Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

Summary

Tutaj przedstawiamy protokół określania wrażliwości na dalbawancynę klinicznie istotnych bakterii Gram-dodatnich przy użyciu referencyjnej metodologii mikrorozcieńczenia bulionu.

Abstract

Test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) jest przeprowadzany w celu oceny aktywności in vitro środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko różnym bakteriom. Wyniki AspAT, które są wyrażone jako minimalne stężenia hamujące (MIC), są wykorzystywane w badaniach nad opracowywaniem środków przeciwdrobnoustrojowych i monitorowaniem rozwoju oporności oraz w warunkach klinicznych w wytycznych dotyczących leczenia przeciwdrobnoustrojowego. Dalbawancyna jest półsyntetycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym lipoglikopeptydowym, który został zatwierdzony w maju 2014 r. przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia ostrych bakteryjnych zakażeń skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie. Przewagą dalbawancyny nad obecnymi terapiami przeciwgronkowcowymi jest jej długi okres półtrwania, co pozwala na dawkowanie raz w tygodniu. Dalbawancyna wykazuje działanie przeciwko Staphylococcus aureus (w tym zarówno S. aureus wrażliwy na metycylinę [MSSA], jak i oporny na metycylinę S. aureus [MRSA]), gronkowce koagulazo-ujemne, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus, paciorkowce β-hemolityczne i enterokoki wrażliwe na wankomycynę. Podobnie jak w przypadku innych najnowszych środków lipoglikopeptydowych, optymalizacja metod badania wrażliwości bulionu CLSI i ISO obejmuje zastosowanie dimetylosulfotlenku (DMSO) jako rozpuszczalnika podczas przygotowywania roztworów podstawowych i polisorbatu 80 (P80) w celu złagodzenia przylegania środka do tworzywa sztucznego. Przed rozpoczęciem badań klinicznych i w początkowym okresie opracowywania dalbawancyny nie prowadzono badań wrażliwości z użyciem P-80, a wyniki MIC były 2-4 krotnie wyższe, podobnie jak wyższe wyniki MIC uzyskiwano po zastosowaniu metody wrażliwości na rozcieńczenie agaru. Dalbawancyna została po raz pierwszy uwzględniona w tabelach metodologii mikrorozcieńczeń bulionu CLSI w 2005 r. i zmieniona w 2006 r. w celu wyjaśnienia stosowania DMSO i P-80. Przedstawiona tutaj procedura mikrorozcieńczania bulionu (BMD) jest specyficzna dla dalbawancyny i jest zgodna z metodami CLSI i ISO, z szczegółowymi szczegółami krok po kroku i skupieniem się na krytycznych etapach dodanych w celu uzyskania jasności.

Introduction

Dalbavancyna to półsyntetyczny lipoglikopeptyd, który został zatwierdzony przez FDA w maju 2014 roku do leczenia ostrych bakteryjnych infekcji skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie¹. Głównym celem szczegółowego przedstawienia tej metody w formie wideo jest dostarczenie jasnych wskazówek dla laboratoriów klinicznych i naukowców zajmujących się badaniami w zakresie testowania i raportowania dokładnych i powtarzalnych wyników wrażliwości na dalbawancynę.

Oznaczanie środka przeciwdrobnoustrojowego MIC metodami komercyjnymi jest rutynowo wykonywane w laboratoriach klinicznych w celu oceny aktywności środka in vitro przeciwko bakteriom chorobotwórczym. Opisana tutaj metoda to metoda mikrorozcieńczenia bulionu zalecana przez CLSI i ISO ^2,3,4. Ze względu na to, że komercyjne metody wrażliwości dalbawancyny nie są obecnie dostępne (w momencie publikacji), a metody dyfuzji krążkowej i rozcieńczania agaru nie są obecnie zalecane dla dalbawancyny, obecnie dostępnymi opcjami są referencyjne metody rozcieńczania bulionu ^12,14. Ponieważ ta metoda referencyjna nie jest komercyjną i zatwierdzoną przez FDA metodą diagnostyki in vitro, laboratoria kliniczne w USA, które stosują tę procedurę do testowania pacjentów, muszą przestrzegać wymogów regulacyjnych dotyczących testu opracowanego laboratoryjnie (LDT). Przewiduje się, że wraz ze wzrostem stosowania dalbawancyny, więcej laboratoriów będzie musiało przetestować ten związek. Zwalidowano badanie wankomycyny jako substytut do określania wrażliwości S. aureus na dalbawancynę⁵. Jednak dalbawancyna może być aktywna przeciwko pośredniemu S. aureus wankomycyny (VISA) i dlatego klinicyści mogą poprosić o wyniki MIC dalbawancyny. Ponadto mogą być wymagane wyniki MIC dla innych gatunków bakterii.

Granica podatności FDA dla dalbawancyny przeciwko S. aureus została ustalona na poziomie ≤0,12 μg/ml. FDA przypisała tylko kategorię podatności z powodu braku danych na temat opornych izolatów. Normalny rozkład MIC wśród izolatów S. aureus typu dzikiego wynosi od 0,03 do 0,12 μg/ml, przy czym wyraźny modalny MIC wynosi 0,06 μg/ml. Niewielkie różnice w wynikach MIC wynikające z różnicy w metodzie, w połączeniu z nieodłączną zmiennością BMD ± jednym rozcieńczeniu, mogą mieć potencjalnie znaczący wpływ na wskaźniki wrażliwości. ⁶ Podobnie jak w przypadku innych lipoglikopeptydów, badanie wrażliwości dalbawancyny może być trudne ze względu na rozpuszczalność i stosunkowo duży rozmiar cząsteczki oraz jej właściwości wiążące^7,8,9. Opisana tutaj referencyjna metoda BMD obejmuje dwa specyficzne etapy, które są unikalne dla środków nierozpuszczalnych i/lub środków lipoglikopeptydowych: (1) zastosowanie DMSO do przygotowania roztworów podstawowych i (2) dodanie 0,002% P-80 do końcowych rozcieńczeń panelu MIC. Celem niniejszej publikacji wideo jest wyjaśnienie metody BMD dalbavanciny i skupienie się w szczególności na tych kluczowych etapach, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki MIC.

Protocol

Uwaga: Zapoznaj się z dokumentami CLSI M7-A10 i M100-S25 i/lub ISO/FDIS 20776-1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat referencyjnej metody mikrorozcieńczania bulionu dla wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe^{2, 3, 4}. Metody referencyjne dopuszczają opcje w niektórych procedurach specyficznych dla przygotowania inokulum i produkcji paneli MIC w celu osiągnięcia tego samego wyniku końcowego. Opisana tutaj metoda odnosi się do jednego środka przeciwdrobnoustrojowego, dalbawancyny, a niektóre z etapów stanowią jeden z potencjalnie kilku sposobów, w jaki można przeprowadzić procedurę referencyjną. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności (zgodne z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2)¹⁰. Format panelu MIC wykorzystany na potrzeby tej publikacji wideo przedstawiono w tabeli 1.

1. Przechowuj Dalbawancynę w proszku

1. Po otrzymaniu diagnostycznego proszku dalbawancyny przechowywać w temperaturze -20 ^oC w suchym środowisku w zamrażarce bez rozmrażania. Przed użyciem proszek powinien zrównoważyć się, aby osiągnąć RT przed otwarciem.

2. Przygotowanie rozcieńczeń panelu MIC

1. Przygotować roztwór podstawowy nie wyższy niż 1 600 μg/ml dalbawancyny w czystym (czystym) DMSO w sterylnych szklanych lub plastikowych probówkach i użyć tego samego dnia przygotowania lub przechowywać w temperaturze od -20 do -60 ^oC lub niższej do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce bez rozmrażania. Podczas ważenia proszku należy wziąć pod uwagę siłę działania dalbawancyny podaną w dokumentacji otrzymanej wraz z proszkiem (patrz równanie 1, np. 800 μg/ml preparatu podstawowego).
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w sposób podobny do schematu, jak pokazano w kolumnie 1 ("Stężenie źródła") w tabeli 2 za pomocą czystego DMSO w sterylnych probówkach szklanych lub plastikowych. Użyć jednej pipety do odmierzenia rozcieńczalnika, a drugiej pipety do dodania początkowego bulionu dalbavanciny do pierwszej probówki. Do każdego kolejnego stężenia wyjściowego dalbavancyny należy użyć nowej pipety.
3. Przygotuj 100-krotne końcowe rozcieńczenia stężenia panelu MIC (stężenia pośrednie) za pomocą schludnego DMSO. Jak pokazano w kolumnach 2-4 tabeli 2, należy połączyć odpowiednie objętości źródła i DMSO, aby uzyskać pożądane stężenie pośrednie (objętości, które należy zastosować, będą zależeć od liczby paneli MIC, które mają zostać wykonane).
4. Przygotować 0,004% P80: Przygotować świeży roboczy roztwór podstawowy 2% P80, dodając 0,1 ml P80 do 4,9 ml_dH2O. Sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 mikrona i użyć roztworu w tym samym dniu przygotowania. Przygotować 0,004% rozcieńczalnik P80, sporządzając rozcieńczenie 2% P80 w stosunku 1:500 (np. 0,3 ml 2% P80 do 149,7 ml CAMHB).
5. Dalsze rozcieńczanie stężeń pośrednich przygotowanych w kroku 2.2 1:100 w bulionie Muellera Hintona (CAMHB) dostosowanym do kationów uzupełnionym 0,004% (v/v) polisorbat-80 (P-80) P-80 i/lub LHB (dla paciorkowców) dodanych w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe, ponieważ dodanie inokulum (krok 4.3) spowoduje rozcieńczenie 1:2. Patrz: kolumny 6 i 7 w tabeli 2.

3. Przygotuj panele MIC

1. Dozować 50 μl każdego roztworu dalbawancyny przygotowanego w kroku 2.3 do odpowiednich dołków panelu MIC i umieścić pożywkę tylko w jednym dołku (studzienka kontrolna wzrostu). Do tego etapu można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
2. Panele należy natychmiast zużyć lub zamknąć folią z tworzywa sztucznego, umieścić w plastikowych torebkach i natychmiast umieścić w zamrażarce bez rozmrażania w temperaturze ≤-20 ^oC (najlepiej w temperaturze ≤-60 ^oC) do czasu, aż będzie potrzebna. Jeśli używane są zamrożone panele, usuń uszczelki i umieść poszczególne panele na stole laboratoryjnym na 15-30 minut (do momentu rozmrożenia zawartości) przed przystąpieniem do inokulacji panelu.

4. Zaszczepij panele mikrofonowe, wykonaj czystość i skonfiguruj liczenie kolonii

1. Wybierz kilka dobrze wyizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego agatora z krwią lub innej nieselektywnej płytki agarowej. Dotknij górnej części każdej kolonii sterylną pętlą lub wacikiem i przenieś do 1-5 ml CAMHB lub soli fizjologicznej, aż zmętnienie będzie równoważne 0,5 wzorca McFarlanda. Oceń zmętnienie przez wizualne porównanie z 0,5 McFarlanda lub za pomocą urządzenia fotometrycznego.
2. W ciągu 15-30 minut od przygotowania rozcieńczyć inokulum w stosunku 1:100 w CAMHB (100 μl w 10 ml CAMHB). W przypadku większości bakterii badanych przeciwko dalbawancynie, z wyjątkiem S. pneumoniae, rozcieńczenie to zapewni końcowe stężenie studzienki 5 x 10⁵ CFU/ml (dopuszczalny zakres to 2-8 x 10⁵ CFU/ml). W przypadku S. pneumoniae stężenie bakterii oparte na porównaniu zmętnienia do 0,5 McFarlanda jest zwykle znacznie mniejsze, dlatego inokulum należy rozcieńczyć w stosunku 1:25 (400 μl w 10 ml CAMHB+10% +LHB).
3. W ciągu 15 minut po przygotowaniu inokulum przenieść 50 μl końcowego inokulum do każdego dołka (z wyjątkiem studzienki kontrolnej sterylności) panelu MIC przygotowanego w kroku 3. Na tym etapie można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
4. Przeprowadzić kontrolę czystości, przenosząc i rozprowadzając 1-10 μl podwielokrotności z dołka do dodatniej kontroli wzrostu za pomocą sterylnej pętli do nieselektywnego agaru (np. agar sojowy z tryptykazą z 5% krwią owczą).
5. Ustawić liczbę kolonii, usuwając 10 μl z dołka kontrolnego wzrostu za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki, a następnie przenieść do 10 ml soli fizjologicznej (rozcieńczenie 1:1 000). Wymieszać i przenieść 100 μl za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki do odpowiedniego, nieselektywnego podłoża agarowego (np. agaru sojowego z tryptykazą z 5% krwią owczą) i rozprowadzić na całej powierzchni agaru za pomocą sterylnej pętli, powtarzając dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum (rozcieńczenie 1:10).

5. Inkubacja paneli mikrofonowych, tabliczek zliczania kolonii i czystości

1. Przed inkubacją zamknąć każdy panel MIC lub stos nie więcej niż 4 paneli w plastikowej torbie, taśmą z tworzywa sztucznego lub ciasno przylegającą plastikową osłoną. Alternatywnie, umieść pusty panel MIC na wierzchu stosu nie więcej niż 4 paneli MIC, umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku, umieść panele MIC w plastikowym pojemniku i bezpiecznie zamknij pojemnik pokrywką.
2. Panele MIC należy inkubować w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez 16–20 godzin (gronkowce i enterokoki) i 20–24 godziny (paciorkowce) w ciągu 30 minut od inokulacji. Inkubować płytki do liczenia kolonii i czystości w tych samych warunkach, z wyjątkiem inkubacji paciorkowców w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}

6. Przeczytaj tabliczki MIC i Colony Count; Sprawdź tabliczkę czystości

1. Odczyt MIC jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.
2. Policz kolonie na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż każdą kolonię przez współczynnik rozcieńczenia (1:10 000) (np. 50 kolonii odpowiada 5 x 10⁵ jtk/ml). Dopuszczalny zakres to 20-80 kolonii (2-8 x 10⁵ CFU/ml) i jest stosowany jako przybliżona wytyczna.
3. Sprawdź tabliczkę czystości. Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii użytych w kroku 4.1, wówczas inokulum można uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i badanie należy powtórzyć.

7. Sprawdź wyniki kontroli jakości.

1. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z oczekiwanymi zakresami szczepów kontroli jakości CLSI. Należy podać wyniki badań izolatów tylko wtedy, gdy wyniki MIC dalbawancyny dla organizmu(-ów) kontrolnego(-ych) jakości(-ych) mieszczą się w oczekiwanym zakresie.
2. W przypadku uzyskania wartości MIC wynoszącej ≥0,25 μg/ml dla któregokolwiek klinicznego izolatu S. aureus, należy powtórzyć badanie MIC dalbawancyny i (lub) przesłać do laboratorium referencyjnego w celu weryfikacji.

Results

Standaryzowane metody MIC są niezbędne do monitorowania rozwoju oporności, co jest ważnym celem różnych programów nadzoru nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Wyniki MIC dalbawancyny dla izolatów pobranych w Europie i USA w latach 2011-2013 wynosiły <0,25 μg/ml dla 99,9% S.aureus i 100% paciorkowców (tab. 4).

Aby ocenić znaczenie użycia świeżego (zamkniętego) DMSO, przeprowadzono trzykrotne testy dalbavanciny BMD MIC dla szczepów QC S. aureus ATCC 29213 i E. faecalis ATCC 29212 oraz powtórne testy na S. pneumoniae ATCC 49619 przy użyciu (1) DMSO z zamkniętych ampułek, (2) DMSO z 1 L butelki, która była w terminie ważności i była używana wcześniej przez 2 lata oraz (3) podwielokrotności DMSO z tego samego 1 L butelka (próbka 2), którą przed użyciem pozostawiono w otwartej zlewce na 72 godziny. Wyniki stężenia mikrycznego dalbawancyny przy użyciu paneli wykonanych ze wszystkich trzech próbek DMSO były podobne i mieściły się w dopuszczalnych zakresach kontroli jakości (Tabela 5).

Utrata aktywności dalbawancyny po wystawieniu roztworu podstawowego na działanie plastiku i bez dodatku P-80 została dobrze udokumentowana⁷. W 2 dodatkowych badaniach dodanie P-80 do początkowych i pośrednich roztworów podstawowych (Tabela 6) oraz użycie szklanych lub plastikowych probówek do przygotowania początkowych i pośrednich roztworów podstawowych (Tabela 7) nie miało wpływu na wyniki MIC dalbawancyny. Nie stwierdzono również wpływu na wyniki MIC dalbawancyny, gdy zastosowano płyty polipropylenowe i polistyrenowe trzech producentów (Tabela 7).

Wykazano, że obecność lizowanej krwi końskiej w pożywce bulionowej do badania paciorkowców ma aktywność podobną do środka powierzchniowo czynnego, porównywalną do P-80^{7, 8}. Metoda referencyjna dalbawancyny dla paciorkowców obejmuje zarówno P-80, jak i lizowaną krew końską, jednak w przeciwieństwie do gronkowców i enterokoków, wyniki MIC dalbavancyny dla paciorkowców są podobne (w rozcieńczeniu +/- 1) z dodatkiem P-80 i bez niego.

Jak zostało wcześniej przedstawione i pokazane na rysunku 1, wartości MIC rozcieńczenia agaru dalbavancyny (AD) są zazwyczaj 2-8 razy wyższe w porównaniu do obecnego odniesienia BMD^{12, 13, 14}. W przeciwieństwie do BMD, dodanie 0,002% P-80 nie wpływa na wyniki dalbawancyny AD MIC¹².

Równanie 1: Przykład przygotowania roztworu podstawowego dalbawancyny. Etap przygotowania 25 ml roztworu dalbawancyny o stężeniu 800 μg/ml.

Rysunek 1. Porównanie dalbawancyny i wankomycyny BMD do AD.Wyniki badania, w którym porównano wyniki balbawancyny i wankomycyny BMD i MIC AD dla wybranych izolatów bakterii Gram-dodatnich. Średnia (A) Dalbawancyna i (B) Mikrorozcieńczenie bulionu wankomycyny i rozcieńczenie agaru Wyniki w μg/ml dla 15 Staphylococcus aureus, 8 gronkowców koagulazo-ujemnych (OUN), 5 Enterococcus faecalis i 14 Streptococci (grupy A, B i C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1

cyfra arabska

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ZA

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

W

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

Z

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

D

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

E

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

Z

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

Z

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

H

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0.03

DAL 0,06

DAL 0.12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

Dal

Dalbavancin

Stężenia podane są w μg/ml po zaszczepieniu 50 μl/studzienkę

Tabela 1. Format płytki MIC. Format płytki 96-dołkowej pokazujący lokalizację rozcieńczeń dalbawancyny i studzienek kontroli pozytywnej wykorzystany jako przykład w tej publikacji wideo

szt. szt. pkt. szt. szt. pkt. szt. szt. pkt. szt. Rozdział pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

1	cyfra arabska	3	4	5	6	7	8
Stężenie źródła (μg/ml)	Źródło głośności (ml)	Objętość DMSO (ml)	Stężenie pośrednie w DMSO (μg/ml)	Objętość pośrednia stężenie (ml)	Objętość CAMHB + 0,004% P80* (ml)	2X Konc. Po rozcieńczeniu w stosunku 1:100 w CAMHB (μg/ml)	Końcowe stężenie panelu po inokulacji (μg/ml)
800	1,0	1,0	400	0,02	1,98	4	cyfra arabska
400	0,5	0,5	200	0,02	1,98	cyfra arabska	1
400	0,5	1,5	100	0,02	1,98	1	0,5
400	0,5	3,5	50	0,02	1,98	0,5	0,25
50	0,5	0,5	25	0,02	1,98	0,25	0,125
50	0,5	1,5	Rozdział 12,5	0,02	1,98	0,125	0,06
50	0,5	3,5	Godzina 6,25	0,02	1,98	0,06	0,03
Godzina 6,25	0,5	0,5	Pytanie 3.13	0,02	1,98	0,03	0,015
Godzina 6,25	0,5	1,5	1,5	0,02	1,98	0,015	0,008
Godzina 6,25	0,5	3,5	0,8	0,02	1,98	0,008	0,004
0,8	0,5	0,5	0,4	0,02	1,98	0,004	0,002
Ta tabela została zmodyfikowana z CLSI M100-S25, Tabela 8B3

Tabela 2. Schemat przygotowania rozcieńczeń nierozpuszczalnych w wodzie środków przeciwdrobnoustrojowych do stosowania w badaniu wrażliwości rozcieńczeń bulionu. Objętości roztworów roboczych i rozcieńczalników dalbawancyny do przygotowania końcowych roztworów MIC dalbavancyny 0,002-2 μg/ml.

Szczep kontroli jakości	Oczekiwany MIC dalbawancyny (μg/ml)
S. aureus ATCC 29213	0,03-0,12
E. faecalis ATCC 29212	0,03-0,12
S. pneumoniae ATCC 49619	0,008-0,03

Tabela 3. Oczekiwane wyniki MIC dalbawancyny dla szczepów kontroli jakości^{3, 11}. Wyniki kontroli jakości CLSI dla sugerowanych szczepów do przetestowania wraz z izolatami klinicznymi w celu weryfikacji właściwej metodologii

Tabela 4. Rozkład wyników MIC dalbawancyny (liczba przy każdym MIC) z amerykańskiego i europejskiego badania nadzoru 2011-2013¹⁵. Wyniki MIC dalbawancyny z opublikowanego badania ostatnich izolatów klinicznych jako wskaźnika obecnej aktywności dalbawancyny in vitro.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Izoluj #	MIC dalbawancyny (μg/ml)
	DMSO 1	DMSO 2	DMSO 3
S. aureus ATCC 29213	0,12	0,06	0,06
	0,12	0,06	0,06
	0,06	0,06	0,06
E. faecalis ATCC 29212	0,06	0,06	0,06
	0,06	0,06	0,06
	0,06	0,06	0,06
S. pneumoniae ATCC 49619	0,015	0,015	0,015
	0,03	0,015	0,015
DMSO 1 = Nieotwarte ampułki 10 ml zamknięte płomieniem
DMSO 2 = Często otwierana butelka 1L
DMSO 3 = Często otwierana butelka 1L - leżała na ławce w odkrytej zlewce przez 72 godziny

Tabela 5. Wyniki MIC dalbawancyny (μg / ml) przy użyciu preparatu DMSO Stock i Intermediate Dilutions z DMSO z 3 źródeł. Wyniki badania MIC dalbavancyny, w którym porównano wpływ stosowania różnych rozpuszczalników DMSO do przygotowania preparatu dalbavancyny i rozcieńczeń pośrednich.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Izoluj numer	Replikuj liczbę	MIC dalbawancyny (μg/ml)
		DALB z P80 w DMSO	DALB bez P80 w DMSO
S. aureus ATCC 29213	1	0,06	0,06
	cyfra arabska	0,06	0,06
	3	0,06	0,06
	4	0,06	0,06
S. aureus kliniczny DP80-002SA	1	0,03	0,03
S. aureus ATCC 700699	1	0,5	0,5
S. pneumoniae ATCC 49619	1	0,03	0,015
	cyfra arabska	0,03	0,015
	3	0,03	0,015
	4	0,03	0,015
Kliniczny S. pyogenes:
DP80-004PY	1	0,015	0,015
DP80-005PY	1	0,03	0,03
DP80-006PY	1	0,03	0,015
DP80-007PY	1	0,06	0,03
DP80-008PY	1	0,03	0,015
Kliniczny S. agalactiae:
DP80-009AG	1	0,06	0,12
DP80-010AG	1	0,06	0,03
DP80-011AG	1	0,06	0,06
DP80-012AG	1	0,06	0,06
Kliniczne S. dysgalactiae DP80-013DY	1	0,03	0,03
Kliniczne zapalenie płuc S. pneumoniae:
DP80-014SP	1	0,06	0,06
Zobacz materiał DP80-015SP	1	0,03	0,03
DP80-016SP	1	0,03	0,03
DP80-017SP	1	0,06	0,06

Tabela 6. Wyniki MIC dalbawancyny przy użyciu preparatu DMSO Stock i Intermediate Dilutions z i bez 0,002% P-80. Wyniki badania MIC dalbawancyny, w którym porównano wpływ dodania 0,002% P-80 do zapasów dalbawancyny i pośrednich rozcieńczeń.

. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Izoluj	Replikuj numer	Rurki rozcieńczające				Płytka do mikromiareczkowania (typ plastikowy)
						Polipropylen, Greiner	Polistyren
		szkło	plastyczny	Plastik 1 godzina	Plastikowy 1 godz. / Średnio zaawansowany 1 godz		Greiner	Corning	Nunc
S. aureus ATCC 29213	1	0,06	0,03	0,03	0,03	0,06	0,03	0,06	0,03
	cyfra arabska	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,06
	3	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03
E. faecalis ATCC 29212	1	0,06	0,06	0,06	0,06	0,03	0,03	0,06	0,03
	cyfra arabska	0,06	0,06	0,06	0,06	0,03	0,03	0,06	0,03
	3	0,06	0,06	0,06	0,06	0,03	0,03	0,06	0,03
S. pneumoniae ATCC 49619	1	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,008	0,008	0,008
	cyfra arabska	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,015	0,008	0,008
Szkło = Początkowy wywar wykonany w szklanej butelce, natychmiast używany do wytwarzania pośrednich stężeń w plastikowych probówkach, używany natychmiast do rozcieńczania bulionu.
Plastic = Początkowy zapas wykonany w plastikowej probówce wirówkowej, używany natychmiast do wytwarzania pośrednich stężeń w plastikowych probówkach, używany natychmiast do rozcieńczania bulionu.
Plastik 1 godzina = Początkowy wywar wykonany w plastikowej probówce wirówkowej, pozostawiony na ławce na 1 godzinę, a następnie użyty do wytworzenia pośrednich stężeń w plastikowych probówkach, natychmiast użyty do zrobienia zagęszczenia w bulionie.
Plastik 1 godzina / Średnio zaawansowany 1 godzina = Początkowy wywar wykonany w plastikowej probówce wirówkowej, pozostawiony na ławce na 1 godzinę, następnie użyty do przygotowania pośrednich stężeń w plastikowych probówkach, niech siedzi na ławce przez 1 godzinę, a następnie służy do robienia zagęszczeń w bulionie.

Tabela 7. Wyniki MIC dalbawancyny przy użyciu preparatu rozcieńczeń w probówkach z tworzywa sztucznego i szklanego oraz płytkach MIC z tworzywa sztucznego. Wyniki badania MIC dalbavancyny, w którym porównano wpływ stosowania plastikowych lub szklanych probówek podczas przygotowywania roztworów podstawowych, a także wpływ stosowania różnych źródeł i rodzajów tworzyw sztucznych do produkcji płytek do mikromiareczkowania.

Discussion

Przedstawiono następujące szczegóły metody w celu uwzględnienia w dodatkowych kwestiach podczas przygotowywania się do badania MIC dalbawancyny. Konstrukcja panelu MIC będzie zależała od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych, które mają być testowane (tj. samej dalbawancyny lub wielu leków) oraz gatunku bakterii, które mają być testowane. Stężenia dalbawancyny powinny obejmować interpretacyjne wartości graniczne dla wszystkich badanych gatunków bakterii oraz cały zakres rozcieńczeń oczekiwanych dla co najmniej jednego szczepu QC. Serie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych mogą być zorganizowane w rzędy lub kolumny, w zależności od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych i/lub izolatów/płytki oraz metody inokulacji. Objętość dalbavancyny w proszku i bulionu powinna być obliczona w taki sposób, aby zapewnić produkcję optymalnych ilości i minimalną ilość odpadów. Dla przykładu użytego w niniejszej publikacji tomy opierają się na przygotowaniu dwóch paneli MIC. Bulion Mueller Hinton regulowany kationami powinien być przygotowany i autoklawowany zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzoną sterylnością pożywki. Panele MIC mogą być wykonane i używane tego samego dnia przygotowania lub mogą być testowane przez odpowiednie organizmy kontroli jakości, a zwalidowane panele przechowywane w stanie zamrożonym do wykorzystania w przyszłości. Ważne jest, aby podczas całego zabiegu stosować sterylne techniki.

Nie ma ścisłych kryteriów weryfikacji stężenia inokulum z liczbą kolonii. Liczebność kolonii może być sprawdzana początkowo dla każdego badanego gatunku i/lub okresowo w celu potwierdzenia etapu rozcieńczania przeprowadzonego w kroku 4.2. Ważne jest, aby ważność wzorca 0,5 McFarlanda była również rutynowo sprawdzana za pomocą E. coli ATCC 25922 przy użyciu procedury podobnej do kroku 4.5. Jeśli wyniki nie są równoważne 1-2 x 10⁸ jtk/ml, należy uzyskać nowy wzorzec 0,5 McFarlanda. Jeśli liczba kolonii w studzienkach MIC wykracza poza dopuszczalny zakres (2-8 x 10⁵ jtk/ml i wyniki MIC dla klinicznego izolatu (izolatów) klinicznego różnią się od oczekiwanego rozkładu normalnego (np. 0,03-0,12 ug/ml dla S. aureus) i/lub wyniki MIC dla izolatu(-ów) kontroli jakości wykraczają poza oczekiwane zakresy, konieczne jest przeprowadzenie testów walidacyjnych i może być uzasadniona modyfikacja metody. Sugeruje się, że do powtórzenia liczenia kolonii stosuje się zwalidowany wzorzec McFarlanda 0,5, a jeśli wyniki ponownie odbiegają od oczekiwanych wyników, rozcieńczenie inokulum przeprowadzone w kroku 4.2 powinno być odpowiednio dostosowane i MIC powtórzone. Należy zauważyć, że kontrola czystości jest konieczna nawet wtedy, gdy przeprowadza się zliczanie kolonii, ponieważ procedura zliczania kolonii wykorzystuje rozcieńczoną objętość, która niekoniecznie musi wykrywać niższe stężenia organizmów skażających.

Aby badanie MIC zostało uznane za ważne, musi wystąpić akceptowalny wzrost w studzience kontrolnej wzrostu. W przypadku większości bakterii, które będą testowane przeciwko dalbawancynie (tj. gronkowce, paciorkowce i enterokoki, wzrost będzie widoczny jako guzik (zwykle >2 mm), a rzadziej wzrost może objawiać się zmętnieniem w studzience. W przeciwieństwie do niektórych środków przeciwdrobnoustrojowych, które mogą wykazywać efekt końcowy wraz ze wzrostem stężenia, punkty końcowe dalbawancyny są zazwyczaj dobrze zdefiniowane. Istnieją różne urządzenia kontrolne mające na celu ułatwienie odczytu testów mikrorozcieńczenia, które mogą być używane do odczytywania płytek zawierających dalbawancynę, o ile nie ma kompromisu w zdolności dostrzegania wzrostu w studzienkach.

Krytyczne etapy w protokole są związane z częściami procedury, które są związane z rozpuszczalnością dalbawancyny i dodatkiem P80. Ważne jest, aby maksymalne stężenie zastosowanej dalbawancyny nie przekraczało 1 600 μg/ml, aby DMSO było używane jako rozpuszczalnik i aby stężenia pośrednie były przygotowywane w DMSO przed rozcieńczeniem bulionu, tak aby końcowe stężenie DMSO w studzienkach panelowych MIC nie było większe niż 1%. DMSO jest higroskopijny i dlatego stosowanie starszych butelek DMSO było brane pod uwagę w odniesieniu do rozpuszczalności dalbawancyny. Jednakże, podczas gdy małe badanie BMD ze szczepami kontroli jakości wykazało, że nie jest to ważna zmienna (patrz sekcja wyników), dobrą praktyką jest używanie nowych lub niedawno otwartych butelek DMSO. Ważne jest również, aby P80 był dodawany do bulionu w końcowym etapie przygotowania rozcieńczalnika leku i miał końcowe stężenie 0,002% w studzience MIC.

Zawarta tutaj procedura BMD polega na przygotowaniu paneli MIC przy użyciu 50 μl/studzienkę przy stężeniach dalbavancyny i P-80 dwukrotności stężenia końcowego oraz dodaniu inokulum do 50 μl/studzienkę, tak aby końcowa objętość/studzienka wynosiła 100 μl. Metoda ta pozwala na wyprodukowanie jednego formatu panelu MIC do badania zarówno S. aureus, jak i S. pneumoniae , ponieważ lizowana krew końska może być dodana do inokulum. Alternatywne metody przygotowania paneli MIC przy użyciu 100 μl/studzienkę z dodatkiem do 10 μl/studzienkę opisano w procedurach CLSI i ISO.

Wartość graniczna dalbawancyny dla S. aureus wynosi ≤0,12 μg/ml (ulotka dołączona do opakowania FDA). Jak wykazano w niedawnym nadzorze, większość izolatów jest hamowana przez dalbawancynę na poziomie 0,06 μg/ml¹⁵. W przypadku podatnego punktu granicznego zbliżonego do modalnego MIC, wszelkie zmiany MIC wynikające z różnic w metodzie mogą wpływać na wskaźniki podatności. Ze względu na to, że procedura BMD dla dalbawancyny obejmuje kilka unikalnych etapów (w szczególności stosowanie DMSO do przygotowania podstawowych i pośrednich rozcieńczeń leków oraz 0,002% P80 w dołku MIC), konieczne jest dokładne przestrzeganie tej metody. Organizm QC S. aureus (ATCC 29213) z bardzo wyraźnym modalnym MIC dalbavancyny wynoszącym 0,06 μg/ml jest dobrym wskaźnikiem zmienności metody i powinien być rutynowo stosowany do walidacji metody BMD. Jeśli wyniki MIC mieszczą się w oczekiwanym zakresie 0,03-0,12 μg/ml, ale wykazują tendencję do niskiej lub górnej strony tego zakresu, uzasadniona jest dalsza walidacja metody.

Dodanie 0,002% P80 jest zalecane dla wszystkich istotnych organizmów Gram-dodatnich (gronkowców, enterokoków i paciorkowców). Warto jednak zauważyć, że wykazano, że lizowana krew końska działa podobnie do P-80 w odniesieniu do jej zdolności do wiązania i że dodanie P-80 do CAMHB+LHB nie ma dodatkowego wpływu na wyniki MIC paciorkowców dalbawancyny.

Obecnie nie ma metody dyfuzji krążkowej do badania dalbawancyny, a ze względu na słabą korelację wyników BMD i AD, nie zaleca się badania wrażliwości dalbawancyny metodą AD^{12, 14}. Metoda BMD powinna być stosowana do przyszłej oceny wrażliwości na dalbawancynę oraz jako złoty standard przy opracowywaniu komercyjnych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dalbavancin	Metrics, Inc.	Greenville, NC	BI-397
Vancomycin	Sigma-Aldrich	St. Louis, MO	C5793
Regulowany kationem bulion Mueller Hinton	Becton Dickinson	Sparks, MD	212322
Lizowana krew końska	Cleveland Scientific	Bath, OH
Pompa perystaltyczna Dose-it	Integra Biosciences	Hudson, NH
Piper wielokanałowy (Viaflo II)	Integra	Hudson, NH	4164
Pipeta 12-kanałowa (Matrix)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Pipety jednokanałowe (Ovation 10 µ l - 100 i mikro; l)	VistaLab	Brewster, NY
96-dołkowa mikropłytka	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 ml płaskie stożkowe dolne probówki wirówkowe	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16x125 mm jednorazowe szklane rurki	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
12x17 mm zatrzask, rurki polistyrenowe	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16 ml probówki wirówkowe	BioExpress	Kaysville, UT	C-3394-2
Zbiorniki na odczynniki	Integra Biosciences	Hudson, NH	4312
Jednorazowe sterylne pętle (1 i mikro; l & 10 &mikro; l)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
Tryptyczny agar sojowy + 5% krwi owczej	Becton Dickinson	Sparks, MD
Inkubator (otoczenie)	Sanyo
(5% CO2)	Sanyo
	Rękawice ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
	Kimberly-Clark		52817
Fartuchy laboratoryjne