami fizjologicznymi stanowi potężny zestaw narzędzi do lepszego zrozumienia neurobiologicznych podstaw uczenia się motorycznego i pamięci.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Biura Weterynaryjnego Kantonu Zurych, Szwajcaria.

1. Obchodzenie się ze zwierzętami i ich habituacja

1. Obchodzenie się ze zwierzętami
   Uwaga: 5 dni przed rozpoczęciem eksperymentu należy wykonywać krok 1.1.1 codziennie.
   1. W przypadku eksperymentów behawioralnych przyzwyczaj zwierzęta do eksperymentatora. Codziennie przeprowadzaj sesje manipulacyjne trwające 10-15 minut na zwierzę. Wyczyść pudełko po sesji każdego zwierzęcia.
      1. Na początku umieść rękę eksperymentatora w klatce, pozwalając zwierzęciu na eksplorację i powąchanie, aby zapoznać się z eksperymentatorem.
      2. Następnie delikatnie podnieś zwierzę ręką eksperymentatora w bezpieczny sposób, chwytając ciało szczura między przednią i tylną łapą, umożliwiając dalsze zapoznanie się.
   2. Waż każde zwierzę codziennie, aby uzyskać wyjściową masę ciała przed pozbawieniem pokarmu.
2. Habituacja aparatury i zaznajamianie się z żywnością
   1. Waż każde zwierzę codziennie, aby uzyskać wyjściową masę ciała przed pozbawieniem pokarmu.
   2. Szczury pozbawione pożywienia należy rozpocząć na 3 dni przed rozpoczęciem treningu na standardowej diecie laboratoryjnej. Podawaj szczurom 0,05 g jedzenia na 1 g masy ciała dziennie (np. szczur o wadze 200 g zacznij od 10 g jedzenia). Upewnij się, że masa ciała nie zmniejsza się o więcej niż 10% dziennie, monitorując masę ciała codziennie.
      1. Jeśli kilka zwierząt jest trzymanych w jednej klatce, dominujące szczury mogą jeść więcej niż mniej dominujące. W przypadku, gdy masa ciała zwierzęcia zmniejsza się, należy karmić zwierzę oddzielnie zamiast karmienia grupowego. Podawaj wodę ad libitum.
   3. Aby zapoznać szczura z aparatem chwytającym, umieść zwierzę w pudełku treningowym (ryc. 1). Umieść granulki cukru w pudełku treningowym w pobliżu otworu szczelinowego, aby zapoznać zwierzę z granulkami jedzenia. Wykonuj ten krok 10-15 minut dziennie przez 3 dni.

2. Przedtrening i nauka umiejętności motorycznych

1. Trening wstępny
   1. Dzień po zapoznaniu się z nim umieść zwierzę w pudełku treningowym i umieść granulkę blisko otworu szczeliny, tak aby mógł do niego dotrzeć język zwierzęcia. Wyklucz zwierzęta, które aportują granulki przednimi kończynami podczas treningu wstępnego
      Uwaga: Na tym etapie pobieranie granulek za pomocą języka ma kluczowe znaczenie i zwykle jest to metoda wybrana przez zwierzę. Granulki w żadnym wypadku nie powinny być chwytane kończyną przednią aż do pierwszego dnia nauki umiejętności motorycznych, aby umożliwić odpowiednie monitorowanie wyuczonego zadania sięgania. Pobieranie śrutu kończyną przednią podczas treningu jest kryterium wykluczającym i w większości przypadków nie jest przestrzegane.
   2. Naucz szczura, aby albo biegł do tyłu klatki i wracał do otworu szczelinowego, albo cofał się i obracał wokół własnej osi, aby otrzymać następnym granulem pokarmu za pomocą języka. Daj zwierzęciu czas na zbadanie klatki, biegnij do tyłu i wróć do otworu szczelinowego. Jeśli zwierzę nie wykona prawidłowo zadania, użyj kleszczy, aby delikatnie postukać w koniec tylnej części klatki i przyciągnąć uwagę zwierzęcia. Gdy zwierzę znajdzie się z tyłu, delikatnie postukaj w przód klatki, aby skierować zwierzę do otworu szczelinowego.
      Uwaga: Gdy zwierzę osiągnie określoną wartość standardową (np. 50 udanych wyprowadzeń śrutu językiem w czasie krótszym niż 15 minut), zwierzę kwalifikuje się do etapu uczenia się umiejętności motorycznych. Już w 1. i 2. dniu szkolenia wstępnego można odróżnić osoby uczące się od osób nieuczących się. Na tym etapie z badania mogą zostać wykluczone osoby, które nie uczą się. Zmniejsza to prawdopodobieństwo wystąpienia dużej liczby osób nieuczących się na etapie uczenia się motorycznego (2.2).
   3. Podczas treningu szczury pozbawiają pożywienia na standardowej diecie laboratoryjnej. Podawaj wodę ad libitum. Przez cały czas trwania badania należy codziennie monitorować masę ciała. Nie używaj tego samego pomieszczenia do szkolenia samców i samic szczurów. Zapewnij zwierzęciu spokojne i wolne od hałasu środowisko.
2. Określenie preferencji łapy i uczenie się umiejętności motorycznych
   1. Podczas pierwszej sesji nauki motorycznej zamień zjeżdżalnię przed oknem na słupek. Umieść granulkę cukru w odległości około 1,5 cm od okna na słupku, tak aby zwierzę nie mogło dosięgnąć wypluwki językiem, a jedynie odzyskać ją precyzyjnym ruchem sięgania i chwytania kończynami przednimi.
      1. Aby wymusić aportowanie wypluwki przez kończynę przednią, użyj kleszczy, aby delikatnie zbliżyć wypluwkę do pyska zwierzęcia i wycofać wypluwkę, podczas gdy zwierzę próbuje spożyć wypluwkę językiem. Wykonuj to zadanie wielokrotnie, aż zwierzę wyciągnie przednią kończynę i chwyci śrut.
   2. Umieść słupek pośrodku otworu okiennego. Aby określić preferencje dotyczące łapy, uważnie obserwuj pierwsze 10 prób w pierwszym dniu treningu. Ponad 70% prób dotarcia (tj. 7 na 10) musi być wykonanych tą samą kończyną przednią. Jeśli to nie zostanie osiągnięte, kontynuuj kolejną rundę 10 prób, aż do osiągnięcia progu 70%.
   3. Po określeniu preferencji łapy przesuń słupek w kierunku preferowanej kończyny przedniej i wyrównaj centralnie do granicy otworu okiennego. Preferowane ułożenie łapy oznacza, że słupek jest przesunięty w kierunku przeciwnym do odpowiedniej łapy, aby umożliwić optymalny kąt sięgania (Rysunek 1B, C).
   4. Sklasyfikuj próbę, zdefiniowaną jako nowy śrut przedstawiony zwierzęciu, jako udaną (sięgnij, chwyć, odzyskaj i zjedz kulkę), upuść (sięgnij, chwyć i strać śrut podczas odzyskiwania) lub nieudaną (strącić śrut ze słupka). Zanotuj każdą próbę w swoim arkuszu i przeanalizuj dane po zakończeniu eksperymentu.
   5. Wykonaj jedną sesję dziennie składającą się z określonej liczby prób (np. 150) lub maksymalnego czasu (np. 1 godzina) dla każdego zwierzęcia.
   6. Zbadaj precyzję i precyzyjne dostrojenie ruchu, korzystając z analizy pierwszej próby. Pierwsza próba jest definiowana przez uchwycenie śrutu w pojedynczym monolitycznym ruchu bez zakłóceń, wahań lub powtarzania poszczególnych elementów ruchu. Uważnie obserwuj każdy chwyt szczura.
      1. Jeśli szczur waha się lub chowa podczas sięgania lub próbuje kilku prób, aby prawidłowo chwycić wypluwkę, należy odnotować odpowiednią próbę jako udaną, ale nie pierwszą próbę. Jeśli zwierzę pomyślnie chwyci wypluwkę w pojedynczym monolitycznym zasięgu, zanotuj odpowiednią próbę jako udaną pierwszą próbę w osobnej kolumnie w arkuszu.
   7. Podczas uczenia się umiejętności motorycznych szczury są pozbawione pożywienia na standardowej diecie laboratoryjnej. Podawaj wodę ad libitum. Przez cały czas trwania badania należy codziennie monitorować masę ciała.

Wyniki

Skuteczne nabywanie umiejętności motorycznych jest możliwe jedynie dzięki systematycznemu treningowi. Mimo starannego uwzględnienia wszystkich aspektów, niektóre szczury nie opanowują zadania (Rycina 2). Takie „osobniki nieuczące się” wykazują albo brak motywacji, co skutkuje nielicznymi lub całkowitym brakiem prób wydobycia peletu od początku eksperymentu, albo ogólną utratę zainteresowania sięganiem po pelet, co prowadzi do ciągłych niepowodzeń. Z kolei niektóre zwierzęta wykazują zachowania agresywne ...

Dyskusja

Paradygmat pokazany w tym badaniu został zaadaptowany z Buitrago i wsp. ¹⁸ i różni się od klasycznej pojedynczej kulki osiągającej paradygmat¹⁷ głównie w dwóch aspektach:

Po pierwsze, badanie doskonalenia w trakcie sesji umożliwia analizę wyuczonego zadania w ciągu jednego dnia, co może dostarczyć innego poziomu informacji, takich jak badanie komponentu szybkiego uczenia się w porównaniu z komponentem powolnego uczenia się reprezentowanym przez średnie wartości d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pudełko			Self Made
Pedestal			Self Made
Sugar Pellets	TSE Systems Intl. Group		45 mg bezpyłowe granulki precyzyjne
Sprague Dawley szczury			5-6 tygodniowe samce
Laptop	Hewlett Packard
Stop
Kleszcze	Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST)
Excel	Microsoft
	Prism GraphPad
Waga
wagi Licznik

treningowe Robot