Tradycyjne techniki mocowania głowy wykorzystywały metalowe ramki przymocowane do czaszki jako interfejs dla aparatu do mocowania głowy. Protokół ten demonstruje bezramkową, opartą na żywicy akrylowej technikę mocowania głowy do zadań behawioralnych u gryzoni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Unieruchomienie głowy zwierzęcia to technika unieruchamiania głowy zwierzęcia poprzez przymocowanie słupka głowy do czaszki w celu sztywnego zaciskania. Tradycyjne mocowanie głowy wymaga chirurgicznego zamocowania metalowych ramek na czaszce. Przymocowane ramy są następnie mocowane do nieruchomej platformy, co powoduje unieruchomienie głowy. Jednak metalowe ramy do mocowania głowy były technicznie trudne do zaprojektowania i wdrożenia w ogólnym środowisku laboratoryjnym. W tym badaniu przedstawiamy nowatorską metodę stabilizacji głowy. Za pomocą wykonanego na zamówienie pręta mocującego głowę, podczas operacji implantacji konstruowany jest uchwyt na głowę. Po nałożeniu żywicy akrylowej do mocowania implantów, takich jak elektrody i kaniula, na czaszkę, nakłada się na nią dodatkowe żywice, aby zbudować formę dopasowaną do portu pręta mocującego. Formowany uchwyt do montażu głowy służy jako szyny prowadzące, badacze wygodnie mocują głowę zwierzęcia, wkładając uchwyt na głowę do portu pręta mocującego. Ta metoda może być łatwo zastosowana, jeśli konieczna jest chirurgia implantacji przy użyciu akryli dentystycznych i może być przydatna dla laboratoriów, które nie mogą łatwo wyprodukować metalowych słupków głowic obrabianych CNC.
Wprowadzenie
Unieruchomienie głowy lub krępowanie głowy to technika unieruchamiania głowy zwierzęcia poprzez przymocowanie ramy lub płytki do czaszki w celu sztywnego zaciskania. Technika ta została przyjęta do precyzyjnej stymulacji sensorycznej, wykrywania behawioralnego z lub bez rejestracji neuronalnej u obudzonych zwierząt1-3 oraz do znakowania komórkowego w cyklu snu i czuwania4. Jest również stosowany do obrazowania mózgu in vivo 5,6. Obecnie technika fiksacji głowy jest powszechnie stosowanym narzędziem w neurobiologii i badaniach behawioralnych.
Zasadniczo, tradycyjne mocowanie głowy wymaga chirurgicznego mocowania metalowych słupków na szczycie czaszki6-8. Nasadki są następnie mocowane do nieruchomej platformy, co powoduje unieruchomienie głowy. Badania neurofizjologiczne na obudzonych zwierzętach, takie jak zapis neuronalny i/lub optyczny, interwencja obwodów mózgowych, obrazowanie mózgu towarzyszą zabiegi implantacji przy użyciu akryli dentystycznych. Dlatego wydaje się, że prostym zadaniem jest wdrożenie fiksacji głowy w tych laboratoriach, gdy jest to konieczne eksperymentalnie. Ramki powinny być zaprojektowane tak, aby były lekkie i na tyle małe, aby nie zakłócać naturalnego zachowania zwierząt w ich domowych klatkach. Zapewnia również sztywność mechaniczną po zamocowaniu na nieruchomej platformie. Ponadto ma biokompatybilność w zależności od celów eksperymentalnych. Dlatego technicznie trudno jest zaprojektować i wyprodukować takie słupki czołowe w ogólnym sprzęcie laboratoryjnym.
W tym badaniu opisana jest nowatorska metoda mocowania głowicy, zapewniająca mechaniczną sztywność poprzez wygodne mocowanie bez użycia metalowych słupków głównych. Dzięki zastosowaniu tej metody można uzyskać stabilizację głowy w ogólnych warunkach laboratoryjnych, w których operacja implantacji jest zwykle wykonywana u gryzoni w celu zbadania mózgu. Metalowe słupki są zastępowane cementem z żywicy akrylowej, częściowo formowanym przez wykonany na zamówienie pręt mocujący głowicę, a proces formowania odbywa się podczas operacji implantacji. Listwa mocująca zapewnia wysoką kompatybilność przestrzenną z innymi implantami, takimi jak sondy rejestrujące neuronie, elektrody stymulacyjne. Upraszcza również etapy zaciskania głowy zwierzęcia na platformie mocującej poprzez usunięcie mocujących. Zastosowaliśmy tę metodę w poprzednim badaniu behawioralnym i doszliśmy do wniosku, że metoda ta jest łatwa do wdrożenia i wygodna w praktycznych eksperymentach9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne:
Eksperyment ten został zatwierdzony przez Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee i został przeprowadzony zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Institute of Health, 1996). Po eksperymencie zwierzęta zostały złożone w ofierze w ramach eutanazji dwutlenku węgla.
1. Projekt drążka do mocowania głowy dla szczurów
UWAGA: Ten krok jest ogólną wskazówką dla projektu drążka mocującego. Możliwa jest dowolna modyfikacja wymiaru i materiału w zależności od zwierząt lub implantów. Projektowanie belki mocującej głowicę za pomocą oprogramowania CAD jest zalecane, ale nie jest konieczne.
- Użyj oprogramowania CAD, aby zaprojektować listwę mocującą.
- Zaprojektuj pręt mocujący o kształcie prostokątnym (123 × 35 × 6 mm) (Rysunek 1A). Wykonaj prostokątne wcięcie (16 × 20 mm; port) na środku pręta mocującego. Dodaj nachylenia lub wgłębienia, które służą jako szyna prowadząca na granicach portu (Rysunek 1A-a, Rysunek 1B-strzałki).
UWAGA: Upewnij się, że obszar portu pokrywa szacowany prostokąt czaszki szczura nad mózgiem, aby umożliwić pionowy dostęp za pomocą manipulatora stereotaktycznego do większości obszarów mózgu przez kraniotomię. - Przymocować płytki (50 × 20 × 6 mm) z dwoma podłużnymi otworami kotwiącymi po obu stronach listwy mocującej. Upewnij się, że te otwory przechodzą przez o średnicy 6 mm (Rysunek 1A-d). Wykonaj otwór o średnicy 3 mm przed portem na hak blokujący (Rysunek 1A-b).
- Wykonaj pudełko z podłogą (135 × 305 mm) i ścianami bocznymi (305 × 76 mm). Wywierć dwa otwory o średnicy 6 mm, jak pokazano na rysunku 1A (wstawka). Dodaj ściany nośne na belce mocującej (Rysunek 1A-e).
- Zaprojektuj pręt mocujący o kształcie prostokątnym (123 × 35 × 6 mm) (Rysunek 1A). Wykonaj prostokątne wcięcie (16 × 20 mm; port) na środku pręta mocującego. Dodaj nachylenia lub wgłębienia, które służą jako szyna prowadząca na granicach portu (Rysunek 1A-a, Rysunek 1B-strzałki).
- Wykonaj zaprojektowaną prowadnicę i pudełko i zmontuj każdy z nich za pomocą cyjanoakrylanu, jak pokazano na rysunku 1A (wstawka). Zamontuj pręt na pudełku za pomocą o średnicy 6 mm. Zastosuj nachylenie, regulując położenie pręta w celu ergonomicznego zamocowania głowicy (Rysunek 1A-wstawka).
UWAGA: W przypadku myszy wymiar listwy mocującej wynosi 60 × 20 × 4 mm (składa się z dwóch warstw paneli akrylowych o grubości 2 mm). Port jest kwadratowy o szerokości 8 mm (górny) i 9 x 10 mm (dolny), jak pokazano na rysunku 1C. Płyty kotwiące są tej samej wielkości co u szczurów. Płyta skrzynkowa i ściany boczne mają odpowiednio 100 × 72 mm i 100 × 50 mm.
2. Konstrukcja głowicy podczas operacji implantacji
UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z dentystyczną żywicą akrylową. Płyn może powodować podrażnienie skóry. Załóż maskę i załóż rękawiczki. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
- Przygotowanie przed zabiegiem
- Szczelnie owinąć krawędź portu pręta mocującego za pomocą folii parafinowej, aby zapobiec przywieraniu nałożonej żywicy akrylowej do pręta (patrz rysunek 1B i rysunek 2A). Pokryj granicę portu pokrytą folią parafinową cienką warstwą żywicy akrylowej.
- Używaj wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych. Dokładnie zdezynfekuj ramę stereotaktyczną i jej otoczenie za pomocą 70% alkoholu etylowego.
- Wykonaj operację implantacji stereotaktycznej
- Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszanki koktajlowej (2 ml/kg) ketaminy 10 ml (50 mg/ml), chlorowodorku ksylazyny 1,5 ml (23,32 mg/ml) i soli fizjologicznej 2,5 ml. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone i nie reaguje na szczypanie ogona i palców. W razie potrzeby wstrzyknąć mieszankę koktajlową o objętości 1 ml/kg podczas zabiegu.
- Przymocuj zwierzę do aparatu stereotaktycznego. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Gol i oczyść skórę głowy 70% etanolem. Wykonać wstrzyknięcie podskórne 2% lidokainy i naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej czaszki. Całkowicie zeskrob okostną. Kilkakrotnie spłucz solą fizjologiczną.
- Wykonaj wiercenie otworu na zadziory w pobliżu krawędzi czaszki. Implant wkręca się w odległości 4-5 obrotów (do 1 mm głębokości) od powierzchni czaszki, aby zapobiec naruszeniu opony twardej. Upewnij się, że po implantacji nie ma wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi na powierzchni czaszki. Spłucz solą fizjologiczną i osusz powierzchnię czaszki za pomocą podmuchu powietrza, szczególnie wokół.
- Pokryj powierzchnię czaszki cienką warstwą "kleju dentystycznego (Super-Bond C&B)". Nie zakrywaj całkowicie powierzchni czaszki, w tym bregmy, jeśli planowana jest dodatkowa implantacja elektrody. Użyj bregmy do oznaczania współrzędnych kraniotomii. Wszczepić elektrody i/lub mikronapęd i przymocować go do czaszki, nakładając wokół niego żywicę akrylową.
- Nałóż dodatkową żywicę akrylową na wierzch cementu dentystycznego. Użyj odpowiedniej ilości żywicy akrylowej, aby pozostawić wystarczającą przestrzeń między żywicą pokrytą prętem a żywicą do wstępnego montażu podczas mocowania i/lub elektrod (Rysunek 2A).
- Umieść pręt mocujący głowę 5 mm lub więcej nad powierzchnią czaszki i wyrównaj jego środek (Rysunek 2A-Po lewej).
- Nałóż żywicę akrylową w szczelinę między podstawą czaszki a żywicami początkowego montażu. (Rysunek 2A-Środek). Poczekaj, aż żywica stanie się twarda.
- Zdejmij nausznik i wyciągnij uformowany uchwyt montażowy z portu listwy mocującej. (Rysunek 2A-po prawej). W razie potrzeby ostrożnie nałóż dodatkową żywicę akrylową wokół szyn krawędziowych formowanego uchwytu.
- Powierzchnię rany skóry głowy spłukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Bezpośrednio po zabiegu wstrzyknąć antybiotyk (enrofloksacyna, 5 mg/kg s.c.) i środek przeciwbólowy (winian butorfanolu, 2 mg/kg s.c.). Trzymaj zwierzę pojedynczo w jednej klatce.
3. Przyzwyczajanie zwierząt do fiksacji na głowie
Uwaga: Ten krok opisuje harmonogramy habituacji oparte na empirycznie udanych ocenach autorów. Aby zapoznać się z przeglądem procedury habituacji do fiksacji głowy, zobacz pracę Schwartza10 lubGuo 11.
- Zapewnić zwierzętom wystarczający okres rekonwalescencji (tydzień lub dłużej). W dniu 1 często zajmuj się zwierzętami podczas podzielonych krótkich sesji.
- Następnego dnia (Dzień 2) wystawić zwierzę na działanie środowiska fiksacji (pudełko). Nie wkładaj uchwytu na głowę do portu listwy mocującej. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się do środowiska. Chwyć bezpiecznie uchwyt na głowę ręką na 1 do 2 sekund i natychmiast go zwolnij. Powtórz krótkotrwałe utrwalanie przez chwytanie ręczne kilka razy.
- W dniu 3 przyzwyczaj zwierzęta do fiksacji głowy.
- Przynieś zwierzęta z domowych klatek i umieść je w pudełku, kierując głowy w stronę portu pręta mocującego. Chwyć uchwyt do montażu głowicy i włóż go do portu listwy mocującej.
- Przymocuj mocowanie (głowę zwierzęcia) do haka blokującego listwy mocującej za pomocą gumki recepturki. Stoisko przez 5 min.
UWAGA: Nie dotykaj tułowia ani ogona zwierzęcia po unieruchomieniu, co prowadzi do piszczenia i szarpania się, zwiększając stres zwierzęcia. Gdy zwierzę będzie się męczyć dłużej niż 1 minutę, puść je i spróbuj później. Na tym etapie zwierzęta wykazują wydalanie moczu i kału za każdym razem, gdy są narażone na fiksację głowy, ale stopniowo zmniejsza się to w miarę postępu przyzwyczajenia. - Wyjmij gumkę blokującą i wysuń uchwyt z portu. Umieść zwierzęta z powrotem w klatce domowej i w nagrodę włóż do niej kawałek zboża lub ziarno słonecznika. Następna próba rozpoczyna się za 30 minut. Powtórz 3.4.1 do 3.4.4 pięć lub więcej w ciągu dnia.
- W dniach od 4 do 7 należy poddać zwierzę fiksacji głowy, jak opisano w Protokole 3.4. Stopniowo zwiększaj czas stabilizacji głowy (10 min, 20 min, 30 min i 50 min w miarę postępu habituacji).
UWAGA: Jeśli zwierzęta nie karmią nagrody w postaci pokarmu, może to być oznaką wysokiego poziomu stresu. Nie wydłużaj czasu utrwalania. Jeśli zwierzęta wykazują powtarzające się zachowania związane z walką, przyzwyczajaj je przez dłuższy czas. - Codziennie sprawdzaj masę ciała zwierzęcia. Rozważ nieudaną habituację, gdy masa ciała spada. Przejdź do zadań behawioralnych z fiksacją głowy po udanej habituacji.
UWAGA: Udana habituacja ułatwia późniejszy trening behawioralny (ryc. 3E i F).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ta metoda fiksacji głowy ma zastosowanie zarówno do szczurów, jak i myszy. Łącznie osiem szczurów poddano obustronnej implantacji elektrod stymulujących do pęczka przedmózgowego (medial forebrain bundle). U czterech z nich dodatkowo wszczepiono dostosowane elektrody z drutu wolframowego (mikronapędy) do obszaru M1 kończyny przedniej (Rycina 2C). U myszy (n = 2) cztery elektrody z drutu stalowego wszczepiono do czołowych i potylicznych obszarów kory. Podczas operacji u szczurów i myszy uformowano uchwyty ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten demonstruje prostą i wygodną metodę mocowania głowy przy użyciu dostępnych materiałów. Aby fizycznie udane mocowanie głowy, pierwszym krytycznym krokiem podczas operacji jest wyraźne spłukanie i wysuszenie powierzchni czaszki przed nałożeniem cementu z żywicy adhezyjnej. Po drugie, metoda ta nie wykorzystuje wszczepianych pod mięśnie skroniowe i zależy tylko od na czaszce, ich prostopadłe zagnieżdżenie do powierzchni krawędzi czaszki ma kluczowe znaczenie10. Zmniejsza to możliwość przypadkowego od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Te badania były wspierane przez Program Badań Nauk Podstawowych poprzez NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (2010-0022362) i (2012R1A2A2A02046812).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dentystyczna żywica akrylowa | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | do produkcji formowanego montażu |
| Folia parafinowa | Bemis | Parafilm | zapobiegający przywieraniu żywicy akrylowej do pręta |
| Klej dentystyczny | Sun Medical | Super-Bond C& B | do łączenia żywicy akrylowej z czaszką |
| Plexglass lub inna płyta | do wykonania pręta mocującego i platformy skrzynkowej | ||
| Cyjanoakrylan | do łączenia płyt akrylowych |
Bibliografia
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9(2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
