Tutaj przedstawiamy protokół określania wrażliwości na dalbawancynę klinicznie istotnych bakterii Gram-dodatnich przy użyciu referencyjnej metodologii mikrorozcieńczenia bulionu.
Artykuł metodologiczny
Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) jest przeprowadzany w celu oceny aktywności in vitro środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko różnym bakteriom. Wyniki AspAT, które są wyrażone jako minimalne stężenia hamujące (MIC), są wykorzystywane w badaniach nad opracowywaniem środków przeciwdrobnoustrojowych i monitorowaniem rozwoju oporności oraz w warunkach klinicznych w wytycznych dotyczących leczenia przeciwdrobnoustrojowego. Dalbawancyna jest półsyntetycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym lipoglikopeptydowym, który został zatwierdzony w maju 2014 r. przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia ostrych bakteryjnych zakażeń skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie. Przewagą dalbawancyny nad obecnymi terapiami przeciwgronkowcowymi jest jej długi okres półtrwania, co pozwala na dawkowanie raz w tygodniu. Dalbawancyna wykazuje działanie przeciwko Staphylococcus aureus (w tym zarówno S. aureus wrażliwy na metycylinę [MSSA], jak i oporny na metycylinę S. aureus [MRSA]), gronkowce koagulazo-ujemne, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus, paciorkowce β-hemolityczne i enterokoki wrażliwe na wankomycynę. Podobnie jak w przypadku innych najnowszych środków lipoglikopeptydowych, optymalizacja metod badania wrażliwości bulionu CLSI i ISO obejmuje zastosowanie dimetylosulfotlenku (DMSO) jako rozpuszczalnika podczas przygotowywania roztworów podstawowych i polisorbatu 80 (P80) w celu złagodzenia przylegania środka do tworzywa sztucznego. Przed rozpoczęciem badań klinicznych i w początkowym okresie opracowywania dalbawancyny nie prowadzono badań wrażliwości z użyciem P-80, a wyniki MIC były 2-4 krotnie wyższe, podobnie jak wyższe wyniki MIC uzyskiwano po zastosowaniu metody wrażliwości na rozcieńczenie agaru. Dalbawancyna została po raz pierwszy uwzględniona w tabelach metodologii mikrorozcieńczeń bulionu CLSI w 2005 r. i zmieniona w 2006 r. w celu wyjaśnienia stosowania DMSO i P-80. Przedstawiona tutaj procedura mikrorozcieńczania bulionu (BMD) jest specyficzna dla dalbawancyny i jest zgodna z metodami CLSI i ISO, z szczegółowymi szczegółami krok po kroku i skupieniem się na krytycznych etapach dodanych w celu uzyskania jasności.
Wprowadzenie
Dalbavancyna to półsyntetyczny lipoglikopeptyd, który został zatwierdzony przez FDA w maju 2014 roku do leczenia ostrych bakteryjnych infekcji skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie1. Głównym celem szczegółowego przedstawienia tej metody w formie wideo jest dostarczenie jasnych wskazówek dla laboratoriów klinicznych i naukowców zajmujących się badaniami w zakresie testowania i raportowania dokładnych i powtarzalnych wyników wrażliwości na dalbawancynę.
Oznaczanie środka przeciwdrobnoustrojowego MIC metodami komercyjnymi jest rutynowo wykonywane w laboratoriach klinicznych w celu oceny aktywności środka in vitro przeciwko bakteriom chorobotwórczym. Opisana tutaj metoda to metoda mikrorozcieńczenia bulionu zalecana przez CLSI i ISO 2,3,4. Ze względu na to, że komercyjne metody wrażliwości dalbawancyny nie są obecnie dostępne (w momencie publikacji), a metody dyfuzji krążkowej i rozcieńczania agaru nie są obecnie zalecane dla dalbawancyny, obecnie dostępnymi opcjami są referencyjne metody rozcieńczania bulionu 12,14. Ponieważ ta metoda referencyjna nie jest komercyjną i zatwierdzoną przez FDA metodą diagnostyki in vitro, laboratoria kliniczne w USA, które stosują tę procedurę do testowania pacjentów, muszą przestrzegać wymogów regulacyjnych dotyczących testu opracowanego laboratoryjnie (LDT). Przewiduje się, że wraz ze wzrostem stosowania dalbawancyny, więcej laboratoriów będzie musiało przetestować ten związek. Zwalidowano badanie wankomycyny jako substytut do określania wrażliwości S. aureus na dalbawancynę5. Jednak dalbawancyna może być aktywna przeciwko pośredniemu S. aureus wankomycyny (VISA) i dlatego klinicyści mogą poprosić o wyniki MIC dalbawancyny. Ponadto mogą być wymagane wyniki MIC dla innych gatunków bakterii.
Granica podatności FDA dla dalbawancyny przeciwko S. aureus została ustalona na poziomie ≤0,12 μg/ml. FDA przypisała tylko kategorię podatności z powodu braku danych na temat opornych izolatów. Normalny rozkład MIC wśród izolatów S. aureus typu dzikiego wynosi od 0,03 do 0,12 μg/ml, przy czym wyraźny modalny MIC wynosi 0,06 μg/ml. Niewielkie różnice w wynikach MIC wynikające z różnicy w metodzie, w połączeniu z nieodłączną zmiennością BMD ± jednym rozcieńczeniu, mogą mieć potencjalnie znaczący wpływ na wskaźniki wrażliwości. 6 Podobnie jak w przypadku innych lipoglikopeptydów, badanie wrażliwości dalbawancyny może być trudne ze względu na rozpuszczalność i stosunkowo duży rozmiar cząsteczki oraz jej właściwości wiążące7,8,9. Opisana tutaj referencyjna metoda BMD obejmuje dwa specyficzne etapy, które są unikalne dla środków nierozpuszczalnych i/lub środków lipoglikopeptydowych: (1) zastosowanie DMSO do przygotowania roztworów podstawowych i (2) dodanie 0,002% P-80 do końcowych rozcieńczeń panelu MIC. Celem niniejszej publikacji wideo jest wyjaśnienie metody BMD dalbavanciny i skupienie się w szczególności na tych kluczowych etapach, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki MIC.
Protokół
Uwaga: Zapoznaj się z dokumentami CLSI M7-A10 i M100-S25 i/lub ISO/FDIS 20776-1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat referencyjnej metody mikrorozcieńczania bulionu dla wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe2, 3, 4. Metody referencyjne dopuszczają opcje w niektórych procedurach specyficznych dla przygotowania inokulum i produkcji paneli MIC w celu osiągnięcia tego samego wyniku końcowego. Opisana tutaj metoda odnosi się do jednego środka przeciwdrobnoustrojowego, dalbawancyny, a niektóre z etapów stanowią jeden z potencjalnie kilku sposobów, w jaki można przeprowadzić procedurę referencyjną. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności (zgodne z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2)10. Format panelu MIC wykorzystany na potrzeby tej publikacji wideo przedstawiono w tabeli 1.
1. Przechowuj Dalbawancynę w proszku
- Po otrzymaniu diagnostycznego proszku dalbawancyny przechowywać w temperaturze -20 oC w suchym środowisku w zamrażarce bez rozmrażania. Przed użyciem proszek powinien zrównoważyć się, aby osiągnąć RT przed otwarciem.
2. Przygotowanie rozcieńczeń panelu MIC
- Przygotować roztwór podstawowy nie wyższy niż 1 600 μg/ml dalbawancyny w czystym (czystym) DMSO w sterylnych szklanych lub plastikowych probówkach i użyć tego samego dnia przygotowania lub przechowywać w temperaturze od -20 do -60 oC lub niższej do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce bez rozmrażania. Podczas ważenia proszku należy wziąć pod uwagę siłę działania dalbawancyny podaną w dokumentacji otrzymanej wraz z proszkiem (patrz równanie 1, np. 800 μg/ml preparatu podstawowego).
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy w sposób podobny do schematu, jak pokazano w kolumnie 1 ("Stężenie źródła") w tabeli 2 za pomocą czystego DMSO w sterylnych probówkach szklanych lub plastikowych. Użyć jednej pipety do odmierzenia rozcieńczalnika, a drugiej pipety do dodania początkowego bulionu dalbavanciny do pierwszej probówki. Do każdego kolejnego stężenia wyjściowego dalbavancyny należy użyć nowej pipety.
- Przygotuj 100-krotne końcowe rozcieńczenia stężenia panelu MIC (stężenia pośrednie) za pomocą schludnego DMSO. Jak pokazano w kolumnach 2-4 tabeli 2, należy połączyć odpowiednie objętości źródła i DMSO, aby uzyskać pożądane stężenie pośrednie (objętości, które należy zastosować, będą zależeć od liczby paneli MIC, które mają zostać wykonane).
- Przygotować 0,004% P80: Przygotować świeży roboczy roztwór podstawowy 2% P80, dodając 0,1 ml P80 do 4,9 mldH2O. Sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 mikrona i użyć roztworu w tym samym dniu przygotowania. Przygotować 0,004% rozcieńczalnik P80, sporządzając rozcieńczenie 2% P80 w stosunku 1:500 (np. 0,3 ml 2% P80 do 149,7 ml CAMHB).
- Dalsze rozcieńczanie stężeń pośrednich przygotowanych w kroku 2.2 1:100 w bulionie Muellera Hintona (CAMHB) dostosowanym do kationów uzupełnionym 0,004% (v/v) polisorbat-80 (P-80) P-80 i/lub LHB (dla paciorkowców) dodanych w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe, ponieważ dodanie inokulum (krok 4.3) spowoduje rozcieńczenie 1:2. Patrz: kolumny 6 i 7 w tabeli 2.
3. Przygotuj panele MIC
- Dozować 50 μl każdego roztworu dalbawancyny przygotowanego w kroku 2.3 do odpowiednich dołków panelu MIC i umieścić pożywkę tylko w jednym dołku (studzienka kontrolna wzrostu). Do tego etapu można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
- Panele należy natychmiast zużyć lub zamknąć folią z tworzywa sztucznego, umieścić w plastikowych torebkach i natychmiast umieścić w zamrażarce bez rozmrażania w temperaturze ≤-20 oC (najlepiej w temperaturze ≤-60 oC) do czasu, aż będzie potrzebna. Jeśli używane są zamrożone panele, usuń uszczelki i umieść poszczególne panele na stole laboratoryjnym na 15-30 minut (do momentu rozmrożenia zawartości) przed przystąpieniem do inokulacji panelu.
4. Zaszczepij panele mikrofonowe, wykonaj czystość i skonfiguruj liczenie kolonii
- Wybierz kilka dobrze wyizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego agatora z krwią lub innej nieselektywnej płytki agarowej. Dotknij górnej części każdej kolonii sterylną pętlą lub wacikiem i przenieś do 1-5 ml CAMHB lub soli fizjologicznej, aż zmętnienie będzie równoważne 0,5 wzorca McFarlanda. Oceń zmętnienie przez wizualne porównanie z 0,5 McFarlanda lub za pomocą urządzenia fotometrycznego.
- W ciągu 15-30 minut od przygotowania rozcieńczyć inokulum w stosunku 1:100 w CAMHB (100 μl w 10 ml CAMHB). W przypadku większości bakterii badanych przeciwko dalbawancynie, z wyjątkiem S. pneumoniae, rozcieńczenie to zapewni końcowe stężenie studzienki 5 x 105 CFU/ml (dopuszczalny zakres to 2-8 x 105 CFU/ml). W przypadku S. pneumoniae stężenie bakterii oparte na porównaniu zmętnienia do 0,5 McFarlanda jest zwykle znacznie mniejsze, dlatego inokulum należy rozcieńczyć w stosunku 1:25 (400 μl w 10 ml CAMHB+10% +LHB).
- W ciągu 15 minut po przygotowaniu inokulum przenieść 50 μl końcowego inokulum do każdego dołka (z wyjątkiem studzienki kontrolnej sterylności) panelu MIC przygotowanego w kroku 3. Na tym etapie można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
- Przeprowadzić kontrolę czystości, przenosząc i rozprowadzając 1-10 μl podwielokrotności z dołka do dodatniej kontroli wzrostu za pomocą sterylnej pętli do nieselektywnego agaru (np. agar sojowy z tryptykazą z 5% krwią owczą).
- Ustawić liczbę kolonii, usuwając 10 μl z dołka kontrolnego wzrostu za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki, a następnie przenieść do 10 ml soli fizjologicznej (rozcieńczenie 1:1 000). Wymieszać i przenieść 100 μl za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki do odpowiedniego, nieselektywnego podłoża agarowego (np. agaru sojowego z tryptykazą z 5% krwią owczą) i rozprowadzić na całej powierzchni agaru za pomocą sterylnej pętli, powtarzając dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum (rozcieńczenie 1:10).
5. Inkubacja paneli mikrofonowych, tabliczek zliczania kolonii i czystości
- Przed inkubacją zamknąć każdy panel MIC lub stos nie więcej niż 4 paneli w plastikowej torbie, taśmą z tworzywa sztucznego lub ciasno przylegającą plastikową osłoną. Alternatywnie, umieść pusty panel MIC na wierzchu stosu nie więcej niż 4 paneli MIC, umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku, umieść panele MIC w plastikowym pojemniku i bezpiecznie zamknij pojemnik pokrywką.
- Panele MIC należy inkubować w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez 16–20 godzin (gronkowce i enterokoki) i 20–24 godziny (paciorkowce) w ciągu 30 minut od inokulacji. Inkubować płytki do liczenia kolonii i czystości w tych samych warunkach, z wyjątkiem inkubacji paciorkowców w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
6. Przeczytaj tabliczki MIC i Colony Count; Sprawdź tabliczkę czystości
- Odczyt MIC jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.
- Policz kolonie na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż każdą kolonię przez współczynnik rozcieńczenia (1:10 000) (np. 50 kolonii odpowiada 5 x 105 jtk/ml). Dopuszczalny zakres to 20-80 kolonii (2-8 x 105 CFU/ml) i jest stosowany jako przybliżona wytyczna.
- Sprawdź tabliczkę czystości. Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii użytych w kroku 4.1, wówczas inokulum można uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i badanie należy powtórzyć.
7. Sprawdź wyniki kontroli jakości.
- Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z oczekiwanymi zakresami szczepów kontroli jakości CLSI. Należy podać wyniki badań izolatów tylko wtedy, gdy wyniki MIC dalbawancyny dla organizmu(-ów) kontrolnego(-ych) jakości(-ych) mieszczą się w oczekiwanym zakresie.
- W przypadku uzyskania wartości MIC wynoszącej ≥0,25 μg/ml dla któregokolwiek klinicznego izolatu S. aureus, należy powtórzyć badanie MIC dalbawancyny i (lub) przesłać do laboratorium referencyjnego w celu weryfikacji.
Wyniki
Znormalizowane metody wyznaczania MIC są niezbędne do monitorowania rozwoju oporności, co stanowi istotny cel wielu programów nadzoru nad antybiotykoopornością. Wyniki MIC dla dalbawancyny w izolatach zebranych w Europie i USA w latach 2011-2013 wynosiły <0.25 µg/ml dla 99,9% S.aureus oraz 100% paciorkowców (Tabela 4).
Aby ocenić znaczenie stosowania świeżego (uszczelnionego) DMSO, przeprowadzono badania BMD MIC dalbawancyny w trzech powtórzeniach dla szczepów kontrolnych S. aureus ATCC 29213 oraz E. faecalis ATCC 29212, a także w dwóch powtórzeniach dla S. pneumoniae ATCC 49619, stosując (1) DMSO z zamkniętych ampułek, (2) DMSO z butelki 1 L, która mieściła się w terminie ważności i była używana przez poprzednie 2 lata oraz (3) alikwot DMSO z tej samej butelki 1 L (próbka 2), który pozostawiono w otwartym zlewce na 72 hr przed użyciem. Wyniki MIC dla dalbawancyny przy użyciu paneli przygotowanych ze wszystkich trzech próbek DMSO były podobne i mieściły się w dopuszczalnych zakresach kontroli jakości (Tabela 5).
Utrata aktywności dalbawancyny po kontakcie roztworu zapasowego z tworzywem sztucznym i bez dodania P-80 została dobrze udokumentowana7. W dwóch dodatkowych badaniach dodanie P-80 do początkowych i pośrednich roztworów zapasowych (Tabela 6) oraz zastosowanie probówek szklanych lub plastikowych do przygotowania początkowych i pośrednich roztworów zapasowych (Tabela 7) nie wpłynęło na wyniki oznaczania MIC dalbawancyny. Nie odnotowano również wpływu na wyniki MIC dalbawancyny przy użyciu płytek z polipropylenu i polistyrenu od trzech różnych producentów (Tabela 7).
Wykazano, że obecność lizowanej krwi konia w pożywkach płynnych do testowania paciorkowców wykazuje działanie podobne do surfaktantów, porównywalne z P-807, 8. Metoda referencyjna dla dalbawancyny w przypadku paciorkowców obejmuje zarówno P-80, jak i lizowaną krew konia; jednak, w przeciwieństwie do gronkowców i enterokoków, wyniki MIC dalbawancyny dla paciorkowców są zbliżone (w granicach +/- 1 rozcieńczenia) z dodatkiem i bez dodatku P-80.
Jak przedstawiono wcześniej i pokazano na Rysunku 1, wartości MIC dalbawangcyny wyznaczone metodą rozcieńczeń w agarze (AD) są zazwyczaj od 2 do 8 razy wyższe w porównaniu z aktualną referencyjną metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (BMD)12, 13, 14. W przeciwieństwie do metody BMD, dodatek 0,002% P-80 nie wpływa na wyniki MIC dalbawangcyny uzyskane metodą AD12.
Równanie 1: Przykład przygotowania roztworu zapasu dalbawancyny. Kroki przygotowania 25 ml roztworu dalbawancyny o stężeniu 800 µg/ml.
Rycina 1. Porównanie BMD dla dalbawancyny i wankomycyny z AD. Wyniki badania porównującego wyniki MIC uzyskane metodą BMD i AD dla dalbawancyny i wankomycyny dla wybranych izolatów bakterii Gram-dodatnich. Średnie wyniki MIC w µg/ml dla dalbawancyny (A) i wankomycyny (B) uzyskane metodami mikrorozcieńczeń w bulionie (BMD) i rozcieńczeń w agarze (AD) dla 15 szczepów Staphylococcus aureus, 8 gronkowcówa nieskupujących (CNS), 5 szczepów Enterococcus faecalis oraz 14 paciorkowców (grupy A, B i C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kśr d dodatnia |
| B | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola pozytywna |
| C | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola pozytywna |
| D | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola pozytywna |
| E | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola dodatnia |
| F | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola dodatnia |
| G | DAL 0,002 | DAL 0.004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola dodatnia |
| H | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Kontrola dodatnia |
| DAL | Dalbawancyna | |||||||||||
| Stężenia podano w µg/ml po 50 µl/well inokulacja | ||||||||||||
Tabela 1. Format płytki MIC. Format płytki 96-dołkowej przedstawiający rozmieszczenie rozcieńczeń dalbawancyny oraz dołków kontroli dodatniej, wykorzystany jako przykład w niniejszej publikacji wideo
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Stęż. źródłowe (µg/ml) | Objętość źródła (ml) | Objętość DMSO (ml) | stężenie pośrednie w DMSO (µg/ml) | Objętość stężenia pośredniego (ml) | Objętość CAMHB + 0,004% P80* (ml) | Stężenie 2X po rozcieńczeniu 1:100 w CAMHB (µg/ml) | Końcowe stężenie w panelu po inokulacji (µg/ml) |
| 800 | 1.0 | 1.0 | 400 | 0.02 | 1.98 | 4 | 2 |
| 400 | 0.5 | 0.5 | 200 | 0.02 | 1.98 | 2 | 1 |
| 400 | 0.5 | 1.5 | 100 | 0.02 | 1.98 | 1 | 0.5 |
| 400 | 0.5 | 3.5 | 50 | 0.02 | 1.98 | 0.5 | 0.25 |
| 50 | 0.5 | 0.5 | 25 | 0.02 | 1.98 | 0.25 | 0.125 |
| 50 | 0.5 | 1.5 | 12.5 | 0.02 | 1.98 | 0.125 | 0.06 |
| 50 | 0.5 | 3.5 | 6.25 | 0.02 | 1.98 | 0.06 | 0.03 |
| 6.25 | 0.5 | 0.5 | 3.13 | 0.02 | 1.98 | 0.03 | 0.015 |
| 6.25 | 0.5 | 1.5 | 1.5 | 0.02 | 1.98 | 0.015 | 0.008 |
| 6.25 | 0.5 | 3.5 | 0.8 | 0.02 | 1.98 | 0.008 | 0.004 |
| 0.8 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.02 | 1.98 | 0.004 | 0.002 |
| Tabela została zmodyfikowana na podstawie CLSI M100-S25, Tabela 8B3 | |||||||
Tabela 2. Schemat przygotowania rozcieńczeń nierozpuszczalnych w wodzie środków przeciwdrobnoustrojowych do użytku w testach wrażliwości metodą rozcieńczeń w pożywce płynnej. Objętości roztworów roboczych dalbawancyny i rozcieńczalników do przygotowania końcowych roztworów dalbawancyny o MIC 0.002-2 µg/ml.
| Szczep do kontroli jakości | Oczekiwane MIC dla dalbawancyny (µg/ml) |
| S. aureus ATCC 29213 | 0.03-0.12 |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0.03-0.12 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0.008-0.03 |
Tabela 3. Oczekiwane wyniki MIC dalbawangcyny dla szczepów kontroli jakości3, 11. Wyniki kontroli jakości CLSI dla sugerowanych szczepów do badania wraz z izolatami klinicznymi w celu weryfikacji prawidłowości metodologii
Tabela 4. Rozkład wyników MIC dla dalbawancyny (liczba przy każdym MIC) z amerykańskiego i europejskiego badania nadzoru z lat 2011-201315. Wyniki MIC dla dalbawancyny z opublikowanego badania niedawnych izolatów klinicznych jako wskaźnik obecnej aktywności in vitro dalbawancyny.
| Izolat nr | MIC dalbawancyny (µg/ml) | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| *S. aureus* ATCC 29213 | 0.12 | 0.06 | 0.06 |
| 0.12 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| *E. faecalis* ATCC 29212 | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| *S. pneumoniae* ATCC 49619 | 0.015 | 0.015 | 0.015 |
| 0.03 | 0.015 | 0.015 | |
| DMSO 1 = Niezakorkowane ampułki 10 ml zamknięte ogniem | |||
| DMSO 2 = Często otwierana butelka 1 l | |||
| DMSO 3 = Często otwierana butelka 1 l – pozostawiona na blacie w niezakrytym zlewce przez 72 h | |||
Tabela 5. Wyniki MIC dalbawancyny (µg/ml) przy użyciu zapasu w DMSO i przygotowaniu rozcieńczeń pośrednich z DMSO z 3 źródeł. Wyniki badania MIC dalbawancyny, w którym porównano wpływ zastosowania różnych rozpuszczalników DMSO podczas przygotowania zapasu dalbawancyny oraz rozcieńczeń pośrednich.
| Numer izolatu | Liczba powtórzeń | MIC dalbawancyny (µg/ml) | |
| DALB z P80 w DMSO | DALB bez P80 w DMSO | ||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.06 |
| 2 | 0.06 | 0.06 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | |
| 4 | 0.06 | 0.06 | |
| S. aureus kliniczne DP80-002SA | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. aureus ATCC 700699 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| *S. pneumoniae* ATCC 49619 | 1 | 0.03 | 0.015 |
| 2 | 0.03 | 0.015 | |
| 3 | 0.03 | 0.015 | |
| 4 | 0.03 | 0.015 | |
| *S. pyogenes* kliniczny: | |||
| DP80-004PY | 1 | 0.015 | 0.015 |
| DP80-005PY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-006PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| DP80-007PY | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-008PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| *S. agalactiae* kliniczny: | |||
| DP80-009AG | 1 | 0.06 | 0.12 |
| DP80-010AG | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-011AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-012AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| *S. dysgalactiae* kliniczne DP80-013DY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| *S. pneumoniae* kliniczne: | |||
| DP80-014SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-015SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-016SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-017SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
Tabela 6. Wyniki MIC dalbawancyny przy użyciu zapasu DMSO i przygotowania rozcieńczeń pośrednich z dodatkiem i bez dodatku 0,002% P-80. Wyniki badania MIC dalbawancyny, w którym porównano efekt dodania 0,002% P-80 do zapasu dalbawancyny i rozcieńczeń pośrednich.
| Izolować | Liczba powtórzeń | Probówki do rozcieńczania roztworów zapasowych | Płytka mikrotitracyjna (typ tworzywa) | ||||||
| Polipropylen, Greiner | Polistyren | ||||||||
| Szkło | Tworzywo sztuczne | Plastik 1 godz. | Plastik 1 godz. / Poziom średniozaawansowany 1 godz. | Greiner | Corning | Nunc | |||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | 0.06 | 0.03 |
| 2 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | |
| 3 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 1 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 |
| 2 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
| 2 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | |
| Szkło = Początkowy roztwór zapasowy przygotowany w szklanej butelce, użyty niezwłocznie do przygotowania stężeń pośrednich w probówkach plastikowych, użyty niezwłocznie do wykonania rozcieńczeń w pożywce płynnej. | |||||||||
| Tworzywo sztuczne = Początkowy roztwór zapasowy przygotowany w plastikowej probówce wirówkowej, wykorzystany bezzwłocznie do przygotowania stężeń pośrednich w plastikowych probówkach, wykorzystanych bezzwłocznie do sporządzenia rozcieńczeń w pożywce płynnej. | |||||||||
| Plastik 1 godz. = początkowy roztwór stokowy przygotowany w plastikowej probówce do wirówki, pozostawiony na blacie na 1 godz., a następnie wykorzystany do przygotowania stężeń pośrednich w plastikowych probówkach, z których niezwłocznie przygotowano stężenia w pożywce płynnej. | |||||||||
| Plastik 1 h / Pośrednie 1 h = Początkowy roztwór gęsty przygotowano w plastikowej probówce do wirowania, pozostawiono na blacie na 1 h, następnie użyto go do przygotowania stężeń pośrednich w plastikowych probówkach, pozostawiono na blacie na 1 h, a następnie użyto do przygotowania stężeń w pożywce płynnej. | |||||||||
Tabela 7. Wyniki MIC dalbawancyny przy użyciu przygotowania rozcieńczeń zapasowych w probówkach plastikowych i szklanych oraz różnych typów plastiku płytek MIC. Wyniki badania MIC dalbawancyny, w którym porównano wpływ stosowania probówek plastikowych lub szklanych podczas przygotowywania roztworów zapasowych, a także wpływ stosowania różnych źródeł i typów plastiku w przypadku płytek mikrotytracyjnych.
Dyskusja
Przedstawiono następujące szczegóły metody w celu uwzględnienia w dodatkowych kwestiach podczas przygotowywania się do badania MIC dalbawancyny. Konstrukcja panelu MIC będzie zależała od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych, które mają być testowane (tj. samej dalbawancyny lub wielu leków) oraz gatunku bakterii, które mają być testowane. Stężenia dalbawancyny powinny obejmować interpretacyjne wartości graniczne dla wszystkich badanych gatunków bakterii oraz cały zakres rozcieńczeń oczekiwanych dla co najmniej jednego szczepu QC. Serie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych mogą być zorganizowane w rzędy lub kolumny, w zależności od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych i/lub izolatów/płytki oraz metody inokulacji. Objętość dalbavancyny w proszku i bulionu powinna być obliczona w taki sposób, aby zapewnić produkcję optymalnych ilości i minimalną ilość odpadów. Dla przykładu użytego w niniejszej publikacji tomy opierają się na przygotowaniu dwóch paneli MIC. Bulion Mueller Hinton regulowany kationami powinien być przygotowany i autoklawowany zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzoną sterylnością pożywki. Panele MIC mogą być wykonane i używane tego samego dnia przygotowania lub mogą być testowane przez odpowiednie organizmy kontroli jakości, a zwalidowane panele przechowywane w stanie zamrożonym do wykorzystania w przyszłości. Ważne jest, aby podczas całego zabiegu stosować sterylne techniki.
Nie ma ścisłych kryteriów weryfikacji stężenia inokulum z liczbą kolonii. Liczebność kolonii może być sprawdzana początkowo dla każdego badanego gatunku i/lub okresowo w celu potwierdzenia etapu rozcieńczania przeprowadzonego w kroku 4.2. Ważne jest, aby ważność wzorca 0,5 McFarlanda była również rutynowo sprawdzana za pomocą E. coli ATCC 25922 przy użyciu procedury podobnej do kroku 4.5. Jeśli wyniki nie są równoważne 1-2 x 108 jtk/ml, należy uzyskać nowy wzorzec 0,5 McFarlanda. Jeśli liczba kolonii w studzienkach MIC wykracza poza dopuszczalny zakres (2-8 x 105 jtk/ml i wyniki MIC dla klinicznego izolatu (izolatów) klinicznego różnią się od oczekiwanego rozkładu normalnego (np. 0,03-0,12 ug/ml dla S. aureus) i/lub wyniki MIC dla izolatu(-ów) kontroli jakości wykraczają poza oczekiwane zakresy, konieczne jest przeprowadzenie testów walidacyjnych i może być uzasadniona modyfikacja metody. Sugeruje się, że do powtórzenia liczenia kolonii stosuje się zwalidowany wzorzec McFarlanda 0,5, a jeśli wyniki ponownie odbiegają od oczekiwanych wyników, rozcieńczenie inokulum przeprowadzone w kroku 4.2 powinno być odpowiednio dostosowane i MIC powtórzone. Należy zauważyć, że kontrola czystości jest konieczna nawet wtedy, gdy przeprowadza się zliczanie kolonii, ponieważ procedura zliczania kolonii wykorzystuje rozcieńczoną objętość, która niekoniecznie musi wykrywać niższe stężenia organizmów skażających.
Aby badanie MIC zostało uznane za ważne, musi wystąpić akceptowalny wzrost w studzience kontrolnej wzrostu. W przypadku większości bakterii, które będą testowane przeciwko dalbawancynie (tj. gronkowce, paciorkowce i enterokoki, wzrost będzie widoczny jako guzik (zwykle >2 mm), a rzadziej wzrost może objawiać się zmętnieniem w studzience. W przeciwieństwie do niektórych środków przeciwdrobnoustrojowych, które mogą wykazywać efekt końcowy wraz ze wzrostem stężenia, punkty końcowe dalbawancyny są zazwyczaj dobrze zdefiniowane. Istnieją różne urządzenia kontrolne mające na celu ułatwienie odczytu testów mikrorozcieńczenia, które mogą być używane do odczytywania płytek zawierających dalbawancynę, o ile nie ma kompromisu w zdolności dostrzegania wzrostu w studzienkach.
Krytyczne etapy w protokole są związane z częściami procedury, które są związane z rozpuszczalnością dalbawancyny i dodatkiem P80. Ważne jest, aby maksymalne stężenie zastosowanej dalbawancyny nie przekraczało 1 600 μg/ml, aby DMSO było używane jako rozpuszczalnik i aby stężenia pośrednie były przygotowywane w DMSO przed rozcieńczeniem bulionu, tak aby końcowe stężenie DMSO w studzienkach panelowych MIC nie było większe niż 1%. DMSO jest higroskopijny i dlatego stosowanie starszych butelek DMSO było brane pod uwagę w odniesieniu do rozpuszczalności dalbawancyny. Jednakże, podczas gdy małe badanie BMD ze szczepami kontroli jakości wykazało, że nie jest to ważna zmienna (patrz sekcja wyników), dobrą praktyką jest używanie nowych lub niedawno otwartych butelek DMSO. Ważne jest również, aby P80 był dodawany do bulionu w końcowym etapie przygotowania rozcieńczalnika leku i miał końcowe stężenie 0,002% w studzience MIC.
Zawarta tutaj procedura BMD polega na przygotowaniu paneli MIC przy użyciu 50 μl/studzienkę przy stężeniach dalbavancyny i P-80 dwukrotności stężenia końcowego oraz dodaniu inokulum do 50 μl/studzienkę, tak aby końcowa objętość/studzienka wynosiła 100 μl. Metoda ta pozwala na wyprodukowanie jednego formatu panelu MIC do badania zarówno S. aureus, jak i S. pneumoniae , ponieważ lizowana krew końska może być dodana do inokulum. Alternatywne metody przygotowania paneli MIC przy użyciu 100 μl/studzienkę z dodatkiem do 10 μl/studzienkę opisano w procedurach CLSI i ISO.
Wartość graniczna dalbawancyny dla S. aureus wynosi ≤0,12 μg/ml (ulotka dołączona do opakowania FDA). Jak wykazano w niedawnym nadzorze, większość izolatów jest hamowana przez dalbawancynę na poziomie 0,06 μg/ml15. W przypadku podatnego punktu granicznego zbliżonego do modalnego MIC, wszelkie zmiany MIC wynikające z różnic w metodzie mogą wpływać na wskaźniki podatności. Ze względu na to, że procedura BMD dla dalbawancyny obejmuje kilka unikalnych etapów (w szczególności stosowanie DMSO do przygotowania podstawowych i pośrednich rozcieńczeń leków oraz 0,002% P80 w dołku MIC), konieczne jest dokładne przestrzeganie tej metody. Organizm QC S. aureus (ATCC 29213) z bardzo wyraźnym modalnym MIC dalbavancyny wynoszącym 0,06 μg/ml jest dobrym wskaźnikiem zmienności metody i powinien być rutynowo stosowany do walidacji metody BMD. Jeśli wyniki MIC mieszczą się w oczekiwanym zakresie 0,03-0,12 μg/ml, ale wykazują tendencję do niskiej lub górnej strony tego zakresu, uzasadniona jest dalsza walidacja metody.
Dodanie 0,002% P80 jest zalecane dla wszystkich istotnych organizmów Gram-dodatnich (gronkowców, enterokoków i paciorkowców). Warto jednak zauważyć, że wykazano, że lizowana krew końska działa podobnie do P-80 w odniesieniu do jej zdolności do wiązania i że dodanie P-80 do CAMHB+LHB nie ma dodatkowego wpływu na wyniki MIC paciorkowców dalbawancyny.
Obecnie nie ma metody dyfuzji krążkowej do badania dalbawancyny, a ze względu na słabą korelację wyników BMD i AD, nie zaleca się badania wrażliwości dalbawancyny metodą AD12, 14. Metoda BMD powinna być stosowana do przyszłej oceny wrażliwości na dalbawancynę oraz jako złoty standard przy opracowywaniu komercyjnych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.
Oświadczenia
Sandra McCurdy jest pracownikiem Durata Therapeutics; Firma Laboratory Specialists, Inc., pracodawca Laury Koeth i Jeanny Fisher, została zakontraktowana przez Durata Therapeutics do przygotowania manuskryptu. Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez Laboratory Specialists, Inc.
Podziękowania
Wcześniejsze prace dotyczące badania wrażliwości dalbavancyny były cenne w rozwoju ustandaryzowanych metod i uznanie za tę pracę otrzymują JMI Laboratories, Robert Rennie i Beth Goldstein.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Regulowany kationem bulion Mueller Hinton | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lizowana krew końska | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Pompa perystaltyczna Dose-it | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Piper wielokanałowy (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| Pipeta 12-kanałowa (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Pipety jednokanałowe (Ovation 10 µ l - 100 i mikro; l) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96-dołkowa mikropłytka | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 ml płaskie stożkowe dolne probówki wirówkowe | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125 mm jednorazowe szklane rurki | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17 mm zatrzask, rurki polistyrenowe | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 ml probówki wirówkowe | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Zbiorniki na odczynniki | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Jednorazowe sterylne pętle (1 i mikro; l & 10 &mikro; l) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptyczny agar sojowy + 5% krwi owczej | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Inkubator (otoczenie) | Sanyo | ||
| (5% CO2) | Sanyo | ||
| Rękawice ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | ||
| Kimberly-Clark | 52817 | ||
| Fartuchy laboratoryjne |
Bibliografia
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
Przedruki i uprawnienia
