Artykuł metodologiczny

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

23.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53032

⸱

21 sierpnia 2015

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

W tym artykule

Podsumowanie

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Streszczenie

Extinction opisuje proces tłumienia reakcji behawioralnych na neutralne bodźce, gdy nie zapewniają one już wzmocnienia, które utrzymywało zachowanie. Istnieje ścisły związek między strachem a ludzkim lękiem, dlatego badania nad uczeniem się przez wymieranie mogą dostarczyć wglądu w biologiczną naturę zaburzeń związanych z lękiem, takich jak zespół stresu pourazowego, i mogą pomóc w opracowaniu strategii ich leczenia. Badania przedkliniczne mają na celu wspomaganie uczenia się ekstynkcji i indukowanie ukierunkowanej plastyczności w obwodach ekstynkcji w celu konsolidacji nowo powstałej pamięci. Stymulacja nerwu błędnego (VNS) to potężne podejście, które zapewnia ścisłe, czasowe i specyficzne dla obwodu uwalnianie neuroprzekaźników, co skutkuje modulacją sieci neuronowych zaangażowanych w trwające zadanie. VNS zwiększa konsolidację pamięci zarówno u szczurów, jak i ludzi, a połączenie VNS z ekspozycją na uwarunkowane sygnały zwiększa konsolidację uczenia się wyginięcia u szczurów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania części na zamówienie oraz procedur chirurgicznych wymaganych do VNS u szczurów. Korzystając z tego protokołu, pokazujemy, w jaki sposób VNS może ułatwić wygaszenie uwarunkowanych reakcji strachu w zadaniu słuchowego warunkowania strachu. Ponadto dostarczamy dowodów na to, że VNS moduluje plastyczność synaptyczną w szlaku między przyśrodkową korą przedczołową infralimbiczną (IL) a kompleksem podstawno-bocznym ciała migdałowatego (BLA), który bierze udział w ekspresji i modulacji pamięci ekstynkcji.

Wprowadzenie

Klasyczne warunkowanie strachu dostarcza szeroko stosowanego modelu zwierzęcego do badania biologicznych podstaw zaburzeń lękowych. Podczas warunkowania strachu bodziec awersyjny (bodziec bezwarunkowy, US, np. wstrząs stopą) jest prezentowany w połączeniu z bodźcem neutralnym, takim jak ton i/lub kontekst (bodziec warunkowy; CS). Podczas warunkowania strachu tworzą się skojarzenia między CS a USA. Ostatecznie, sama prezentacja CS wywołuje reakcję strachu (reakcję warunkową; CR). W obawie przed wyginięciem, CS jest prezentowany wielokrotnie pod nieobecność USA, powodując stopniowe zmniejszanie się CR1. Tak więc wygaszanie uwarunkowanego strachu jest aktywnym procesem, w którym lękliwe reakcje behawioralne na neutralne bodźce są osłabiane, gdy nie przewidują już awersyjnych wyników. Wygaśnięcie uwarunkowanych reakcji wymaga konsolidacji nowych wspomnień, które konkurują z wyuczonymi skojarzeniami. Cechą charakterystyczną zaburzeń lękowych jest upośledzone wygaszanie2-4. Tak więc wygaszanie uwarunkowanego strachu w modelach zwierzęcych służy jako ważny paradygmat zarówno dla hamującego uczenia się, jak i jako model terapii behawioralnej zaburzeń lękowych u ludzi5,6.

Ponieważ istnieje ścisły związek między strachem a ludzkim niepokojem, uważa się, że te badania mogą dostarczyć wglądu w biologiczną naturę zaburzeń związanych z lękiem, takich jak zespół stresu pourazowego, i pomogą opracować strategie ich leczenia. Ważnym celem badań przedklinicznych jest wspomaganie uczenia się wymierania i indukowanie ukierunkowanej plastyczności w obwodach wymierania w celu konsolidacji uczenia się wymierania. Stymulacja nerwu błędnego (VNS) to minimalnie inwazyjne podejście neuroprotetyczne, które może być stosowane w celu zapewnienia ścisłej modulacji czasowej i obwodowej obszarów mózgu i synaps zaangażowanych w trwające zadanie. Seria ostatnich badań przeprowadzonych przez grupę Michaela Kilgarda na Uniwersytecie Teksańskim w Dallas wykazała, że połączenie VNS z dyskretnymi bodźcami sensorycznymi lub motorycznymi (np. tonem lub pociągnięciem dźwigni) jest bardzo skuteczne w promowaniu plastyczności kory mózgowej w leczeniu szumów usznych7 lub w przezwyciężaniu deficytów motorycznych po udarze8-10. Ponadto niewarunkowy VNS, który pojawia się w krótkim czasie po nauczeniu się, podobnie promuje plastyczność kory mózgowej i zwiększa konsolidację pamięci u szczurów i ludzi11-13.

Biorąc pod uwagę rolę nerwu błędnego w szlaku przywspółczulnym, nie jest zaskakujące, że może on uczestniczyć w modulowaniu wspomnień i plastyczności synaptycznej. Wysoce emocjonalne wydarzenia mają tendencję do tworzenia silniejszych wspomnień niż wspomnienia nieemocjonalne. Jest to prawdopodobnie spowodowane wpływem hormonów stresu na konsolidację pamięci. Potreningowe podawanie hormonu stresu adrenaliny zwiększa konsolidację pamięci u ludzi i zwierząt innych niż ludzie, ale adrenalina nie przekracza bariery krew-mózg14, 15. Dlatego wywołane stresem uwalnianie adrenaliny musi pośrednio wpływać na mózg, aby zwiększyć konsolidację pamięci. Mocne dowody sugerują, że nerw błędny może być ogniwem łączącym krążącą adrenalinę z mózgiem. Miyashita i Williamsodkryli, że ogólnoustrojowe podawanie adrenaliny zwiększa wypalanie nerwu błędnego i zwiększa poziom noradrenaliny w ciele migdałowatym. Systemowe podawanie adrenaliny nie zwiększa konsolidacji pamięci, gdy receptory β-adrenergiczne są zablokowane w cielemigdałowatym18, co sugeruje, że nerw błędny odgrywa rolę w szlaku, który przekształca emocjonalnie pobudzające doświadczenia we wspomnienia długotrwałe.

Tak więc, połączenie VNS z treningiem ma potencjał do wzmocnienia zmian w mózgu, które wspierają konsolidację pamięci, a ekspozycja na uwarunkowane sygnały przy braku wzmocnienia zwiększa konsolidację uczenia się wyginięcia u szczurów19,20. Tutaj opisujemy zastosowanie VNS jako narzędzia do promowania plastyczności kory mózgowej i ułatwiania wygaszania uwarunkowanej reakcji strachu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole są przeprowadzane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Dallas.

1. Budowa mankietów VNS

  1. Utwórz narzędzie do wiercenia, odcinając ostry koniec igły 22 1/2 G.
  2. Kilkakrotnie przesuń końcem igły 22 1/2 G po metalowym pilniku, aby go spłaszczyć. Przytrzymaj igłę pod kątem 45º do pilnika i przesuń ją kilka razy po pilniku, obracając go. Spowoduje to, że metal stanie się cieńszy i zwinie się do wewnątrz. UWAGA: Włóż końcówkę skalpela w odcięty koniec igły i obróć z pewną siłą w dół, aby rozwinąć metal.
  3. Użyj lornetki powiększającej, aby wykonać pozostałe kroki w sekcji 1.
  4. Za pomocą skalpela (10 lub 15 ostrzy) wytnij 4 mm odcinki rurki.
  5. Umieść jeden segment 4 mm na małym wiertle lub innym narzędziu o podobnym kształcie. Ma to na celu utrzymanie rurki na miejscu podczas manipulacji.
  6. Wywierć 4 otwory w rurce (Rysunek 1A). Otwory powinny tworzyć cztery punkty kwadratu o wymiarach 2 mm na 2 mm i powinny być czyste, bez ostrych krawędzi.
    UWAGA: Narzędzie do wiercenia należy ponownie ostrzyć (krok 1.2) co 2 lub 3 otwory. Trudność z tym krokiem jest prawie na pewno spowodowana narzędziem wiertniczym, które nie jest wystarczająco ostre.
  7. Trzymając rurkę nadal na wiertle, użyj skalpela, aby przeciąć rurkę wzdłuż między otworami, tak aby dwa otwory znalazły się po obu stronach nacięcia (Rysunek 1B).
  8. Za pomocą igły do szycia i nici do szycia przełóż szew przez otwory, aby stworzyć olinowanie do ostatecznego umieszczenia mankietu wokół nerwu błędnego. Zacznij od igły wewnątrz mankietu i przełóż ją przez jeden z otworów, a następnie wróć przez sąsiedni otwór od zewnątrz (Rysunek 1C). Zwiąż nić ze sobą ~ 2 cm od plastiku tak, aby rurka i nić tworzyły trójkąt. Pozostaw ~8 cm nici po węzłach i przycięciu. Powtórz ten proces dla otworów po przeciwnej stronie cięcia. Rurka jest teraz gotowa do okablowania.
  9. Przygotuj druty do mankietów.
    1. Pokrój drut platynowo-irydowy na segmenty o długości 70 mm.
    2. Używając najdelikatniejszej końcówki do latarki jubilerskiej, stwórz ostry płomień z niebieskim środkiem, który jest tak wyrafinowany, jak to tylko możliwe i użyj go do usunięcia ~1 cm plastikowej powłoki z drutu. Przyłóż niebieski środek płomienia do odizolowanego końca drutu, aby utworzyć małą kulkę. Nałóż niebieski środek płomienia na kilka punktów odizolowanej części, aby połączyć ze sobą siedem pasm. Drut w tych miejscach będzie wyglądał na załamany.
    3. Na przeciwległym końcu drutu przyłóż niebieski środek płomienia do końca, aby utworzyć małą kulkę. Zminimalizuj usuwanie plastiku na tym końcu.
  10. Podłącz mankiet (Rysunek 1D).
    UWAGA: Czynności opisane w rozdziale 1.10 należy wykonać pod lornetką powiększającą.
    1. Przyklej mankiet taśmą za pomocą nici tak, aby był zorientowany z nacięciem biegnącym poziomo. Mocno naciągnij nitki, aby mankiet został rozciągnięty, a następnie przyklej nitki.
    2. Chwyć kulisty koniec odizolowanej strony przygotowanego drutu za pomocą kleszczy #5 i przepchnij przez prawy dolny otwór. Wyciągnij kleszcze z otworu, pozostawiając koniec drutu na środku mankietu.
    3. Ponownie chwyć kulkowy koniec odizolowanego drutu (teraz na środku mankietu) i wepchnij go przez prawy górny otwór. Wyciągnij kleszcze z otworu, pozostawiając drut przechodzący całkowicie przez mankiet i luźny w górnej części mankietu.
    4. Ponownie chwyć kulkowaty koniec odizolowanego drutu (teraz na zewnątrz mankietu na górze) i wepchnij go z powrotem przez prawy górny otwór od wewnątrz. Kontynuuj to, aż drut zostanie bezpiecznie zamocowany na swoim miejscu: przetestuj, pociągając za przeciwległy koniec drutu.
      UWAGA: Podczas tego procesu bardzo ważne jest rozróżnienie odizolowanych/izolowanych części drutu. Przewód, który jest ostatecznie umieszczony w "korycie" mankietu, musi zostać odizolowany, ale wszystko poniżej dolnych otworów (na zewnątrz mankietu na dolnym końcu) musi być zaizolowane. Zapewnia to dostarczanie prądu tylko do nerwu błędnego.
    5. Chwyć kulisty koniec izolowanej strony i przepchnij go przez prawy dolny otwór od wewnętrznej strony mankietu, zapętlając go raz.
    6. Powtórz kroki 1.10.2 – 1.10.5 po lewej stronie mankietu, tak aby dwa przewody zostały przymocowane do rurki, jeden po prawej stronie, a drugi po lewej stronie.
    7. Umieść złotą szpilkę w ramieniu pomocnej dłoni otworem skierowanym do góry. Wypełnij otwór topnikiem.
    8. izolowany koniec przewodu (teraz przymocowany do mankietu) do kołka.
    9. Pozwól lutowi ostygnąć, a następnie ponownie go stopij. Zapewnia to dobre połączenie między końcem przewodu a wnętrzem kołka. W razie potrzeby nałóż więcej lutu. Powtórz dla drugiego przewodu.
    10. Trzymając przewody biegnące w prawo, zaznacz górną część mankietu trwałym markerem. Zaznacz również złotą szpilkę dołączoną do górnego przewodu.

2. Budowa głowicy dla miejsca wejściowego VNS

  1. Wytnij 30 mm segmenty drutu miedzianego 26 AWG. Usuń niewielką porcję z każdego końca.
  2. Odetnij wąski koniec luźnych złotych szpilek i odizolowany koniec drutu do odciętego końca złotego kołka. Utwórz dwa związki przewód/pin dla każdego żądanego miejsca wejściowego. Umieść złącze w pomocnych dłoniach i końcówkę przewodu z mieszanki przewód/styk do każdego z dwóch zębów topnika złącza (Rysunek 2G).
  3. Zaznacz jeden z drutów za pomocą sharpie. Podczas zabiegu należy ustawić implant z zaznaczonym drutem rostral do nieoznaczonego drutu.

3. Chirurgia VNS

  1. Twórz niestandardowe szklane narzędzia do obsługi nerwu błędnego podczas operacji.
    1. Użyj szkła borokrzemianowego, aby pociągnąć mikropipetę tak, aby miała długą, zwężającą się końcówkę. Jeśli ściągacz do pipet nie jest dostępny, rozbij szkło, aby uzyskać dłuższą krawędź.
    2. Przytrzymaj niestożkową końcówkę pipety grubą szmatką (aby zapobiec poparzeniom) i wciśnij stożkową/złamaną końcówkę w gładką, ognioodporną powierzchnię, jednocześnie przykładając niebieski płomień z latarki jubilerskiej do stożkowego końca. Szkło będzie się wyginać, gdy zostanie wciśnięte w powierzchnię. Stosuj płomień, aż utworzy się hak lub kształt litery J.
  2. Zabiegi chirurgiczne VNS
    1. Zbierz i wysterylizuj wszystkie narzędzia. Przygotuj sanitarną, ogrzewaną salę operacyjną.
    2. Znieczulić zwierzę ketaminą/ksylazyną (85 mg/kg, 5mg/kg, IP). Oceń głębokość płaszczyzny znieczulającej, monitorując wokalizacje i odruchy wycofania zwierzęcia w odpowiedzi na szczypanie palców u nóg i/lub ogona.
    3. Ogol czubek głowy i lewą stronę szyi zwierzęcia. Chroń oczy zwierzęcia olejem mineralnym lub maścią do oczu. Nałóż jodowy roztwór oczyszczający z gazą, a następnie alkohol z gazą na ogolone miejsca. Powtórz raz.
    4. Wstrzyknąć 0,05 ml marcainy podskórnie w czubek głowy i pozwolić bolusowi rozproszyć się, jednocześnie umieszczając zwierzę w przyrządzie stereotaktycznym.
    5. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie w skórze na czaszce, aby odsłonić zarówno lambdę, jak i bregmę. Przygotuj ścieżkę dla mankietu, używając kleszczy, aby tunelować podskórnie od miejsca nacięcia po lewej stronie przed uchem do lewej strony szyi.
    6. Rozciągnij miejsce nacięcia za pomocą hemostatów. Za pomocą bawełnianych wacików nałóż nadtlenek wodoru na odsłoniętą czaszkę, aby usunąć pozostałą tkankę.
    7. Za pomocą skalpela wywierć dwa płytkie otwory startowe w czaszce, aby umieścić kotwiące. Powinny być one umieszczone na tyle daleko od siebie, aby było miejsce na implant, ale nie za blisko otaczającej tkanki. Unikaj umieszczania bezpośrednio na linii środkowej.
      1. Za pomocą kleszczy i śrubokręta wkręć kościaną w oba otwory. powinny być mocno dokręcone w otworach, z zaślepkami 2 - 3 mm nad powierzchnią czaszki, aby zapewnić miejsce na wypełnienie akrylu pod i wokół nich.
    8. Wypełnij przestrzeń pod, wokół i między niewielką ilością akrylu, omijając otaczającą tkankę. Następnie umieść większą ilość akrylu na środku czaszki między dwiema.
    9. Chwyć implant tak, aby oznaczony drut był zorientowany rostralnie do nieoznaczonego drutu i szybko umieść implant w akrylu, uważając, aby akryl nie dostał się do złotych szpilek, obszaru zapięcia lub miejsca wejściowego na górze. Po ustawieniu pozostaw na ~ 5 minut, aż wyschnie. Można to również zrobić za pomocą ramienia stereotaktycznego dla podparcia. Wypełnij wszelkie pęknięcia lub szczeliny między implantem a czaszką mieszanką akrylu o niskiej lepkości. Pozostawić do wyschnięcia.
    10. Użyj lornetki powiększającej, aby wykonać pozostałe kroki opisane w sekcji 3.2.
    11. Usuń zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. Połóż zwierzę na prawym boku, obracając je lekko w kierunku pozycji brzusznej.
    12. Wykonaj małe nacięcie mniej więcej nad lewą żyłą szyjną. Kość szczęki i obojczyk powinny znajdować się mniej więcej w równej odległości od miejsca nacięcia. Poszerz nacięcie za pomocą rozwarstwienia, aż do osiągnięcia warstwy mięśniowej. Mięśnie mostkowo-sutkowe, mostkowo-gnykowe i omohyoidalne powinny być widoczne. Użyj retraktorów mięśni, aby utrzymać miejsce otwarte.
    13. Kontynuuj preparowanie wzdłuż naturalnych bruzd między mięśniami. Poszukaj pulsowania tętnicy szyjnej. Kierowanie się przez mięsień w kierunku pulsowania ujawni tętnicę szyjną. Pociągnij mięśnie do tyłu za pomocą retraktora mięśni. Pochewka zawierająca tętnicę szyjną zawiera również nerw błędny. Ostrożnie tępo rozetnij pochwę nożyczkami.
    14. Zidentyfikuj nerw błędny. Jest to największy nerw w pochewce tętnicy szyjnej i zwykle znajduje się po lewej stronie tętnicy zwierzęcia, ale można go znaleźć po dowolnej stronie. Przełącz się na niestandardowe narzędzia do szkła i oddziel nerw błędny od tętnicy szyjnej. Nerw powinien być wolny od jakiejkolwiek innej tkanki na co najmniej 5 mm.
    15. Od nacięcia na głowie, za pomocą nici po stronie mankietu naprzeciwko przewodów, przeciągnij mankiet przez wcześniej wykonany tunel podskórny za pomocą kleszczy lub małych hemostatów. Przepchnij go przez tkankę do miejsca nacięcia na szyi.
    16. Delikatnie podnieś nerw do góry za pomocą szklanych narzędzi i popchnij nici z boku mankietu naprzeciwko przewodów pod nerwem. Przeciągnij nici do końca, uważając, aby nie ocierać się o nerw. Mankiet powinien przylegać bezpośrednio do nerwu.
    17. Upewnij się, że mankiet jest zorientowany tak, aby oznaczona "górna" strona była wyższa. Wrzuć nerw do środka mankietu. Nerw powinien teraz leżeć w poprzek obu drutów w korycie mankietu (ryc. 2B). Zwiąż nici razem, aby zamknąć mankiet.
    18. Na nasadce wtyku podłącz kołki przymocowane do mankietu do złotych pinów w miejscu wejścia stymulacji. Podłącz zaznaczoną szpilkę do złotej szpilki przymocowanej do najbardziej wysuniętego przedniego zęba w miejscu wejściowym symulacji.
    19. Aby sprawdzić, czy mankiet prawidłowo stymuluje nerw błędny, wykonaj test zaprzestania oddychania, podłączając stymulator do miejsca wejściowego stymulacji na nasadce i uruchamiając stymulację (0,2 mA, 60 Hz, do 10 sekund). Oddech powinien na chwilę się zatrzymać, a tętno powinno spaść, sprawdzając działanie mankietu.
    20. Zabezpiecz kołki w miejscu wejścia stymulacji akrylem. Zakryj przewody i sprawdź, czy odsłonięte styki i przewody nie prowadzą do zwarć. Użyj akrylu, aby wygładzić wszelkie nierówności lub wypełnić wszelkie luki. Pozostawić do wyschnięcia.
    21. Szew zamknął oba miejsca nacięcia. Wstrzyknąć 0,05 ml marcainy podskórnie w pobliżu miejsca nacięcia szyi. Nałóż maść z antybiotykiem na miejsca nacięć. Opcjonalnie pozostaw męskie złącze na miejscu w miejscu wejścia stymulacji, aby zapobiec uszkodzeniom lub niedrożności podczas procesu gojenia.
    22. Leczyć antybiotykiem i postępować zgodnie ze standardową opieką pooperacyjną, w tym odpowiednią analgezją. Zwracanie zwierząt do pomieszczeń inwentarskich po odzyskaniu przez nie sprawności ruchowej. Odczekaj 5 dni na odzyskanie sprawności. Aby zapewnić maksymalną trwałość i funkcjonalność nasadki na głowę, zwierzęta domowe powinny być trzymane pojedynczo przez pozostałą część eksperymentu.
      UWAGA: Szczury Sham-VNS przechodzą tę samą operację, jednak obwód jest zaprojektowany tak, aby zwierał się na poziomie nasadki (tj. wszczepia się nasadkę, a nerw błędny jest oddzielony od tętnicy szyjnej, ale wokół nerwu nie umieszcza się mankietu elektrody).

4. Warunkowanie strachu słuchowego

UWAGA: Ten protokół warunkowania strachu jest bardziej intensywny niż większość21, ponieważ celem tych eksperymentów jest zwiększenie wymierania. Przy łagodnym kondycjonowaniu strachu, które łatwo wygasić, efekt podłogi może przesłonić to wzmocnienie.

  1. Zwierzęta domowe w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Codziennie dotykaj zwierząt podczas rekonwalescencji po operacji.
  2. Ustawić aparaturę kondycjonującą i testującą, składającą się ze skrzynki operacyjnej umieszczonej w komorze wyciszającej (rysunek 2C). Skrzynka operacyjna ma przezroczyste plastikowe ścianki o wymiarach 20 x 20 x 20 cm i ma podłogę z siatki ze stali nierdzewnej, która jest podłączona do generatora wstrząsów nożnych. Użyj białego światła w domu, aby oświetlić komorę do nagrywania wideo. Użyj tonu 9 kHz, 85 dB SPL jako bodźca warunkowego.
  3. Rejestruj zachowanie za pomocą kamery cyfrowej umieszczonej wewnątrz komory, nad skrzynką operacyjną. Przeglądaj i monitoruj sesję na komputerze znajdującym się poza pokojem zachowań. Zapisuj filmy do późniejszej analizy.
  4. Przetrzyj komory 70% etanolem przed i po każdej sesji, aby wyeliminować sygnały węchowe.
  5. Kondycjonuj szczury strachem przez 2 dni (ryc. 3A). Potwierdź, że szczury nie boją się z natury tonu, prezentując 5 tonów (9 kHz, 85 db, 30 sekund) pierwszego dnia. Upewnij się, że poziomy zamarzania są znikome.
    1. Postępuj zgodnie z początkowymi prezentacjami tonów z 8 parami ton-footshock (1 sekunda, 0,5 mA) w każdym z 2 kolejnych dni. Powtórz parowanie ton-wstrząs stopowy ponownie drugiego dnia. Zmieniaj interwał między bodźcami (ISI) w zakresie od 2 do 4 minut, średnio 3 minuty dla każdej próby. Losowo wybierz punkt, w którym następuje wstrząs podczas dźwięku.
  6. Trzeciego dnia przetestuj siłę skojarzenia ton/szok. Zagraj 4 tony z ISI wynoszącym 3, 4 lub 5 minut (średnia 4 minuty) przy braku wstrząsów stopami i rejestruj zachowanie zwierząt podczas prezentacji tonów i podczas interwałów między bodźcami jako miary uwarunkowanej reakcji strachu (CFR).
  7. W dniu 4 rozpocznij trening wymierania z VNS lub Sham VNS.
    1. Podłącz szczury do stymulatora, wkładając męskie łączniki ze stymulatora do miejsca wejściowego stymulacji. Umieść zwierzęta w komorze (Rysunek 2A, 2C). Ustaw stymulator na 0,4 mA, szerokość impulsu 500 μs przy 30 Hz. Ustaw stymulację na łączny czas trwania 30,15 sekundy, rozpoczynając 150 ms przed nadejściem tonu. Odtwórz zwierzętom 4 tony (jak w kroku 4.6) i sparuj każdą prezentację tonów z VNS lub Sham VNS.
  8. Okresowo testuj integralność elektryczną mankietu i miejsca wejściowego za pomocą oscyloskopu.
    1. Podłącz zwierzę jak zwykle i podziel wyjście ze stymulatora na oscyloskop.
    2. Ustaw zakres na oscyloskopie od -20 V do +20 V i uruchom stymulację. Przebieg stymulacji 30 Hz powinien być widoczny na oscyloskopie. Stymulacje o napięciu przekraczającym 10 V wskazują na wysoką impedancję i nieprawidłowo działający mankiet lub połączenie w miejscu wejścia stymulacji.
  9. Aby przetestować wpływ VNS na trening wymierania, uruchom drugi test CFR (jak w kroku 4.6) w dniu 5. Zapisz czas spędzony na zamrażaniu podczas prezentacji tonów i porównaj z zamrażaniem linii bazowej zarejestrowanym podczas pierwszego testu CFR (krok 4.6).
  10. Analizuj filmy za pomocą niezależnego obserwatora, który jest ślepy na warunki leczenia. Zmierz czas spędzony na zamrożeniu podczas prezentacji tonów za pomocą stopera. Zamrożenie definiuje się jako całkowity bezruch, podczas którego szczur wykazuje szybkie oddychanie, opuszczoną głowę i rozłożone łapy22. Analizę zachowania podczas zamrożenia można podzielić na dwie fazy: podczas prezentacji tonu i podczas interwału między bodźcami.

5. Nagrania in vivo potencjałów pola wywołanego

Uwaga: Ten krok jest opcjonalny. Potencjały pola wywołanego (EFP) są rejestrowane 24 godziny po testach przywrócenia (dzień 5) u szczurów znieczulonych izofluranem zamontowanych w aparacie stereotaktycznym, zgodnie ze standardowymi procedurami23,24.

  1. Zbierz i wysterylizuj wszystkie narzędzia.
  2. Wywołaj znieczulenie izofluranem (5% w 100% tlenie, natężenie przepływu 1 l/min) w przezroczystej komorze z tworzywa sztucznego. Oceń głębokość płaszczyzny znieczulającej, monitorując wokalizacje i odruchy wycofania zwierzęcia w odpowiedzi na szczypanie palców u nóg i/lub ogona. Użyj oleju mineralnego lub maści do oczu, aby chronić oczy.
  3. Wstrzyknąć 0,05 ml markainy podskórnie w czubek głowy i pozwolić bolusowi na rozproszenie się. Użyj skalpela i hemostatów, aby usunąć nasadkę z czaszki. Użyj jak najmniejszej siły, aby uniknąć zasłaniania bregmy.
  4. Umieść zwierzę w przyrządzie stereotaktycznym. Użyj skalpela, aby poszerzyć nacięcie, aby odsłonić zarówno lambdę, jak i bregmę. Utrzymać płaszczyznę znieczulenia za pomocą izofluranu (3% w 100% tlenu, natężenie przepływu 1 l/min) przez nosek.
  5. Wywierć otwory w czaszce nad podlimbiczną korą przedczołową (IL) i ciałem migdałowatym podstawno-bocznym (BLA). Opuść szklane mikroelektrody (2M KCl; rezystancja 1-2 MOhms) do BLA (D / V: 7,2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 od bregma) i elektrodę stymulacyjną do obszaru IL przyśrodkowej kory przedczołowej (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 od bregma) (Figura 4A).
  6. Stymuluj IL do wywoływania EFP w BLA. Dane pokazane na rysunku 4 uzyskano przy następujących ustawieniach: Impuls stymulacji o czasie trwania 0,3 ms, przy użyciu intensywności stymulacji odpowiadającej 40% minimalnej intensywności prądu, która wywołała maksymalną reakcję pola (w oparciu o krzywą wejścia-wyjścia określoną przed zebraniem danych wyjściowych), dostarczany co 15 sekund.
  7. Zbieraj dane wyjściowe przez co najmniej 10 - 15 minut przed wywołaniem plastyczności synaptycznej.
    UWAGA: Protokół używany do wywoływania plastyczności synaptycznej będzie się różnił w zależności od wymagań eksperymentów i musi być starannie wybrany przez każdego eksperymentatora. Dane na rysunku 4C pokazują zmiany w EFP po 3 seriach po 100 impulsów przy 50 Hz (2 sekundy), z 20-sekundowymi przerwami między impulsami przy minimalnym natężeniu prądu, które wywołało maksymalną odpowiedź pola.
  8. Zmierz amplitudę EFP jako różnicę między średnią z okna 5 ms przed artefaktem stymulacji a średnią z okna 5 ms około 20 - 25 ms po artefaktie stymulacji, co odpowiada ujemnemu pikowi potencjału pola. Znormalizuj dane do punktu odniesienia i ustaw średnią z 10-minutowego planu bazowego na 100%. Do oceny długoterminowych zmian amplitudy EFP należy wykorzystać uśrednione amplitudy EFP z kolejnych 10 minut po indukcji plastyczności (np. 40 - 50 minut po indukcji).
  9. Po zakończeniu nagrania odetnij głowę znieczulonemu zwierzęciu i wydobądź mu mózg. Przygotować tkankę do weryfikacji histologicznej umieszczenia elektrody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać, stosując VNS w połączeniu z uczeniem wygaszania, aby zmniejszyć ekspresję warunkowej reakcji strachu u szczurów. W dniach 1 i 2 (Warunkowanie Strachu Słuchowego) szczury przeszły trening zadania warunkowania strachu słuchowego, w którym wstrząsy stóp były parowane z sygnałem dźwiękowym. W dniu 3 (Test Przed Leczeniem) sygnały dźwiękowe prezentowano bez wstrząsów stóp, aby zmierzyć poziom zamierania (freezing) i wywnioskować stopień nabycia warunkowej reak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj protokół, który jest używany do ułatwienia wygaszania uwarunkowanego strachu podczas pojedynczej sesji ekspozycji na uwarunkowane sygnały19 oraz do modulowania plastyczności w szlaku między korą podlimbiczną a ciałem migdałowatym podstawno-bocznym, które może pośredniczyć w uczeniu się wygaszania20. Kluczowym krokiem dla sukcesu tego protokołu jest prawidłowe dostarczenie VNS podczas treningu wymierania. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na konstrukcję elektrod mankietu i u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów ani konfliktów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alkohol
AtropinaFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Nadtlenek wodoru CVS209478
KetaminaHenry Schein 1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Olej mineralnyCVS152355
NeosporinCVS629451
Oxygen Home Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropanHome Depot304182
KsylazynaHenry Schein4019308
Narzędzia
Biżuteria LatarkaSprzęt kowalski23-1001D
Igła do szyciaWalgreens441831
#5 Kleszcze (2)Fine Science Tools11254-20
LutownicaHome Depot 
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Mikroskop stereoskopowy z wysięgnikiem na płytce drukowanej + 144 diody LEDAmScopeSM-4TX-144A Pomocne dłonie
AM Systems 726200
Uchwyt ostrza skalpelaFine Science Tools10003-12
Metalowy pilnikHome Depot6601
LinijkaHome Deopt202035324
Zakrzywione hemostatyki Narzędzia do nauki pięknej130009-12
Drobne nożyczkiNarzędzia do nauki o nauce14058-09
Szpatułkado nauki o szczegółach
Mały śrubokrętHome Depot646507
Magnetyczny system chowania stabilizatoraNarzędzia do nauki o nauce18200-04, 18200-01, 18200-05
Poduszka grzewczaWalgreens30294
Maszynki do strzyżeniaWalgreens277966
SharpieStaples125328
Kleszcze pierścienioweNarzędzia do nauki11103-09
Niestandardowe szklane narzędzia do mikropipet (kształt J i proste) - szkło borokrzemianoweInstrument SutterB150-110-10
Kleszcze AdsonNarzędzia do nauki11006-12
Mankiety
RurkiBraintree Scientific IncMRE-065
Platynowy drut irydowyMedwire10IR9 / 49T
Złote szpilkiMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Nici do szwówHenry Schein100-5797
Igły 22 GFisher 14-815-525
Taśma papierowaFisher 03-411-602
Lutowniczymagazyn domowy327793
Flux Home Depot300142
Ostrze skalpela, 10 lub 15Stoelting52173-10
Silastic Laboratory Rurki .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
Łączniki nasadek
(męskie)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Elementy nasadek (żeńskie)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Trójniki Dentystyczne systemy akrylowe, płynne i proszkowe525000, 526000
Zszywki z drutumiedzianego o grubości 261016882  
Chirurgia
kostneStoelting+CB33:C6151457
Ostrza skalpela, 10 lub 15Stoelting52173-10
Strzykawki 1 mlFisher14-826-261
Igły 22 GFisher 14-815-525
Igły 27 GFisher14-826-48
2 "x 2" GazaFisher22-362-178
WacikiFisher19-120-472
Podkładki dla szczeniątPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Komora i ustawienie behawioralne 
Metalowa szafka przednia Husky (30WX19DX34H)Home Depot100607961
cichą barierą&nieśmiały; Materiał dźwiękoszczelny HD (arkusz) (PSAsoundproofcow.com10203041
Zwijany panel z pianki akustycznejsoundproofcow.com10432400
izolowany stymulator impulsów Model 2100AM SystemsAparat cyfrowy 720000
- Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometr 10 MHz Jednokanałowy oscyloskopSinometrCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
potencjometr 5k ohmAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-do-130-decybelowy cyfrowy miernik poziomu dźwiękuExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Podwójne wyjście, zaszyfrowane szokerKinder Scientific Co
203525863 Narzędzia głowic AM

Bibliografia

  1. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
  2. Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall for fear extinction in PTSD: results of a twin study. J Psychiat Res. 42 (7), 515-520 (2008).
  3. Jovanovic, T., Norrholm, S. D., Blanding, N. Q., Davis, M., Duncan, E., Bradley, B., Ressler, K. J. Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety. 27 (3), 244-251 (2010).
  4. Norrholm, S. D., et al. Fear extinction in traumatized civilians with posttraumatic stress disorder: relation to symptom severity. Biol Psychiat. 69 (6), 556-563 (2011).
  5. Phelps, E. A., LeDoux, J. E. Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron. 48 (2), 175-187 (2005).
  6. Pape, H. C., Paré, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  7. Engineer, N. D., et al. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470 (7332), 101-104 (2011).
  8. Porter, B. A., et al. Repeatedly pairing vagus nerve stimulation with a movement reorganizes primary motor cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2365-2374 (2012).
  9. Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. 45, 3097-3100 (2014).
  10. Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehab Neural Re. 28 (7), 698-706 (2014).
  11. Clark, K. B., Krahl, S. E., Smith, D. C., Jensen, R. A. Post‐training unilateral vagal stimulation enhances retention performance in the rat. Neurobiol Learn Mem. 63 (3), 213-216 (1995).
  12. Clark, K. B., Smith, D. C., Hassert, D. L., Browning, R. A., Naritoku, D. K., Jensen, R. A. Posttraining electrical stimulation of vagal afferents with concomitant vagal efferent inactivation enhances memory storage processes in the rat. Neurobiol Learn Mem. 70 (3), 364-373 (1998).
  13. Clark, K. B., Naritoku, D. K., Smith, D. C., Browning, R. A., Jensen, R. A. Enhanced recognition memory following vagus nerve stimulation in human subjects. Nat. Neurosci. 2, 94-98 (1999).
  14. McGaugh, J. L. amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences. Annu Rev Neurosci. 27, 1-28 (2004).
  15. McGaugh, J. L., Roozendaal, B. Role of adrenal stress hormones in forming lasting memories in the brain. Curr Opin Neurobiol. 12, 205-210 (2002).
  16. Miyashita, T., Williams, C. L. Epinephrine administration increases neural impulses propagated along the vagus nerve: Role of peripheral beta-adrenergic receptors. Neurobiol Learn Mem. 85 (2), 116-124 (2006).
  17. Williams, C. L., Men, D., Clayton, E. C., Gold, P. E. Norephinephrine release in the amygdala after systemic injection of epinephrine or escapable footshock: contribution of the nucleus of the solitary tract. Behavioral Neurosci. 112 (6), 1414-1422 (1998).
  18. Liang, K. C., Juler, R. G., McGaugh, J. L. Modulating effects of post-training epinephrine on memory: involvement of the amygdala noradrenergic system. Brain Res. 368 (1), 125-133 (1986).
  19. Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biol Psychiat. 73 (11), 1071-1077 (2013).
  20. Peña, D. F., Childs, J. E., Willett, S., Vital, A., McIntyre, C. K., Kroener, S. Vagus nerve stimulation enhances extinction of conditioned fear and modulates plasticity in the pathway from the ventromedial prefrontal cortex to the amygdala. Front Behav Neurosci. 8 (327), (2014).
  21. Maren, S. Overtraining does not mitigate contextual fear conditioning deficits produced by neurotoxic lesions of the basolateral amygdala. J Neurosci. 18 (8), 3088-3097 (1998).
  22. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psych. 67 (3), 370-375 (1969).
  23. Maroun, M. Stress reverses plasticity in the pathway projecting from the ventromedial prefrontal cortex to the basolateral amygdala. Eur J Neurosci. 24 (10), 2917-2922 (2006).
  24. Moussawi, K., et al. N-Acetylcysteine reverses cocaine-induced metaplasticity. Nat Neurosci. 12, 182-189 (2009).
  25. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol. Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  26. Aalbers, M., Vles, J., Klinkenberg, S., Hoogland, G., Majoie, M., Rijkers, K. Animal models for vagus nerve stimulation in epilepsy. Exp Neurol. 230 (2), 167-175 (2011).
  27. Ricardo, J. A., Koh, E. T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res. 153, 1-26 (1978).
  28. Takigawa, M., Mogenson, G. J. A study of inputs to antidromically identified neurons of the locus coeruleus. Brain Res. 135 (2), 217-230 (1977).
  29. Groves, D. A., Bowman, E. M., Brown, V. J. Recordings from the rat locus coeruleus during acute vagal nerve stimulation in the anaesthetised rat. Neurosci Lett. 379 (3), 174-179 (2005).
  30. Manta, S., Dong, J., Debonnel, G., Blier, P. Enhancement of the function of rat serotonin and norepinephrine neurons by sustained vagus nerve stimulation. J Psychiatr Neurosci. 34 (4), 272-280 (2009).
  31. Manta, S., El Mansari, M., Debonnel, G., Blier, P. Electrophysiological and neurochemical effects of long-term vagus nerve stimulation on the rat monoaminergic systems. Int J Neuropsychoph. 16 (2), 459-470 (2013).
  32. Dorr, A. E., Debonnel, G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 318, 890-898 (2006).
  33. Follesa, P., et al. Vagus nerve stimulation increases norepinephrine concentration and the gene expression of BDNF and bFGF in the rat brain. Brain Res. 1179 (7), 28-34 (2007).
  34. Biggio, F., et al. Chronic vagus nerve stimulation induces neuronal plasticity in the rat hippocampus. Int J Neuropsychoph. 12 (9), 1209-1221 (1017).
  35. Nichols, J. A., Nichols, A. R., Smirnakis, S. M., Engineer, N. D., Kilgard, M. P., Atzori, M. Vagus nerve stimulation modulates cortical synchrony and excitability through the activation of muscarinic receptors. Neuroscience. 189, 207-214 (2011).
  36. Peters, J., Kalivas, P. W., Quirk, G. J. Extinction circuits for fear and addiction overlap in prefrontal cortex. Learn Memory. 16, 279-288 (2009).
  37. Ji, J., Maren, S. Hippocampal involvement in contextual modulation of fear extinction. Hippocampus. 17 (9), 749-758 (2007).
  38. Roosevelt, R. W., Smith, D. C., Clough, R. W., Jensen, R. A., Browning, R. A. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 1119 (1), 124-132 (2006).
  39. Hassert, D. L., Miyashita, T., Williams, C. L. The effects of peripheral vagal nerve stimulation at a memory-modulating intensity on norepinephrine output in the basolateral amygdala. Behav Neurosci. 118 (1), 79-88 (2004).
  40. Ura, H., et al. Vagus nerve stimulation induced long-lasting enhancement of synaptic transmission and decreased granule cell discharge in the hippocampal dentate gyrus of urethane-anesthetized rats. Brain Res. 1492, 63-71 (2013).
  41. Zuo, Y., Smith, D. C., Jensen, R. A. Vagus nerve stimulation potentiates hippocampal LTP in freely-moving rats. Physiol Behav. 90 (4), 583-589 (2007).
  42. Shen, H., Fuchino, Y., Miyamoto, D., Nomura, H., Matsuki, N. Vagus nerve stimulation enhances perforant path-CA3 synaptic transmission via the activation of β-adrenergic receptors and the locus coeruleus. Int J Neuropsychophl. 15 (4), 523-530 (2012).
  43. Fibiger, H. C., Mason, S. T. The effects of dorsal bundle injections of 6-hydroxydopamine on avoidance responding in rats. Bitr J Pharmacol. 64 (4), 601-605 (1978).
  44. Mason, S. T. Fibiger H.C. 6-OHDA lesion of the dorsal noradrenergic bundle alters extinction of passive avoidance. Brain Res. 152, 209-214 (1978).
  45. McGaugh, J. L. Memory consolidation and the amygdala: a systems perspective. Trends Neurosci. 25 (9), 456-461 (2002).
  46. LaLumiere, R. T., Niehoff, K. E., Kalivas, P. W. The infralimbic cortex regulates the consolidation of extinction after cocaine self-administration. Learn Memory. 17, 168-175 (2010).
  47. Mueller, D., Cahill, S. P. Noradrenergic modulation of extinction learning and exposure therapy. Behav Brain Res. 208 (1), 1-11 (2010).
  48. Smith, R. J., Aston-Jones, G. α(2) Adrenergic and imidazoline receptor agonists prevent cue-induced cocaine seeking. Biol Psychiat. 70 (8), 712-719 (2011).
  49. Buffalari, D. M., Baldwin, C. K., See, R. E. Treatment of cocaine withdrawal anxiety with guanfacine: relationships to cocaine intake and reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacol. (Berl). 223 (2), 179-190 (2012).
  50. De Ridder, D., Vanneste, S., Engineer, N. D., Kilgard, M. P. Safety and efficacy of vagus nerve stimulation paired with tones for the treatment of tinnitus: a case series). Neuromodulation. 17 (2), 170-179 (2014).
  51. Hays, S. A., et al. The timing and amount of vagus nerve stimulation during rehabilitative training affect poststroke recovery of forelimb strength. Neuroreport. 25, 676-682 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Warunkowanie s uchowe strachukora infralimbicznaboczna cz cia a migda owategoplastyczno synaptycznaimplantacja elektrodprocedura chirurgicznatrening behawioralnykonsolidacja pami ci

Powiązane artykuły