Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.

Streszczenie

Subpopulacje mikrobiologiczne w badaniach terenowych i laboratoryjnych wykazały wysoką niejednorodność parametrów morfologicznych i fizjologicznych. Określenie stanu komórki drobnoustrojów w czasie rzeczywistym wykracza poza kategorie żywe lub martwe, ponieważ drobnoustroje mogą istnieć w stanie uśpienia, w którym podział komórek i aktywność metaboliczna są zmniejszone. Biorąc pod uwagę potrzebę wykrywania i kwantyfikacji drobnoustrojów, cytometria przepływowa (FCM) z sondami molekularnymi zapewnia szybką i dokładną metodę pomagającą określić ogólną żywotność populacji. Stosując SYTOX Green i SYTOX Orange w modelowym mikrocyjanobakterii Microcystis aeruginosa do wykrywania integralności błony, opracowujemy przenośną metodę szybkiego wskazywania śmiertelności pojedynczych komórek. Sondy molekularne używane w tym czasopiśmie będą określane odpowiednio jako zielone lub pomarańczowe sondy kwasów nukleinowych (chociaż istnieją inne produkty o podobnych długościach fal wzbudzenia i emisji, które mają porównywalne sposoby działania, w szczególności odnosimy się do wyżej wymienionych sond). Protokoły wykorzystujące sondy molekularne różnią się w zależności od gatunku, różniąc się głównie stężeniem i czasem inkubacji. Zgodnie z tym protokołem określonym na M.aeruginosa, zielona sonda kwasu nukleinowego została zoptymalizowana do stężeń 0,5 μM po 30 minutach inkubacji, a pomarańczowa sonda kwasu nukleinowego do 1 μM po 10 minutach. W obu sondach stężenia mniejsze od deklarowanego optymalnego prowadziły do niedostatecznego zgłaszania komórek z uszkodzeniem błony. I odwrotnie, stężenia 5 μM i wyższe w obu sondach wykazywały rodzaj niespecyficznego barwienia, w którym "żywe" komórki wytwarzały docelową fluorescencję, co prowadziło do nadreprezentacji "niezdolnych do życia" liczb komórek. Kontrole dodatnie (zabite termicznie) dostarczyły możliwej do przetestowania martwej biomasy, chociaż adekwatność wytwarzania kontroli pozostaje przedmiotem dyskusji. Demonstrując logiczną sekwencję kroków do optymalizacji zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych, pokazujemy, jak stworzyć protokół, który można wykorzystać do skutecznej analizy stanu fizjologicznego sinic.

Wprowadzenie

Komórka jest złożonym systemem, który nieustannie reaguje na środowisko, modyfikując parametry fizjologiczne i zmieniając swoją funkcję. Na dynamikę populacji drobnoustrojów izogenicznych zarówno w przyrodzie, jak i w laboratorium wpływa rozwój subpopulacji, zachodzących nawet w względnie stałych warunkach środowiskowych ^1-3. Zmienność naturalnych zbiorowisk mikroorganizmów wynika z bardzo zmiennego charakteru warunków środowiskowych. Te czasami stochastyczne procesy prowadzą następnie do powstania subpopulacji, które bardzo różnią się od średniej populacji. Ostatnie dowody wykazały, że te fizjologiczne subpopulacje reagują inaczej na ....

Protokół

1. Przygotowanie sondy molekularnej i cytometru przepływowego

1. Rozcieńczone roztwory podstawowe sond kwasów nukleinowych, które są dostarczane w postaci 5 mM roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO) do podwielokrotności wymaganych stężeń w ultraczystym przefiltrowanym_H2O.
2. Przechowuj sondy kwasów nukleinowych w ciemnych warunkach w temperaturze od -5 ^oC do -25 ^oC do czasu użycia.
3. Włącz cytometr przepływowy i załaduj pakiet oprogramowania (patrz tabela materiałów/sprzętu, aby zapoznać się ze specyfikacjami FCM).
4. Umieść pustą probówkę do hemolizy (12 x 75 mm) na sondzie iniekcyjnej próbki (SIP), kliknij....

Wyniki

Wyjścia dla rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia światła pod kątem (SSC) z hodowli okresowej M.aeruginosa w fazie wykładniczej dostarczają odpowiednio informacji o rozmiarze komórek (średnicy) oraz ich ziarnistości wewnętrznej (Rysunek 1A). FSC pozwala odróżnić komórki, które są zbyt duże i/lub zbyt małe, aby być M.aeruginosa. Takie odróżnianie, czyli bramkowanie (gating), można przeprowadzić poprzez zawężenie danych pomiędzy określonymi pun.......

Dyskusja

Zwiększona liczba publikacji z wykorzystaniem sond molekularnych wskazuje, że można uzyskać wiarygodne i pouczające dane 5,6,8-15,19,22,23. Jak dotąd nie ma idealnego barwienia dla żywotności komórek, które mogłoby być skuteczne u wszystkich gatunków przy tym samym stężeniu i czasie inkubacji^6,10. Nawet ten sam typ sondy ze zmienioną emisją fluorescencji wykazuje potrzebę ustalenia prawidłowego stężenia i czasu inkubacji (tabele 1 i 3). Jak widać przy użyciu te.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka cyjanobakterii	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Skoncentrowany roztwór słodkowodny (rozcieńczenie x50)
Płyn odkażający	BD Biosciences	653155	Uruchom przez 2 minuty, gdy wydajność jest większa niż 12 zdarzeń na sekundę na szybko lub przy natężeniu przepływu 66 &mikro; l/min.  Następnie 2 min osłony H2O.
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	na żądanie	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Barwienie kwasem nukleinowym – 5 mM roztwór w DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Barwienie kwasem nukleinowym – 5 mM roztwór w DMSO