Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.
Artykuł metodologiczny
Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to złożona siatka usieciowanych białek, która dostarcza biofizycznych i biochemicznych wskazówek, które są głównymi regulatorami proliferacji komórek, przetrwania, migracji, itp. ECM odgrywa ważną rolę w rozwoju i różnych patologiach, w tym chorobach sercowo-naczyniowych i mięśniowo-szkieletowych, zwłóknieniach i nowotworach. W związku z tym scharakteryzowanie składu ECM w tkankach prawidłowych i chorych może doprowadzić do identyfikacji nowych biomarkerów prognostycznych i diagnostycznych oraz potencjalnych nowych celów terapeutycznych. Jednak sama natura białek ECM (dużych rozmiarów, usieciowanych i kowalencyjnie związanych, silnie glikozylowanych) sprawiła, że analizy biochemiczne ECM stały się wyzwaniem. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy metodę wzbogacania ECM ze świeżych lub zamrożonych tkanek i guzów, która wykorzystuje nierozpuszczalność białek ECM. Opisujemy tutaj szczegółowo procedurę decelularyzacji, która polega na sekwencyjnych inkubacjach w o różnym pH oraz stężeniach soli i detergentów, a która skutkuje 1) ekstrakcją białek wewnątrzkomórkowych (cytozolowych, jądrowych, błonowych i cytoszkieletowych) oraz 2) wzbogaceniem białek ECM. Następnie opisujemy, jak deglikozylować i trawić preparaty białkowe wzbogacone w ECM na peptydy do późniejszej analizy za pomocą spektrometrii mas.
Wprowadzenie
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to złożona siatka usieciowanych i glikozylowanych białek, która zapewnia architektoniczne wsparcie i zakotwiczenie dla komórek oraz częściowo określa właściwości biomechaniczne tkanek1,2. Białka ECM również sygnalizują komórkom albo bezpośrednio przez ich receptory (np. integryny, syndekanów itp.), albo poprzez modulację sygnalizacji czynnika wzrostu3. ECM dostarcza zatem biofizycznych i biochemicznych wskazówek, które są głównymi regulatorami procesów komórkowych, takich jak proliferacja, przetrwanie, polaryzacja, różnicowanie, migracja itp.
ECM odgrywa kluczową rolę w fizjologii, rozwoju i starzeniu się4. Ponadto kilka patologii, takich jak choroby sercowo-naczyniowe, zwłóknienie, choroby mięśniowo-szkieletowe, nowotwory, są spowodowane zmianami ECM lub powodują je. Co więcej, ECM przyczynia się do utrzymania nisz komórek macierzystych, a identyfikacja kluczowych cząsteczek ECM, które wspierają łodygę, będzie miała bezpośrednie zastosowanie w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej5. Jednak pomimo swojego znaczenia, ECM pozostawał, aż do niedawna, niedostatecznie zbadany6.
Analiza in silico wykazała, że matrisom, zdefiniowany jako zespół ECM i białek związanych z ECM, zawiera produkty kilkuset genów zarówno w genomie człowieka, jak i myszy1,7,8. Jednak nierozpuszczalność białek ECM utrudnia systematyczne charakteryzowanie składu matryc zewnątrzkomórkowych in vivo próbek normalnych i patologicznych. Niedawno wykazaliśmy, że tę nierozpuszczalność można obrócić na korzyść i wykorzystać do wzbogacenia białek ECM 8-10. My i inni wykazaliśmy ponadto, że spektrometria mas była metodą z wyboru do scharakteryzowania składu ECM 8-10, 13.
Opisujemy tutaj procedurę decelularyzacji, która składa się z sekwencyjnych inkubacji w o różnym pH oraz stężeniach soli i detergentów. Procedura ta prowadzi do ekstrakcji (lub zubożenia) białek cytozolowych, jądrowych, błonowych i cytoszkieletowych oraz wzbogacenia białek ECM. Następnie opisujemy, jak trawić preparaty białkowe wzbogacone w ECM na peptydy w celu późniejszej analizy za pomocą spektrometrii mas.
Korzystając z procedur opisanych i zilustrowanych tutaj, udało nam się wzbogacić i scharakteryzować za pomocą spektrometrii mas matryce zewnątrzkomórkowe z dziesięciu różnych tkanek i typów nowotworów: normalne płuco myszy8, okrężnica ludzka i mysie8,9, wątroba ludzka9, ludzkie guzy jelita grubego i pochodne przerzuty do wątroby9, ksenoprzeszczepy czerniaka8, ksenoprzeszczepy guza sutka10, mysie wyspy trzustkowe i mysie insulinoma (Naba i wsp., niepublikowane). Porównanie różnych matrysomów ujawniło specyficzne dla tkanek i nowotworów sygnatury ECM, które można dalej wykorzystać jako potencjalne biomarkery diagnostyczne lub prognostyczne .
Wierzymy, że ta procedura może być zastosowana do innych próbek bez modyfikacji lub bez nich lub z ich względnie niewielkimi zmianami.
Protokół
UWAGA: Procedura może być przeprowadzona na świeżych lub błyskawicznie zamrożonych tkankach. Zalecamy perfuzję silnie unaczynionych tkanek za pomocą PBS w czasie sekcji w celu wyeliminowania czerwonych krwinek i białek osocza. Nie zalecamy przeprowadzania zabiegu na utrwalonych tkankach, ponieważ utrwalenie (tj. sieciowanie chemiczne) zakłóca decelularyzację, a także może znacznie zagrozić późniejszej analizie spektrometrii mas. Do całej procedury zalecamy stosowanie probówek o niskiej retencji i końcówek do pipet, aby zmaksymalizować odzysk białka i peptydów.
1. Decelularyzacja tkanek lub guzów
UWAGA: Zanim zaczniesz, przygotuj odczynniki i dodaj inhibitory proteazy (dostarczone z zestawem do ekstrakcji białek kompartmentowych) do żądanej objętości każdego buforu. Wszystkie i próbki powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas trwania doświadczenia, z wyjątkiem buforu CS, który musi być utrzymywany w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się SDS.
UWAGA: Protokół wykorzystuje serię inkubacji w o różnym pH i zawierających różną ilość soli i detergentów w celu sekwencyjnej ekstrakcji białek wewnątrzkomórkowych i wzbogacenia o nierozpuszczalne białka ECM (Rysunek 1, Tabela 1; patrz również Dyskusja na temat alternatyw dla stosowania zestawu komercyjnego szczegółowo opisanego tutaj). Objętości odczynników podane poniżej dotyczą 100 mg tkanek lub guzów (patrz Tabela 1) i muszą zostać odpowiednio dostosowane.
- Homogenizować 100 mg tkanki w 500 μl buforu C zawierającego inhibitory proteazy za pomocą homogenizatora tkankowego, aż do całkowitego rozerwania tkanki i uzyskania jednorodnej zawiesiny.
UWAGA: Dodać deoksyrybonukleazę I (stężenie końcowe: 200 μg/ml, rozpuszczoną zgodnie z instrukcjami producenta) i rybonukleazę A (stężenie końcowe: 20 μg/ml, rozpuszczoną zgodnie z instrukcjami producenta) do buforu N. - Sekwencyjna ekstrakcja wewnątrzkomórkowych białek rozpuszczalnych
- Ekstrakcja białek cytozolowych. Inkubować homogenat na rotatorze probówkowym przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zachować małą porcję (10 μl do 20 μl) homogenatu do późniejszej analizy western blot (patrz punkt "Oczekiwane wyniki" i rysunek 2).
- Odwirować homogenat w stężeniu 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do czystej probówki, która będzie stanowić frakcję cytozolową (C) analizy western blot. Błyskawiczne zamrożenie tej frakcji i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
- W celu przemycia, zawiesić osad w 400 μl buforu W zawierającego inhibitory proteazy i inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować homogenat przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- W celu ekstrakcji białek jądrowych należy ponownie zawiesić osad w 150 μl buforu N zawierającego inhibitory proteazy, dezoksyrybonukleazę I i rybonukleazę A, a następnie inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do czystej probówki. Powtórz ten krok raz: po odwirowaniu próbki po raz drugi, dodaj supernatant do poprzedniego supernatantu: będzie to stanowić frakcję jądrową (N) analizy western blot. Błyskawiczne zamrożenie tej frakcji i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Następnie wykonaj pranie zgodnie z krokiem 1.2.3.
- W celu ekstrakcji białek błonowych należy ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu M zawierającego inhibitory proteazy i inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C
- Zebrać supernatant w czystej probówce: będzie on stanowił frakcję membranową (M) w analizie western blot. Błyskawiczne zamrożenie tej frakcji i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
- Aby wyekstrahować białka cytoszkieletu, należy ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu CS zawierającego inhibitory proteazy i inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 30 minut w temperaturze RT.
Należy pamiętać, że osad nie rozpuści się całkowicie. Sugerujemy rozerwanie granulki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż do zaobserwowania przerwania osadu. - Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant do czystej probówki. Zwróć uwagę w tym miejscu na dalszy wyraźny spadek rozmiaru granulki (patrz wideo).
- Zawiesić osad w 150 μl buforu C zawierającego inhibitory proteazy i inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać supernatant i dodać go do poprzedniego supernatantu: będzie to stanowić frakcję cytoszkieletu (CS) w analizie western blot. Błyskawiczne zamrożenie tej frakcji i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
- Wykonaj dodatkowe prania. Zawiesić osad w 500 μl PBS zawierającego inhibitory proteazy i inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok trzy razy.
UWAGA: Wszystkie ślady detergentów muszą zostać usunięte przez intensywne płukanie przed trawieniem białek na peptydy (patrz sekcja 3). W tym momencie osad wzbogacony w ECM może zostać zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 °C. Należy pamiętać, że wielkość osadu będzie zależała od ilości białek nierozpuszczalnych (ECM) w materiale wyjściowym i skuteczności decelularyzacji.
2. Monitorowanie jakości decelularyzacji/wzbogacania ECM za pomocą SDS-PAGE i Western Blot
- Zmieszać 10–20 μl podwielokrotności całkowitego ekstraktu tkankowego i 50 μl podwielokrotności frakcji pośrednich z buforem Laemmli zawierającym 100 mM DTT. Zawiesić wzbogaconą w ECM, nierozpuszczalną frakcję w 3x buforze Laemmli zawierającym 100 mM DTT.
Uwaga: podwyższone stężenia DTT i SDS pomagają w rozpuszczaniu białek ECM, które są stosunkowo nierozpuszczalne. - Oddzielić białka za pomocą SDS-PAGE i przenieść na błony nitrocelulozowe.
- Wykonać immuno-blot przy użyciu przeciwciał w celu monitorowania białek reprezentatywnych dla każdej z frakcji cytozolowej, jądrowej, błonowej, cytoszkieletowej i ECM (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki, tabela 2 i rycina 2).
3. Trawienie białek do peptydów w roztworze do analizy spektrometrii mas
UWAGA: Osad otrzymany po procedurze decelularyzacji i usunięciu SDS jest wysoko wzbogacony w nierozpuszczalne białka ECM Do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas białka te muszą zostać strawione do peptydów. Należy zauważyć, że w wyniku nierozpuszczalności białek ECM na tym etapie nie jest możliwe zmierzenie stężenia białka w próbce. W związku z tym podajemy objętości odczynników do trawienia próbek wzbogaconych ECM w peptydy w oparciu o wielkość (mm) lub suchą masę osadu wzbogaconego w ECM (tabela 3). Roztwory wodorowęglanu amonu, mocznika, DTT, jodoacetamidu i kwasu trifluorooctowego muszą być świeżo przygotowane.
- Zawiesić próbkę wzbogaconą w ECM, dodając odpowiednią objętość 8 M mocznika do osadu wzbogaconego w ECM i dodać DTT o końcowym stężeniu 10 mM (patrz tabela 3). Inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
UWAGA: w tym momencie białka ECM nie zostaną całkowicie rozpuszczone, a widocznie duże cząstki białka nie powinny być odrzucane przez wirowanie lub filtrację. Zawiesina zostanie usunięta po deglikozylacji i trawieniu (patrz wideo). - Alkilowania
- Przygotować roztwór jodoacetamidu w wodzie o czystości HPLC. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i dodać jodoacetamid do końcowego stężenia 25 mM. W przypadku całkowitego alkilowania stosunek DTT do jodoacetamidu powinien wynosić od 1:2,5 do 1:3.
- Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Deglikozylacja:
Uwaga: deglikozylacja jest potrzebna do usunięcia węglowodanowych łańcuchów bocznych, które zakłócają identyfikację peptydów zmodyfikowanych przez glikozylację sprzężoną z N.- Rozcieńczyć do 2 M mocznika 100 mM wodorowęglanem amonu o pH 8,0 i dodać odpowiednią ilość PNGaseF (patrz Tabela 3). Inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- trawienie
- Dodać Lys-C i inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać trypsynę i inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min O/N w temperaturze 37 °C.
UWAGA: zawiesina bogata w ECM, która zaczęła mętnieć po początkowym rozpuszczeniu w moczniku 8M, wydaje się klarowna po trawieniu O/N (patrz wideo). - Dodać drugą porcję trypsyny do próbki i inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Dodać Lys-C i inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać trypsynę i inkubować z ciągłym mieszaniem przy 1 400 obr./min O/N w temperaturze 37 °C.
- zakwaszenie
- Po zakończeniu trawienia należy dezaktywować trypsynę poprzez zakwaszenie próbki świeżo przygotowanym 50% kwasem trifluorooctowym (TFA). Próbka powinna osiągnąć pH < 2. Sugerujemy dodawanie jednorazowo 1-1,5 μl 50% TFA i użycie 1 μl roztworu peptydu do pomiaru pH roztworu za pomocą bibuły pH (patrz film).
- Odwirować zakwaszoną próbkę o sile 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant w czystej probówce o niskiej retencji. W tym momencie roztwór peptydu może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
- Odsalanie
Uwaga: ten ostatni etap jest zwykle przeprowadzany w ośrodku spektrometrii mas zgodnie z preferowanymi metodami.- Przed analizą proteomiczną należy odsolić próbki i peptydy eluowane świeżo przygotowanym 60% acetonitrylem, 0,1% kwasem trifluorooctowym, a następnie zagęścić w koncentratorze próżniowym. Zawiesić peptydy w świeżo przygotowanym 3% acetonitrylu, 0,1% kwasie trifluorooctowym8,
UWAGA: po odsoleniu stężenie roztworu peptydu można zmierzyć za pomocą spektrofotometrii (patrz rozdział Oczekiwane wyniki). - Teraz przeanalizować próbkę za pomocą spektrometrii mas, ponownie zgodnie z optymalnymi procedurami urządzenia do spektrometrii mas.
UWAGA: Zachęcamy badaczy zainteresowanych scharakteryzowaniem składu ECM za pomocą spektrometrii mas do zapoznania się z naszymi innymi publikacjami 8-10 i stroną internetową, które zawierają dalsze szczegółowe wyjaśnienia, w tym parametry LC-MS/MS, wyszukiwanie danych ze spektrometrii mas w celu identyfikacji białek i analizę danych przy użyciu opracowanego przez nas narzędzia do adnotacji macierzy in silico 8.
- Przed analizą proteomiczną należy odsolić próbki i peptydy eluowane świeżo przygotowanym 60% acetonitrylem, 0,1% kwasem trifluorooctowym, a następnie zagęścić w koncentratorze próżniowym. Zawiesić peptydy w świeżo przygotowanym 3% acetonitrylu, 0,1% kwasie trifluorooctowym8,
Wyniki
Kontrola jakości procedury decelularyzacji
Wydajność decelularyzacji można monitorować, analizując zawartość białek w każdej frakcji za pomocą metody western blot. Tabela 2 zawiera listę białek o wartości diagnostycznej służących do oceny jakości procedury decelularyzacji. Rysunek 2A pokazuje efektywną ekstrakcję w frakcjach pośrednich białek cytozolowych (GAPDH), jądrowych (histony), błonowych (β1 integrina) i cytoszkieletowych (aktyna), podczas gdy w tych frakcjach nie wykryto białek ECM (kolagen I) (Rysunek 2). Z kolei końcowy osad jest wzbogacony w białka ECM i w dużej mierze pozbawiony białek wewnątrzkomórkowych (Rysunek 2A). Rysunek 2B przedstawia zadowalający stopień usunięcia białek wewnątrzkomórkowych (brak wykrytych histonów we frakcji bogatej w ECM), choć we frakcji bogatej w ECM wciąż można wykryć aktynę, a we frakcji CS można zaobserwować ubytek monomerów kolagenu I — o widocznej masie cząsteczkowej ~110 kDa, co prawdopodobnie odpowiada niezłożonym cząsteczkom kolagenu I.
Rutynowo monitorujemy również dodatkowe białka ECM, takie jak fibronektyna i laminina, choć w niektórych tkankach składniki te mogą ulec częściowej solubilizacji w wcześniejszych frakcjach8-10. Na przykład fibronektyna występuje również jako rozpuszczalna fibronektyna osocza, która nie jest włączona do ECM. Perfuzja tkanki przed ekstrakcją zmniejsza stężenie fibronektyny osocza, ale nie zawsze całkowicie ją eliminuje. W niektórych tkankach lamininy są słabo związane z powierzchnią komórki lub z ECM i ekstrahują się w frakcjach pośrednich. W takim przypadku można temu zaradzić poprzez zmianę warunków ekstrakcji (patrz sekcja Dyskusja).
Należy zauważyć, że wzbogacenie białek ECM i towarzyszące mu usunięcie składników wewnątrzkomórkowych opiera się na względnej rozpuszczalności białek w różnych buforach. Różni się to w zależności od rodzaju tkanki — w niektórych przypadkach histony i aktyna są łatwiej ekstrahowane niż w innych. Należy również zauważyć, że choć oczekuje się ekstrakcji histonów w frakcji N (Rysunek 2B), często obserwujemy bardziej całkowite usunięcie histonów w frakcji M lub CS (Rysunek 2A i B).
Przewidywane orientacyjne stężenie peptydów
Stężenie roztworu peptydów otrzymanego po trawieniu, zakwaszaniu i odsoleniu można zmierzyć spektrofotometrycznie, mierząc absorbancję roztworu peptydów przy długości fali 280 nm odpowiadającej tryptofanowi i tyrozynie lub przy długości fali 205 nm odpowiadającej absorbancji wiązań peptydowych.
Zmierzono stężenie roztworów peptydów otrzymanych z decelularyzacji trzech próbek płuc mysich (odpowiednio 82 mg, 100 mg i 100 mg) przygotowanych równolegle, co pozwoliło uzyskać odpowiednio: 424 ng/µl, 450 ng/µl i 580 ng/µl peptydów.
Identyfikacja peptydów ECM za pomocą spektrometrii mas
Analiza spektrometryczna masy składu próbek białek wzbogaconych w ECM, przygotowanych zgodnie z opisanym tutaj opisem, wykazała, że >70% intensywności sygnału odpowiada ECM i białkom związanym z ECM8-10.
Tabela 1. Objętość odczynników z zestawu do ekstrakcji kompartymentowej (Compartmental Extraction kit) do decelularyzacji 100 mg (masy mokrej) tkanki lub guza.Tabela ta zawiera skład i objętość każdego buforu wykorzystanego do przeprowadzenia decelularyzacji 100 mg tkanki lub guza. Koktajl inhibitorów proteaz jest dostarczany jako roztwór 50x i musi zostać dodany do każdego buforu2.
| Odczynniki z zestawu do ekstrakcji białek frakcyjnych | Objętość dla 100 mg tkanki | Skład (na podstawie karty charakterystyki Millipore, nr kat. 2145)1) |
| Bufor C | 500 μl | HEPES (pH 7,9)3), MgCl2, KCl, EDT4sakaroza, glicerol, ortowanadan sodu5 |
| Bufor W | 400 μl | HEPES (pH 7,9), MgCl22, KCl, EDTA, sacharoza, glicerol, ortowanadan sodu |
| Bufor N | 150 μl x 2 | HEPES (pH 7,9), MgCl22NaCl, EDTA, glicerol, ortowanadan sodu |
| Bufor W | 400 μl | HEPES (pH 7,9), MgCl22, KCl, EDTA, sacharoza, glicerol, ortowanadan sodu |
| Bufor M | 100 μl | HEPES (pH 7,9), MgCl22, KCl, EDTA, sacharoza, glicerol, deoksycholan sodu (DOC)6, NP-406ortowanadan sodu |
| Bufor CS | 200 μl | PIPES (pH 6,8), MgCl22, NaCl, EDTA, sacharoza, dodecylosiarczan sodu (SDS)7, ortowanadan sodu |
| Bufor C | 150 μl | HEPES (pH 7,9), MgCl22, KCl, EDTA, sacharoza, glicerol, ortowanadan sodu |
| 1x PBS | 500 μl/wash | - |
Uwagi:
1 Ze względów prawnych nie udało nam się uzyskać dokładnego składu buforów od dostawcy zestawu, jednak zamieszczamy tutaj uwagi oparte na naszym własnym doświadczeniu w stosowaniu buforów przygotowanych samodzielnie do przeprowadzania podobnych ekstrakcji.
2 Inhibitor proteaz: zaleca się zastosowanie różnych inhibitorów przeciwko peptydazom cysteinowym, serynowym i treoninowym, esterazom serynowym oraz metaloproteinazom zależnym od kationów dwuwartościowych itp. Dostępnych jest wiele komercyjnych koktajli inhibitorów proteaz.
3 pH powyżej 7.0 jest skutecznym inhibitorem proteaz lizosomalnych.
4 EDTA (zazwyczaj stosowany w stężeniu 2 mM) jest skutecznym inhibitorem proteaz zależnych od kationów dwuwartościowych.
5 Ortowodorawan sodu jest inhibitorem fosfatazy. Typowe skuteczne stężenie wynosi 0.5–5 mM.
6 NP40 w stężeniu 0.1%–0.5% jest wystarczający do solubilizacji większości lipidów błonowych. Połączenie NP40 i DOC — często stosowane w równych stężeniach (np. 0.5% każdego z nich) — jest często wykorzystywane jako bardziej rygorystyczna ekstrakcja, która nadal zachowuje wiele oddziaływań białko-białko.
7 SDS jest bardziej rygorystycznym detergentem jonowym (CMC 0.1%). Może być on również stosowany w połączeniu z dwoma pozostałymi detergentami w układzie SDS/NP40/DOC 0.1/0.5/0.5% jako bufor o pośrednim rygorze.
Tabela 2. Białka diagnostyczne służące do monitorowania jakości procedury decelularyzacji. W tabeli wymieniono przykłady białek charakterystycznych dla każdego przedziału subkomórkowego (cytozolu, jądra komórkowego, błony plazmatycznej, cytoszkieletu i ECM), które mogą być wykorzystane do monitorowania jakości procedury decelularyzacji oraz efektywności wzbogacania ECM.
| Przedział wewnątrzkomórkowy | Białka diagnostyczne |
| Białka cytozolowe | Gliceraldehydo-3-fosforanowa dehydrogenaza (GAPDH) |
| Białka jądrowe | Histony, laminy, nukleoporyna |
| Białka błonowe | Integryny, receptor transferryny |
| Białka cytoszkieletu | aktyna, tubulina, wimentyna |
| Białka ECM błony podstawnej | Kolagen IV, nidogeny, lamininy |
| Białka macierzy pozakomórkowej śródmiąższowej (śródmiąższowe) | Kolagen I, Kolagen III, Kolagen VI, Fibonektyna |
W celu uzyskania rekomendacji dotyczących przeciwciał należy zapoznać się z naszymi publikacjami8-10.
Tabela 3. Objętość odczynników do trawienia próbek wzbogaconych w ECM do peptydów. Tabela ta wymienia odczynniki użyte do resuspensji próbek białek wzbogaconych w ECM oraz do redukcji, alkilowania, deglikozylowania i trawienia próbek białek do peptydów przed analizą spektrometrią mas.
| Odczynniki | Przygotowanie | Stężenie końcowe / ilość dla pelletu o grubości 1 mm (~5–10 mg suchej masy) | Objętość dla pelletu o grubości 1 mm (masa sucha ok. 5–10 mg) |
| Wodorowęglan amonu (NH4HCO3) | roztwór 100 mM w wodzie klasy HPLC | - | - |
| Mocznik | roztwór 8 M w 100 mM wodorowęglanie amonu | 8 M | 50 μl |
| Ditiotreitol | Zrekonstytuować w wodzie klasy HPLC do stężenia 500 mM | 10 mM | 1 μl |
| Jodoacetamid | Zrekonstytuować w wodzie klasy HPLC do stężenia 500 mM | 25 mM | 2.5 μl |
| Peptyd-N-glikozydaza F (PNGaza F) | Roztwór handlowy w stężeniu 500 U/μl | 1 000 J | 2 μl |
| Endoproteinaza LysC, stopień czystości do spektrometrii mas | Rekonstytuować w wodzie klasy HPLC w stężeniu 0.5 μg/μl | 1 μg | 2 μl |
| trypsyna, stopień czystości do spektrometrii mas (runda 1) | Roztwór komercyjny w stężeniu 0.5 μg/μl | 3 μg | 6 μl |
| Trypsyna, stopień czystości do spektrometrii mas (runda 2) | Gotowy roztwór handlowy o stężeniu 0.5 μg/μl | 1.5 μg | 3 μl |
| Kwas trifluorooctowy (TFA) | roztwór 50% w wodzie klasy HPLC | - | 2–5 μl |
| Acetonitryl (eluowanie) | roztwór 60% z 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC | - | 500 μl |
| Acetonitryl (rekonstytucja) | roztwór 3% z 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC | - | 100 μl |
Rysunek 1. Schemat procedury eksperymentalnej. Schematyczny przebieg protokołu decelularyzacji tkanek (Sekcja 1), kontroli jakości decelularyzacji i oceny wzbogacenia ECM (Sekcja 2) oraz trawienia próbek białek wzbogaconych w ECM do peptydów przed analizą metodą spektrometrii masowej (Sekcja 3).
Rycina 2. Kontrola jakości procedury decelularyzacji metodą Western blot. Analizy Western blot wykonano na próbkach płuc myszy (A) i ksenoprzeszczepów raka piersi człowieka (B) z użyciem następujących przeciwciał: króliczego anty-aktynowego (klon 14-1) oraz króliczego anty-β1 integrynowego produkowanych w naszym laboratorium; przeciwciała królicze anty-kolagen I, mysie anty-GAPDH i królicze anty-pan-histonowe pochodziły z firmy Millipore. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym membrany przemyto i inkubowano w obecności sprzężonego z HRP koziego przeciwciała wtórnego anty-króliczego lub anty-mysiego z laboratorium Jackson ImmunoResearch. Na koniec membrany przemyto i inkubowano w odczynniku chemiluminescencyjnym Western Lightning™ (PerkinElmer LAS). * oznacza minimalną pozostałą kontaminację histonami frakcji bogatej w ECM. ** oznacza częściowe wyczerpanie monomerów (prawdopodobnie niezłożonego) kolagenu I we frakcji CS. *** oznacza pozostałą kontaminację aktyną frakcji bogatej w ECM. Rozmaz wykryty za pomocą przeciwciała anty-kolagenowego reprezentuje różne poziomy modyfikacji potranslacyjnych (np. sieciowanie, glikozylację).
Dyskusja
Modyfikacje
Chociaż zastosowaliśmy dokładnie tę procedurę, aby wzbogacić ECM z dziesięciu tkanek i typów nowotworów 8-10, modyfikacje protokołu powinny być brane pod uwagę w następujących przypadkach:
1) Wykrywanie białek ECM we frakcjach pośrednich.
Matryce zewnątrzkomórkowe z różnych tkanek lub typów nowotworów mogą różnić się ekstrakcją/nierozpuszczalnością, jak omówiono powyżej w przypadku fibronektyny i laminin. Na przykład uważa się, że ECM tkanek zwłóknieniowych lub tkanek remodelujących obraca się bardzo dynamicznie, a zatem można zaobserwować wyższy odsetek białek ECM w tych tkankach, które są łatwiej ekstrahowalne12. W zależności od frakcji, w której wykrywane są białka ECM, sugerujemy skrócenie czasu inkubacji etapu powodującego ekstrakcję białek ECM lub pominięcie tego etapu.
2) Wykrycie znacznej części składników wewnątrzkomórkowych w osadzie wzbogaconym w ECM. W niektórych tkankach lub typach nowotworów stosunek komórek do ECM jest szczególnie wysoki (np. wątroba, śledziona, guzy niedesmoplastyczne). W takim przypadku można zaobserwować znaczne zanieczyszczenie frakcji wzbogaconej w ECM białkami wewnątrzkomórkowymi (w szczególności białkami cytoszkieletu i/lub histonami). Aby skutecznie zubożyć białka wewnątrzkomórkowe, sugerujemy powtórzenie dwukrotnej inkubacji w Buffer M i/lub Buffer CS (oba zawierają detergenty, co zwykle wyczerpuje obfite białka wewnątrzkomórkowe). Inną alternatywą byłoby użycie alternatywnych o wyższych stężeniach detergentów, z zastrzeżeniem, że może to prowadzić do wyczerpania również stosunkowo bardziej rozpuszczalnych białek ECM (patrz następny akapit).
3) Alternatywa dla korzystania z zestawu komercyjnego.
Ze względów własnościowych nie byliśmy w stanie uzyskać dokładnego składu od dostawcy zestawu do ekstrakcji białek kompartmentowych. W tabeli 1 zamieściliśmy jednak uwagi oparte na własnych doświadczeniach przy użyciu domowych o określonych stężeniach detergentów (NP-40, deoksycholan sodu i SDS) do przeprowadzania podobnych ekstrakcji. Niedawne badanie podkreśliło również znaczenie pH decelularyzacyjnych dla zatrzymywania białek ECM13.
Ograniczenia techniki
Przedstawiona tutaj metoda opiera się na fakcie, że białka ECM są z natury bardziej nierozpuszczalne niż większość białek wewnątrzkomórkowych. Jednak opisana tutaj metoda decelularyzacji z pewnością wyodrębnia rozpuszczalne składniki obecne w ECM, takie jak niektóre czynniki wzrostu lub enzymy remodelujące ECM. Chociaż białka związane z ECM ściśle związane z białkami ECM zostały wykryte przez proteomikę w próbkach przygotowanych zgodnie z opisem, metoda ta może być zbyt rygorystyczna, aby w pełni sprofilować skład białek związanych z matrysomem.
Znaczenie techniki w odniesieniu do innych metod
Przewagą przedstawionej tutaj metody w porównaniu z innymi metodami jest to, że można ją dostosować do charakteru interesującego ECM: etapy pośrednie można pominąć lub powtórzyć, aby zapobiec utracie białek ECM lub odpowiednio zwiększyć wyczerpanie zanieczyszczających białek wewnątrzkomórkowych. W tej metodzie wykorzystuje się również tylko minimalne ilości detergentów, które są spłukiwane, aby zapobiec ich ingerencji w późniejsze przygotowanie peptydów i spektrometrię mas. Wreszcie, opisana tutaj metoda trawienia preparatów białkowych bogatych w ECM do peptydów ma również tę zaletę, że nie wymaga rozpuszczalności białek i może być przeprowadzana na "surowych" frakcjach wzbogaconych w ECM.
Alternatywne metody decelularyzacji wykorzystujące chaotropy (takie jak chlorowodorek guanidyny) do badania składu ECM za pomocą spektrometrii mas zostały opisane w literaturze (przegląd w 14) i były stosowane w połączeniu ze spektrometrią mas w celu scharakteryzowania składu ECM chrząstki15,16, serca17, gruczołu sutkowego18 i naczyń krwionośnych19 oraz kłębuszków nerkowych20 .
Zalecenia
Metody decelularyzacji wykorzystujące trypsynę do trawienia komórek nie powinny być stosowane, jeśli ECM są wzbogacone do kolejnych analiz proteomicznych, ponieważ trypsyna spowoduje częściowe trawienie ECM i utratę białek i peptydów ECM. Podobnie, jeśli trawienie kolagenazy miałoby być stosowane w celu wspomagania rozerwania tkanek, musiałoby być uważnie monitorowane, ponieważ powoduje trawienie ECM i utratę białek i peptydów ECM.
Trawienie w roztworze czy w żelu? Białka ECM są usieciowane i wysoce nierozpuszczalne, a nawet po ponownym zawieszeniu w 3x buforze Laemmli (zawierającym 6% SDS) i 100 mM DTT, słabo oddzielają się na żelach SDS. W związku z tym trawienie w żelu nie jest preferowaną metodą.
Przyszłe zastosowania
Warto zauważyć, że chociaż nie zostało to tutaj omówione, skład każdej z frakcji pośrednich zebranych podczas decelularyzacji można również analizować za pomocą spektrometrii mas. Może to być szczególnie cenne podczas badania bardzo małych próbek (np. biopsji u ludzi) lub gdy pożądane są informacje na temat innych frakcji komórkowych.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować doktorom Amandzie Del Rosario i Guillaume'owi Carmonie za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty z Departamentu Obrony DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 dla ROH); Narodowy Instytut Raka (U54 CA126515/CA163109); Broad Institute z MIT i Harvardu; Instytut Medyczny Howarda Hughesa, którego ROH jest badaczem; oraz częściowo dzięki grantowi wspierającemu z National Cancer Institute dla Koch Institute for Integrative Cancer Research w MIT (P30-CA14051). Otrzymał stypendia podoktorskie w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Ludwig Center for Cancer Research w MIT.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Homogenizator tkankowy: Bullet blender + koraliki | Next Advance | BB24-AU | |
| Zestaw do ekstrakcji komorowej | Millipore | 2145 | |
| Deoksyrybonukleaza I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Rybonukleaza A | Qiagen | 19101 | |
| Woda klasy HPLC | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Mocznik | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Wodorowęglan amonu (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Jodoacetamid | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glikozydaza F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinaza LysC, klasa spektrometrii mas | Wako | 125-05061 | |
| Trypsyna, klasa spektrometrii masowej | Promega | V5111 | |
| Kwas trifluorooctowy | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitryl, klasa spektrometrii masowej | Thermo Scientific | 51101 | |
| Kolumny odsalające: Oasis HLB 1 cc, 10 mg sorbentu na wkład | Wody | 186000383 |
Bibliografia
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903(2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647(2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518(2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308(2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
Przedruki i uprawnienia
