Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Podsumowanie

Kontrolowanie ekspresji białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żyjącego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Przedstawiony protokół przedstawia zastosowanie interferencji przeciwciał w komórkach ssaków, w tym w pierwotnych neuronach hipokampa, a także demonstruje zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji w badaniu funkcji białek.

Streszczenie

Ścisłe zarządzanie ekspresją białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żywego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Dlatego w ostatnich badaniach wynaleziono różne narzędzia do celowania w ekspresję białek w liniach komórkowych ssaków, a nawet w modelach zwierzęcych, w tym interferencję RNA i przeciwciał. Podczas gdy pierwsza strategia przyciągnęła wiele uwagi w ciągu ostatnich dwóch dekad, peptydy pośredniczące w translokacji ładunków przeciwciał przez błony komórkowe do komórek spotkały się ze znacznie mniejszym zainteresowaniem. W tej publikacji przedstawiamy szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać nośnik peptydu o nazwie Chariot w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych, a także w pierwotnych neuronach hipokampa do przeprowadzania eksperymentów interferencji przeciwciał i dalszego ilustrowania zastosowania trójwymiarowych rekonstrukcji w analizie funkcji białka. Nasze odkrycia sugerują, że Chariot, prawdopodobnie ze względu na swój sygnał lokalizacji jądrowej, jest szczególnie dobrze przystosowany do docelowych białek znajdujących się w somie i jądrze. Co ciekawe, po zastosowaniu Chariot do pierwotnych kultur hipokampa, odczynnik okazał się zaskakująco dobrze akceptowany przez zdysocjowane neurony.

Wprowadzenie

Ścisła kontrola ekspresji białek jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, aby mógł kierować swoim własnym rozwojem, jak również reagować na sygnały środowiskowe. W związku z tym w trakcie ewolucji wynaleziono wiele mechanizmów, które precyzyjnie regulują poziom ekspresji każdego białka kodowanego przez ok. 20 000 genów istniejących w dowolnej komórce eukariotycznej w danym momencie jej życia. Mechanizmy regulacyjne, zachodzące na różnych etapach produkcji białek, obejmują zarządzanie strukturą chromatyny, transkrypcję i obsługę RNA, a także kierunek potranslacyjnych modyfikacji białek, transportu i degradacji.

Nie jest więc zaskakujące, że nieprawidłowe działanie podstawowych mechanizmów molekularnych i zmienione poziomy ekspresji białek były związane z różnymi chorobami, takimi jak rak czy niepełnosprawność intelektualna. Rzeczywiście, patrząc na wyjątkową złożoność rozwoju neuronów i funkcji mózgu ssaków, wrażliwość tych wyrafinowanych systemów na zmiany w ekspresji białek przejawia się w kilku dobrze znanych deficytach intelektualnych, w tym chorobie Alzheimera i Parkinsona (AD i PD), a także zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD), takich jak zespół łamliwego chromosomu X (FXS). Ta ostatnia choroba charakteryzuje się rozległą nieprawidłową ekspresją różnych białek, co jest spowodowane utratą pojedynczego białka regulującego translację, FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein)^1-4. Co więcej, rearanżacje chromosomów wpływające na białko A sprzężone ze zmiennym ładunkiem x (VCXA), białko, które zarządza stabilnością i translacją mRNA poprzez modyfikację limitu^{mRNA 5}, były ostatnio związane z deficytami intelektualnymi, podczas gdy mutacje punktowe nie zostały zidentyfikowane u pacjentów z niepełnosprawnością poznawczą ^6,7, co sugeruje, że obserwowane upośledzenie umysłowe wynika ze zmienionej ekspresji VCXA i rozregulowanej ekspresji jego docelowych białek. Zgodnie z tymi odkryciami, badanie badające, czy zmiany liczby kopii de novo genów są związane z ASD, ustaliło, że duplikacje i delecje nowych genów są znaczącym czynnikiem ryzyka ASD⁸, wspierając w ten sposób ideę, że podwyższony lub zmniejszony poziom ekspresji białek może powodować deficyty intelektualne.

Co ciekawe, ostatnie badania dostarczyły dalszych dowodów na to, że poziom ekspresji danego białka jest precyzyjnie dostosowany, aby zapobiec jego agregacji w wyniku dużej ilości białka przy prawie zerowym marginesie bezpieczeństwa⁹. W związku z tym zaproponowano, że nawet małe przyrosty są wystarczające do wywołania chorób takich jak AD i PD⁹. Chociaż różnorodność mechanizmów molekularnych przyczyniających się do kontroli ekspresji białek sugeruje złożony schemat regulacji w świetle tych ustaleń, badanie badające poziom ekspresji ponad 5000 genów ssaków¹⁰ wykazało, że natura preferowała bardziej oszczędny schemat: wykazano, że obfitość białek w komórkach jest głównie regulowana na poziomie translacji¹⁰, co ilustruje, że zarządzanie dostępnością RNA służy głównie precyzyjnemu dostrojeniu ekspresji białek.

Badanie dawki interesujących białek (POI) jest zatem nie tylko ważne dla zrozumienia endogennych funkcji białka, ale także dla badania wielu chorób i rozwoju terapii. W związku z tym w ostatnich dziesięcioleciach nastąpił postęp w kilku strategiach wykorzystujących interferencję RNA do manipulowania dawką POI. Chociaż interferencja RNA jest szeroko stosowana do badania funkcji białek, a nawet jest stosowana w badaniach klinicznych w leczeniu raka lub chorób oczu, a także w leczeniu przeciwwirusowym u pacjentów^{w wieku 11-13} lat, mogą pojawić się pewne trudności, które mogą uniemożliwić realizację tej strategii. Na przykład sekwencja zalążkowa, która napędza knockdown przez homologię, jest porównywalnie krótka, co sprzyja efektom off-target. Ponieważ wysoce wydajne sekwencje są rzadkie i muszą być znalezione spośród tysięcy opcji (omówionych w ¹⁴), zidentyfikowanie właściwej sekwencji może być czasochłonne i kosztowne, ale wyniki mogą być nadal rozczarowujące.

Alternatywną strategią jest bezpośrednie celowanie przeciwciałami w POI. W tym miejscu ilustrujemy zastosowanie nośnika białkowego Chariot (produkowanego przez Active Motif) w celu zmniejszenia dostępności białek komórkowych oraz zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji do badania funkcji białek po knock-down.

Aktywny motyw Rydwanu, sam w sobie peptyd o masie 2,8 kDa, jest używany do transportu peptydów, białek i przeciwciał przez błony komórek ssaków¹⁵. Peptyd wiąże się z POI, tworząc niekowalencyjnie sprzężone kompleksy makromolekularne wykorzystujące oddziaływania hydrofobowe, po czym kompleksy Chariot-POI są internalizowane do komórek w sposób niezależny od endosomów. Co ważne, wykazano, że Chariot nie wpływa ani na wewnątrzkomórkową lokalizację transportowanych białek, ani nie wywiera efektów cytotoksycznych, ani nie wpływa na aktywność biologiczną swojego ładunku¹⁵.

Protokół

1. Roztwory magazynowe

1. Zawiesić liofilizowany proszek z motywem aktywnym w sterylnym_H2Odo końcowego stężenia 2 μg/μl. Ostrożnie postukać w celu wymieszania.
2. Przygotować małe porcje (np. po 12 μl każdy, wymagane są 2 μl na reakcję) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie komórek

1. Komórki nasienne ssaków, takie jak komórki HEK293 lub neurony pierwotne na 24-dołkowej płytce w pożywce wzrostowej o pojemności 500 μl, w tym antybiotyki.
   UWAGA: Używając neuronów, wysiewaj komórki o niskiej gęstości i używaj tylko dwóch środkowych rzędów płytki 24-dołkowej. Każda studzienka będzie zatem miała pusty odpowiednik, w którym będzie przechowywana pożywka podczas inkubacji (krok 4.2). Podczas pracy z neuronami należy zawsze upewnić się, że komórki nie są trzymane poza inkubatorem dłużej niż kilka minut.
2. Hodować komórki w odpowiednich warunkach (nawilżone, 5%_CO2 i 37 °C), aż komórki zlewają się w około 50%.
   UWAGA: W przypadku korzystania z neuronów należy hodować komórki aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju i zmieniać ok. 25-50% pożywki dwa razy w tygodniu. Podłoże: Pożywka neuropodstawowa (zawierająca 1x B27, 5 mM L-glutaminy i 1x penicylinę i streptomycynę; porównaj z odnośnikiem 16).

3. Formacja kompleksu rydwanów

1. Na reakcję rozcieńczyć 0,1-2 μg POI lub odpowiadającego mu przeciwciała, a także odpowiednio białka kontrolnego lub przeciwciała kontrolnego w 50 μl PBS.
   UWAGA: Technika ta działa również w przypadku kompleksów makromolekularnych składających się z wstępnie związanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych (por. "Reprezentatywne wyniki", ryc. 1). Wymieszaj i odwiruj.
2. Dla każdej próbki rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego Chariot w 50 μl PBS za pomocą oddzielnych probówek, aby uniknąć samoasocjacji Chariot. Wymieszaj i odwiruj.
3. Przenieść rozcieńczony punkt POI lub przeciwciało (krok 3.1) do rozcieńczenia rydwanu za pomocą pipetowania. Wymieszaj i odwiruj.
4. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej (utworzą się kompleksy Chariot-POI).

4. Transfekcja komórek

1. Rozcieńczyć kompleksy rydwanu (krok 3.4) w 100 μl wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (37 °C, bez dodatków). Usuń pożywkę i umyj komórki za pomocą wstępnie podgrzanego 1x PBS.
   UWAGA: Podczas korzystania z neuronów nie wyrzucaj pożywki, zostanie ona ponownie użyta. Przechowywać w temperaturze 37 °C. Do prania użyj PBS zawierającego 0,5 mM MgCl₂ i CaCl₂,
   Sugestia: trzymaj pożywkę w pustych studzienkach podczas inkubacji płytki (krok 4.5).
2. Nanieść złożony roztwór Chariot (krok 4.1) na komórki i delikatnie wstrząsnąć komórkami, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu. Hoduj komórki w standardowych warunkach (krok 2.2) przez 1 godzinę. Dodaj serum do końcowego stężenia 10%. W przypadku korzystania z neuronów dodaj pożywkę z kroku 4.1. Hoduj komórki jeszcze przez 1 do 2 godzin.
   UWAGA: Optymalny czas inkubacji zależy od wielkości i właściwości ładunku i może wymagać empirycznego dostosowania. Następujące sugestie mogą służyć jako wskazówka: W przypadku peptydów zwykle wystarcza 1 godzina, w przypadku białek zaleca się 1-2 godziny, w przypadku przeciwciał 2 godziny, a w przypadku transfekcji neuronów przeciwciałami 4 godziny.
3. Przetwarzaj komórki do analizy jak zwykle. Uwaga: technika jest kompatybilna z eksperymentami z wykorzystaniem protokołów fiksacji, a także obrazowania na żywo.

5. Obrazowanie

1. Za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego wykonaj stosy z komórek i/lub przedziałów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, korzystając z odległości około 0,25-0,5 μm. Dokładny rozstaw warstw zależy od wielkości konstrukcji, która ma być zrekonstruowana i należy ją określić indywidualnie.

6. Rekonstrukcja

1. W kolejnych krokach użyj Esc na dole, aby przełączać się między Select i Navigate, Cntr aby wybrać wiele obiektów, klikając je i Shift, aby wyciąć obiekty (por. krok 6.10).
2. Otwórz plik lsm w Imaris.
3. Korzystając z dopasowania wyświetlania dla każdego kanału, skontrastuj obraz, aż najjaśniejsze struktury osiągną nasycenie. Należy pamiętać, że ta regulacja nie wpłynie na konstrukcję powierzchni, służy jedynie do pomocy eksperymentatorowi w progowaniu obrazu.
4. Kliknij ikonę Dodaj nowe powierzchnie. Otworzy się kreator.
5. Wybierz: Podziel na segmenty tylko obszar zainteresowania. Przejdź do następnego kroku.
6. Dostosuj marginesy pola wyboru, aby dopasować je do interesującego Cię obiektu. Należy pamiętać, że obraz ma 3 wymiary i że zaznaczenie należy dostosować również w płaszczyźnie z. Jeśli prostokątny kształt pola wyboru nie powinien prawidłowo pasować do interesującego go obiektu, obróć obiekt i/lub powiększ pole, aż zostaną osadzone wszystkie wymagane struktury. Niepożądane obiekty mogą zostać usunięte później (por. krok 6.10). Postąpić.
7. Wybierz odpowiedni kanał. Poziom szczegółowości powierzchni lub średnica kuli powinny być ustawione tak, aby odpowiadały rekonstruowanym strukturom. W zależności od charakterystyki sygnału można użyć intensywności bezwzględnej lub kontrastu lokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, kontrast lokalny działa lepiej w przypadku sygnałów rozproszonych. W każdym przypadku ustawienia należy dostosować osobno dla każdego sygnału lub struktury będącej przedmiotem zainteresowania.
8. Za pomocą narzędzia Thresholding (Progowanie) zrekonstruuj interesującą Cię strukturę.
9. Zakończ rekonstrukcję, klikając zieloną strzałkę na dole.
10. Dostosuj obiekt dalej za pomocą narzędzia ołówka, aby wyciąć i usunąć powierzchnie zgodnie z wymaganiami. Możliwe jest cięcie tylko w kierunku północ-południe, dlatego należy przechylić obraz, aby przyciąć żądany obiekt.
11. Uzyskaj pomiary objętości, powierzchni i intensywności dla każdej powierzchni, wybierając Statystyki, Statystyki szczegółowe i Wartości średnie.
12. (Krok opcjonalny) Aby obserwować statystyki oznaczone kolorami (por. Rysunek 2E i F), wybierz zakładkę koloru odpowiedniej powierzchni i zaznacz "Kod statystyczny" zamiast "Podstawa". Zostanie wyświetlonych kilka opcji.

Wyniki

W poniższych akapitach przedstawiono przykładowe wyniki ilustrujące funkcjonalne znokautowanie POI (Simiate, więcej szczegółów proszę znaleźć w ^16,17) przy użyciu odczynnika Chariot i interferencji przeciwciał. Wyniki pokazują, że zmniejszona ekspresja Simiate upośledza aktywność transkrypcyjną i, w sposób zależny od dawki, indukuje apoptozę, osiągając śmiertelność przekraczającą 99% w przypadku zastosowania wyższych ilości przeciwciał (> 1 μg przeciwciała) (odkrycia te zostały opublik...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół do badania znaczenia poziomów ekspresji białek w kontrolowaniu funkcji komórkowych w sposób zależny od dawki. Opisany protokół pozwala na precyzyjną manipulację ekspresją białek w różnych typach komórek ssaków, w tym w neuronach hipokampa, ułatwiając w ten sposób szczegółowe badania funkcji białek na poziomie komórkowym.

Chociaż interferencja RNA stanowi dobrze znaną strategię obniżania poziomu punktów POI, ma ona swoje wady (por. ¹⁴). Nie tylko ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rydwan	Active Motif	30025	sklep pod adresem -20 ° C
Neurobasal medium	Technologie życia	21103-049	rozgrzej do 37 & deg; C przed użyciem
1x B27	Life technologies	17504044	przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
L-glutamina	Life technologies	25030-149	sklep pod adresem -20 & deg; C
Penicylina i Streptomycyna	Technologie życia	15140-122	sklep pod adresem -20 & deg; C
Imaris software	Bitplane	n.a.	drogi, ale bezkonkurencyjny
laserowy mikroskop skaningowy	Zeiss	n.d.