Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

16.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53073

⸱

1 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Streszczenie

Aby naśladować błony komórkowe, wspierana dwuwarstwa lipidowa (SLB) jest atrakcyjną platformą, która umożliwia badanie in vitro procesów związanych z błonami, jednocześnie nadając biokompatybilność i biofunkcjonalność substratom stałym. Spontaniczna adsorpcja i pękanie pęcherzyków fosfolipidowych jest najczęściej stosowaną metodą tworzenia SLB. Jednak w warunkach fizjologicznych fuzja pęcherzyków (VF) jest ograniczona tylko do podzbioru kompozycji lipidowych i stałych podpór. W tym miejscu opisujemy jednoetapową ogólną procedurę zwaną metodą tworzenia dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB) w celu utworzenia SLB, które nie wymagają pęcherzyków. Metoda SALB polega na osadzaniu cząsteczek lipidów na powierzchni ciała stałego w obecności mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych (np. izopropanolu), a następnie wymianie rozpuszczalnika z wodnym roztworem buforowym w celu wywołania tworzenia SLB. Etap ciągłej wymiany rozpuszczalnika umożliwia zastosowanie metody w konfiguracji przepływowej odpowiedniej do monitorowania tworzenia się dwóch warstw i późniejszych zmian przy użyciu szerokiej gamy bioczujników wrażliwych na powierzchnię. Metoda SALB może być stosowana do wytwarzania SLB na szerokiej gamie hydrofilowych powierzchni stałych, w tym tych, które są trudne do fuzji pęcherzykowej. Ponadto umożliwia wytwarzanie SLB złożonych z kompozycji lipidowych, których nie można wytworzyć metodą fuzji pęcherzykowej. W niniejszym artykule porównujemy wyniki uzyskane za pomocą SALB i konwencjonalnych metod fuzji pęcherzykowej na dwóch ilustracyjnych powierzchniach hydrofilowych, dwutlenku krzemu i złocie. W celu optymalizacji warunków doświadczalnych do przygotowania wysokiej jakości dwuwarstw przygotowanych metodą SALB, omówiono wpływ różnych parametrów, w tym rodzaju rozpuszczalnika organicznego na etapie osadzania, szybkości wymiany rozpuszczalnika i stężenia lipidów wraz ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów. Za pomocą metody SALB wykazano również tworzenie podpartych błon zawierających wysokie frakcje cholesterolu, co podkreśla możliwości techniczne techniki SALB dla szerokiego zakresu konfiguracji membran.

Wprowadzenie

Dwuwarstwa lipidowa1 (SLB) na stałym nośniku jest wszechstronną platformą, która zachowuje podstawowe cechy biomembran, takie jak grubość dwuwarstwy, dwuwymiarowa dyfuzyjność lipidów i zdolność do przyjmowania biomolekuł związanych z błoną. Ze względu na złożoność naturalnych błon komórkowych wykazano, że ta prosta platforma działa jako skuteczna platforma do badań in vitro procesów związanych z błonami, takich jak tworzenie tratw2, wiązanie białek3, wiązanie wirusów i cząstek wirusopodobnych4,5 oraz sygnalizacja komórkowa6. Utworzona w bliskiej odległości od solidnego podłoża, platforma SLB jest kompatybilna z szeregiem technik pomiarowych wrażliwych na powierzchnię, takich jak mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), rozpraszanie mikrowagi kryształów kwarcu (QCM-D) i spektroskopia impedancji.

Opracowano kilka metod do produkcji różnych typów SLB, w tym zapadanie się pęcherzyków powietrza7 i nanolitografia zanurzeniowa8 dla submikronowych plam lipidowych, powlekanie spinowe9 dla dwuwarstwowych stosów oraz Langmuir-Blodgett (LB)10 i fuzja pęcherzyków (VF)11 dla pełnozakresowych, jednowarstwowych powłok lipidowych. Metoda VF polega na adsorpcji małych pęcherzyków jednowarstwowych do stałego podłoża, a następnie spontanicznym pęknięciu i fuzji w celu utworzenia ciągłej dwuwarstwy lipidowej. Jednak w warunkach fizjologicznych spontaniczne pękanie pęcherzyków ogranicza się głównie do materiałów na bazie krzemu, takich jak dwutlenek krzemu, szkło i mika. Ponadto pękanie pęcherzyków nie następuje spontanicznie w przypadku pęcherzyków o złożonym składzie lipidowym, takich jak te zawierające wysokie frakcje cholesterolu lub ujemnie naładowane lipidy. W zależności od systemu, pękanie pęcherzyków może być wywołane przez dalsze dostosowanie warunków eksperymentalnych, takich jak temperatura12, pH roztworu13 i zasolenie14, szok osmotyczny15 lub ciśnienie16 lub dodanie jonów dwuwartościowych, takich jak Ca2 + 17 . Alternatywnie, aktywny błonowo peptyd AH może być wprowadzony w celu destabilizacji warstwy zaadsorbowanych pęcherzyków, co prowadzi do pęknięcia pęcherzyków i powstania dwuwarstwowych na różnych powierzchniach18-22.

Ponadto, pomyślne tworzenie dwuwarstw wymaga przygotowania dobrze kontrolowanej populacji małych pęcherzyków jednowarstwowych, co może być czasochłonne i trudne do osiągnięcia dla niektórych kompozycji błonowych. W związku z tym, pomimo wysokiej skuteczności w optymalnych przypadkach (np. po intensywnej obróbce wstępnej pęcherzyków metodą zamrażania i rozmrażania23), ogólne zastosowanie fuzji pęcherzyków jest ograniczone zakresem odpowiednich substratów i kompozycji membranowych.

Metoda dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)24-28 jest alternatywną techniką wytwarzania, która nie wymaga pęcherzyków lipidowych. Metoda opiera się na osadzaniu cząsteczek lipidów na powierzchni ciała stałego w obecności mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego, a następnie stopniowej wymianie tego rozpuszczalnika na wodny roztwór buforowy w celu wywołania tworzenia SLB. Na etapie wymiany rozpuszczalnika trójskładnikowa mieszanina lipidów, rozpuszczalnika organicznego i wody ulega szeregowym przemianom fazowym ze wzrostem frakcji wodnej, co prowadzi do powstania struktur fazy lamelarnej w roztworze masowym i SLB na podłożu stałym. Co ważne, ta droga samoorganizacji omija potrzebę pęknięcia pęcherzyka, co zwykle jest etapem granicznym dla przekształcenia zaadsorbowanych pęcherzyków w SLB. Protokół ma zastosowanie do szerokiej gamy powierzchni, w tym dwutlenku krzemu, tlenku glinu, chromu, tlenku indu i cyny i złota. W niniejszej pracy oraz w towarzyszącym jej filmie przedstawiono porównanie depozycji lipidów metodą SALB i fuzji pęcherzykowej. W szczególności omówiono wpływ parametrów doświadczalnych, w tym stężenia lipidów, natężenia przepływu oraz wyboru mieszalnego z wodą rozpuszczalnika organicznego, na jakość dwuwarstwy utworzonej metodą SALB. Charakterystyka analityczna wytworzonych SLB jest wykonywana za pomocą technik QCM-D, mikroskopii fluorescencyjnej i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Monitorowanie QCM-D jest wrażliwą powierzchniowo techniką pomiaru masy, która od czasu pionierskich prac przeprowadzonych przez Kellera i Kasemo29 jest szeroko stosowana do ilościowego badania powstawania dwuwarstw. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia kontrolę jednorodności błony, a także wizualizację domen błonowych. Technika FRAP jest standardowym narzędziem do określania ruchliwości bocznej cząsteczek lipidów w SLB, co jest istotną właściwością błon płynowych.

Pierwsza część tego badania obejmuje analizę QCM-D metod SALB i fuzji pęcherzyków stosowanych do próby tworzenia dwuwarstw na dwutlenku krzemu i złocie. W drugiej części przedstawiono przygotowanie i scharakteryzowanie podpartych błon zawierających szereg stężeń cholesterolu metodą SALB oraz porównano wyniki z uzyskanymi metodą fuzji pęcherzykowej.

Protokół

1. Tworzenie podpartej dwuwarstwy lipidowej na hydrofilowym stałym podłożu

  1. Przygotować podstawowe roztwory lipidów zawierające 1,2 mg/ml 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisamina rodamina Bsulfonyl) (Rh-PE) przez rozpuszczenie odpowiednich proszków lipidowych (odpowiednio zważonych uprzednio za pomocą analitycznego bilansu masy) w roztworze izopropanolu.
  2. Rozcieńczyć i wymieszać roztwory podstawowe w izopropanolu w celu przygotowania pożądanej mieszaniny lipidów o końcowym stężeniu. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej i eksperymentów FRAP w mieszaninie lipidów należy uwzględnić 0,5% wag.
  3. Wstrzyknąć mieszaninę lipidów z izopropanolem do kanału mikroprzepływowego, aż zostanie on wypełniony.
  4. Mieszaninę lipidów należy inkubować na powierzchni szkła przez około 10 minut.
  5. Stopniowo zastępować roztwór lipidowy wodą lub roztworem buforowym za pomocą pompy perystaltycznej przy bardzo niskim natężeniu przepływu (10-50 μl/min). Alternatywnie, mieszaninę lipidów można zastąpić przez wielokrotne pipetowanie.
  6. Dokładnie przepłukać kanał nadmiarem buforu w celu usunięcia pozostałości izopropanolu.

2. Tworzenie błon podporowych wzbogaconych w cholesterol

Uwaga: Stała powierzchnia (SiO2) wspomaga fuzję pęcherzyków, ale skład membrany (wysoki poziom cholesterolu) hamuje fuzję pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki wzbogacone w cholesterol mają wysoką sztywność zginania30.

  1. Przygotować roztwór podstawowy zawierający 10 mg/ml lipidów DOPC, 10 mg/ml cholesterolu i 1 mg/ml Rh-PE, rozpuszczając najpierw odpowiednie proszki w izopropanolu.
  2. Powtórz kroki 1.2-1.6, używając roztworów podstawowych przygotowanych w kroku 2.1.

3. Test płynności membrany

  1. Zanurzyć szkiełko w roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS) (1%) na 10 minut.
  2. Dokładnie umyj szkiełka wodą dejonizowaną i spłucz etanolem.
  3. Suszyć szkiełka suszarką przy użyciu delikatnego strumienia azotu.
  4. Wystaw szkiełka na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej.
  5. Usuń powłokę folii ochronnej z komercyjnej komory mikroprzepływowej bez dna (Rysunek 1A) za pomocą pęsety i przymocuj szklane szkiełko do lepkiej strony komory (Rysunek 1B).
  6. Zamontuj złącza i rurki w pozycji wlotowej i wylotowej komory i umieść kanał mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu (Rysunek 1C).
  7. Utworzyć znakowaną fluorescencyjnie dwuwarstwę lipidową w kanale mikroprzepływowym [powtórzyć krok 1, stosując żądany skład lipidowy (np. 0,5 mg/ml DOPC) w tym 0,5% wag. Rh-PE w rozpuszczalniku organicznym].
  8. Zlokalizuj płaszczyznę dwuwarstwową za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60X (NA 1.49), aby uchwycić obrazy.
  9. Wykonaj dwa zdjęcia przed wybielaniem, a następnie wybiel foto okrągłą plamkę o szerokości 30 μm za pomocą wiązki laserowej o długości fali 532 nm i 100 mW. Przed fotowybielaniem rozgrzej laser, aż jego intensywność się ustabilizuje. Natychmiast po fotowybielaniu wykonuj serię zdjęć co 1 sekundę przez 2 minuty, aby śledzić powrót intensywności fluorescencji w wybielonym miejscu.

4. Test ilościowy cholesterolu

  1. Wystaw chip czujnika kryształu kwarcu pokrytego dwutlenkiem krzemu na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Wyjmij chip z komory i natychmiast zamontuj chip w komorze pomiarowej.
  2. Przed eksperymentem najpierw uzyskaj częstotliwość i rozproszenie chipa czujnika w powietrzu, aby zapewnić prawidłowy montaż.
    1. W przypadku komercyjnego przyrządu Q-Sense E1 lub E4 QCM-D uruchom oprogramowanie Q-Soft i kliknij "Akwizycja" i wybierz "Ustaw pomiar".
    2. W nowym oknie, które się pojawi, sprawdź alikwoty: 3, 5, 7, 9, 11 i 13, a następnie kliknij Znajdź i uruchom, aby sprawdzić widma rezonansowe. Ustaw temperaturę na 24 °C. Jeśli jedna lub więcej częstotliwości rezonansowych nie zgadza się z oczekiwanymi wartościami, sprawdź mocowanie chipa i powtarzaj ten krok, aż do osiągnięcia porozumienia.
  3. Uruchomić pompę perystaltyczną i roztwór buforowy przepływu (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) do komory pomiarowej przy natężeniu przepływu 100 μl/min.
  4. W oprogramowaniu kliknij "Akwizycja" i wybierz "Uruchom ponownie pomiar", aby zarejestrować częstotliwość rezonansową i sygnały rozpraszania energii. Powtarzaj ten krok, aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej dla zmian częstotliwości i rozpraszania. Uwaga: W przypadku kolejnych kroków będą występować dodatkowe przesunięcia częstotliwości i rozpraszania, które można zarejestrować w funkcji czasu.
  5. Wstrzyknąć izopropanol (bez lipidów) na 10 minut.
  6. Mieszaninę lipidów/cholesterolu DOPC o pożądanym stosunku molowym o całkowitym stężeniu lipidów 0,5 mg/ml wstrzyknąć w izopropanol przez 10 minut.
  7. Wstrzykiwać bufor przez 20 minut przy natężeniu przepływu 100 μl/min.
  8. Wstrzyknąć roztwór 1 mM metylo-β-cyklodekstryny (MβCD) przygotowany w buforze (szybkość przepływu 100 μl/min) do momentu, gdy sygnał częstotliwości osiągnie stabilną wartość.
  9. Zmierzyć względne dodatnie przesunięcia częstotliwości, które są spowodowane etapem leczenia MβCD i obliczyć masę cholesterolu i lipidów DOPC, przeliczając wartościΔf cho i Δf DOPC na wartości masy, stosując równanie Sauerbreya [Δm = -(C/n)×Δf, gdzie C=17,7 ng/cm2, n:alikwot].
  10. Obliczyć ułamek molowy cholesterolu w SLB, biorąc pod uwagę masy cząsteczkowe lipidów DOPC (786,1 g/mol) i cholesterolu (386,6 g/mol).

Wyniki

Wytwarzanie wspieranych dwuwarstw lipidowych na podłożach hydrofilowych.

Metody tworzenia VF i SALB przetestowano na dwutlenku krzemu oraz złocie, a procesy formowania monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą techniki pomiarowej QCM-D. Instrument QCM-D mierzy zmiany częstotliwości rezonansowej (Δf) oscylującego piezoelektrycznego kryształu kwarcu podczas adsorpcji masy na powierzchni kryształu. Dodatkowo instrument QCM-D mierzy dysypację energii oscylacji w celu scharakteryzowania właściwości wiskoelastycznych (sztywności i miękkości) warstwy adsorpcyjnej. Eksperymenty z fuzją pęcherzyków przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem31. W skrócie, najpierw ustalono linię bazową dla sygnałów częstotliwości i dysypacji w wodnym roztworze buforowym [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5; (Rycina 2A i B)]. Następnie, w czasie t = 10 min (strzałka 1), wstrzyknięto małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe DOPC w tym samym buforze na dwutlenek krzemu (Rycina 2A) oraz złoto (Rycina 2B). W przypadku fuzji pęcherzyków na dwutlenku krzemu zaobserwowano dwustopniową kinetykę adsorpcji, z końcowymi zmianami częstotliwości i dysypacji energii wynoszącymi odpowiednio −26 (± 1) Hz oraz 0,3 (± 0,2) × 10−6. Wartości te są zgodne z procesem tworzenia wspartej lipidowej dwuwarstwy29.

Jak pokazano na Rysunku 2B, dodanie roztworu pęcherzyków do powierzchni złota doprowadziło do jednoczesnego spadku sygnału Δf i wzrostu sygnału ΔD, aż ich wartości osiągnęły odpowiednio −150 (± 10) Hz oraz (7.5 ± 2) × 10−6. Wartości te odpowiadają utworzeniu adsorbowanej warstwy pęcherzyków. Zatem, zgodnie z oczekiwaniami, na złocie nie utworzyło się SLB metodą fuzji pęcherzyków.

Analiza QCM-D w celu utworzenia dwuwarstwy na dwutlenku krzemu i złocie metodą SALB została przedstawiona na Rysunku 2C i D. Na dwutlenku krzemu uzyskano końcowe przesunięcia Δf oraz ΔD wynoszące odpowiednio −25,6 (± 0,55) Hz i 0,4 (± 0,27) × 10−6, a wartości te wskazują na utworzenie SLB. Podobne zakresy Δf i ΔD (ΔfAu: −27,3 ± 2,7 Hz, ΔDAu: 0,48 (± 0,26) × 10−6) zaobserwowano na złocie. Wyniki te potwierdzają, że metoda SALB umożliwia tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych na powierzchniach, które zapobiegają pękaniu pęcherzyków.

Wpływ szybkości przepływu podczas wymiany rozpuszczalnika na jakość wspieranych dwuwarstw lipidowych.

Aby określić optymalne warunki otrzymywania wysokiej jakości wspieranych dwuwarstw lipidowych metodą SALB, zbadano wpływ stężenia lipidów, szybkości wymiany rozpuszczalnika oraz rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika organicznego.

Rysunek 3 przedstawia zmianę częstotliwości QCM-D podczas końcowego etapu protokołu SALB, przeprowadzonego na dwutlenku krzemu przy dwóch różnych prędkościach przepływu (100 i 600 µl/min) oraz dwóch różnych stężeniach lipidów (0,125 i 0,5 mg/ml).

W przypadku zastosowania lipidu DOPC w stężeniu 0.5 mg/ml (Rysunek 3A), formowanie dwuwarstwy nie było zależne od szybkości przepływu, a przy obu szybkościach uzyskano końcowy przesunięcie Δf wynoszące około −26 Hz.

W przeciwieństwie do tego, przy zastosowaniu niższego stężenia lipidów, ilość zaadsorbowanych lipidów po całkowitej wymianie rozpuszczalnika była znacząco zależna od szybkości przepływu (Rycina 3B). Przy średniej szybkości przepływu 100 µl/min formowanie dwuwarstwy było kompletne (Δf około −26 Hz). Jednak przy sześciokrotnie wyższej szybkości przepływu (600 µl/min) pełna dwuwarstwa nie została utworzona (Δf około −17 Hz). Wyniki te stanowią wytyczną przy wyborze odpowiednich warunków eksperymentalnych dla skutecznego formowania dwuwarstwy metodą SALB z zastosowaniem izopropanolu jako wybranego rozpuszczalnika organicznego.

Charakterystyka wspieranych dwuwarstw lipidowych utworzonych z różnych stężeń lipidów w różnych roztworach alkoholi.

Stężenie lipidów jest kolejnym parametrem wpływającym na jakość SLB otrzymywanych metodą SALB. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że przy stężeniu lipidów 0,05 mg/ml tworzyły się jedynie odizolowane, submikroskopowe struktury lipidowe (Rysunek 4A). Wraz ze wzrostem stężenia lipidów stosowanych w procedurze SALB, intensywność fluorescencji struktur lipidowych stawała się bardziej jednorodna. Przy stężeniu lipidów 0,1 mg/ml występowały mikroskopijne plamy lipidowe, choć struktury te nie obejmowały całego pola widzenia (Rysunek 4B). Jednakże, przy zastosowaniu stężenia lipidów 0,25 mg/ml, utworzyła się jednorodna dwuwarstwa lipidowa (Rysunek 4C). Zatem istnieje minimalne stężenie lipidów wymagane do utworzenia kompletnej, w pełni rozległej SLB.

Wpływ stężenia lipidów na końcowy wynik eksperymentów SALB zbadano również w szerszym zakresie stężeń lipidów (0,01 do 5 mg/ml) oraz w różnych rozpuszczalnikach organicznych (izopropanol, etanol i n-propanol). Wartości Δf i ΔD odpowiadające ostatniemu etapowi procedury SALB przedstawiono na Rysunku 5.

Formowanie dwuwarstwy zdefiniowano na podstawie końcowych zmian częstotliwości oraz dyssypacji energii, wynoszących odpowiednio od -25 do -30 Hz oraz mniej niż 0,5 x 10-6. Na podstawie tych kryteriów ustalono, że optymalny zakres stężenia lipidów niezbędny do utworzenia wspartej dwuwarstwy lipidowej wynosi od 0,1 do 0,5 mg/ml, niezależnie w dużej mierze od rodzaju rozpuszczalnika organicznego. Odchylenia uzyskanych przesunięć Δf i ΔD poza wspomniany zakres wynikają z obecności dodatkowej masy (np. stosów dwuwarstw), występowania morfologii niebłonowych (np. pęcherzyków, miceli robakopodobnych) oraz obecności pofragmentowanych wysepek dwuwarstw o niepełnej morfologii na podłożu.

Chociaż procedura SALB służąca do otrzymywania wspieranych dwuwarstw lipidowych jest stosunkowo odporna na błędy, optymalne stężenie lipidów dla utworzenia wysokiej jakości dwuwarstwy może wymagać dostrojenia w zależności od konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. W zasadzie dla optymalnego tworzenia dwuwarstwy metodą SALB istnieje nie tylko minimalne, ale również maksymalne wymagane stężenie lipidów. Optymalny zakres stężeń zależy od szybkości przepływu i może być również zależny od podłoża oraz składu lipidów. Empirycznie w wielu przypadkach ustaliliśmy, że stężenie lipidów 0,5 mg/ml i szybkość przepływu 100 µl/min stanowią optymalny zestaw warunków dla utworzenia homogenicznej wspieranej dwuwarstwy lipidowej. Jednak w zależności od składu lipidów i geometrii celi przepływowej — ta ostatnia wpływa na profil przepływu podczas wymiany rozpuszczalnika — może być konieczna dalsza optymalizacja stężenia lipidów. Dlatego zalecamy przeprowadzenie pilotażowych eksperymentów SALB przy użyciu stężenia lipidów 0,5 mg/ml i ocenę jakości dwuwarstwy za pomocą techniki QCM-D lub mikroskopii fluorescencyjnej. Jeśli dwuwarstwy wydają się niekompletne, należy zwiększać stężenie lipidów w krokach 10% aż do uzyskania satysfakcjonujących wyników. Jeśli wydaje się, że dwuwarstwa współistnieje z dodatkowymi strukturami lipidowymi, należy zmniejszać stężenie lipidów w krokach 10% aż do uzyskania satysfakcjonujących wyników.

Tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych o różnych składach lipidowych i różnych frakcjach cholesterolu.

Następnie, w celu utworzenia SLB wzbogaconych w cholesterol, zastosowano metody SALB oraz VF. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (100 × 100 µm) membran wspieranych zawierających cholesterol, przygotowanych metodą SALB. Membrany składają się z okrągłych domen wykluczających barwnik, otoczonych fazą ciągłą charakteryzującą się jednorodną jasnością fluorescencji. Powierzchnia ciemnych domen zwiększała się wraz ze wzrostem frakcji cholesterolu w prekursorowej mieszaninie lipidów. Następnie przeprowadzono pomiary FRAP w celu zbadania płynności filmów lipidowych dwuwarstwowych. Pomiary FRAP wykazały niemal całkowity powrót fluorescencji w fazie otaczającej, co wskazuje na lateralną mobilność lipidów i tym samym na utworzenie pojedynczej dwuwarstwy lipidowej. Ponieważ Rh-PE rozdziela się preferencyjnie do fazy płynnej, ciemne domeny najprawdopodobniej składają się z gęstych struktur wzbogaconych w cholesterol.

Dla porównania podjęto również próbę wytworzenia dwuwarstw DOPC/Chol przy użyciu metody VF. Pęcherzyki DOPC z rosnącymi frakcjami cholesterolu (10 - 40 mol%) przygotowano metodą ekstruzji pęcherzyków. Jako znacznik fluorescencyjny do obrazowania wykorzystano lipid Rh-PE (0,5 wt%). Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (100 × 100 µm) struktur powstałych po inkubacji szklanych podłoży z pęcherzykami zawierającymi cholesterol. Analiza FRAP wykazała utworzenie płynnej dwuwarstwy lipidowej w przypadku zastosowania pęcherzyków zawierających 20 mol% Chol lub mniej. Jednakże próbki przygotowane z pęcherzykami o wyższych frakcjach cholesterolu nie wykazały regeneracji, co wskazuje na obecność zaadsorbowanych, ale niepękniętych pęcherzyków.

Frakcję cholesterolu, która została ostatecznie włączona do wspieranych lipidowych dwuwarstw, określono jako funkcję frakcji cholesterolu zawartej w prekursorowej mieszaninie lipidów w rozpuszczalniku organicznym w metodzie SALB lub w pęcherzykach w roztworze wodnym w metodzie VF. Z zastosowaniem techniki QCM-D monitorowano tworzenie dwuwarstwy, a następnie dodano MβCD w celu specyficznego usunięcia Chol z wspieranych lipidowych dwuwarstw32. Ubytek masy wynikający z usunięcia cholesterolu doprowadził do spadku wartości bezwzględnej przesunięcia częstotliwości (|Δf|) powiązanego z SLB. Względne dodatnie przesunięcia częstotliwości wywołane etapem traktowania MβCD przedstawiono na Rysunku 8A. Udział molowy cholesterolu obliczono na podstawie przesunięcia częstotliwości, jak przedstawiono na Rysunku 8B.

Frakcja cholesterolu wbudowana w wsparte lipidowe dwuwarstwy przygotowane metodą SALB była niemal liniowo proporcjonalna do zawartości cholesterolu w prekursorowej mieszaninie lipidów. Co ciekawe, frakcja cholesterolu w dwuwarstwach przygotowanych metodą VF (pęcherzyki zawierające do 20 mol% Chol) była znacznie niższa niż w pęcherzykach prekursorowych. W rzeczywistości najwyższa frakcja cholesterolu uzyskana metodą VF wynosiła zaledwie około 10 mol%.

Obserwacja nadstruktury pasmowej w obszarze współistnienia dwóch faz β w lipidowych dwuwarstwach wspieranych z cholesterolu i fosfolipidów.

Doświadczenia SALB przeprowadzono dalej z wykorzystaniem mieszaniny lipidów o jeszcze wyższym udziale cholesterolu. Przy zastosowaniu mieszaniny DOPC i cholesterolu w stosunku 4:6 zaobserwowano stopniowe rozwarstwianie się jednorodnej fazy ciekłej na dwie współistniejące fazy, widoczne jako jasne domeny w kształcie pasów na ciemnym tle (wykluczającym barwnik) (Rycina 9). Ustalono, że Rh-PE jest wykluczany z domen bogatych w cholesterol33, w związku z czym przeważające ciemne domeny, które pojawiły się w tle, są obszarami wzbogaconymi w cholesterol. Powstawanie jasnych domen o rozmiarach mikronowych na ciemnym tle przy wysokim udziale cholesterolu (>50 mol%) jest zgodne z obszarem β na wykresie fazowym monowarstwy mieszanin cholesterolu i fosfolipidów34,35. Ponadto tworzenie się domen pasmowych, które wynikają ze słabego napięcia liniowego, sugeruje, że mieszanina znajduje się w pobliżu krytycznego punktu mieszalności.

Urządzenia mikrofluidyczne i układy do eksperymentów z dynamiką płynów, przedstawiające sprzęt i warianty konstrukcyjne.
Rycina 1. Komora mikrofluidyczna do tworzenia SALB w konfiguracji odpowiedniej do mikroskopii epifluorescencyjnej. (A) Komercyjna komora mikrofluidyczna, (B) Szklana lamella przymocowana do klejącej strony komory, (C) Kompletny układ na uchwycie mikroskopowym z rurkami podłączonymi do portów wlotowych i wylotowych komory oraz (D) Pompa perystaltyczna używana do kontrolowania szybkości wymiany rozpuszczalnika. Lipidy rozpuszczone w izopropanolu są wstrzykiwane do komory pomiarowej za pomocą pompy perystaltycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fuzja pęcherzyków, metody wspomagane rozpuszczalnikiem; wykresy częstotliwości i dyssypacji; powierzchnie krzemionkowe i złote.
Rycina 2. Analiza QCM-D fuzji pęcherzyków oraz eksperymenty SALB na podłożach z dwutlenku krzemu i złota. Odpowiedzi częstotliwości (Δf, niebieska) i dyssypacji (ΔD, czerwona) QCM-D dla trzeciej harmonicznej (n = 3) zarejestrowano w funkcji czasu podczas adsorpcji lipidów na (A i C) dwutlenku krzemu, (B i D) złocie. Panele a i b przedstawiają metodę fuzji pęcherzyków. Pęcherzyki lipidowe DOPC wstrzyknięto w czasie t = 10 min (strzałka 1). Panele c i d odpowiadają metodzie tworzenia SALB. Strzałki wskazują wstrzyknięcie buforu (1), izopropanolu (2), mieszaniny lipidowej [0,5 mg/ml lipidów DOPC w izopropanolu; (3)] oraz wymianę buforu (4). Przerywana krzywa w panelu B odpowiada eksperymentowi kontrolnemu, w którym nie wstrzyknięto lipidów. Podano końcowe wartości Δf i ΔD dla każdej powierzchni. Schematy przedstawiają proponowane struktury zmontowanych lipidów, wywnioskowane z końcowych przesunięć częstotliwości i dyssypacji. Adaptowano z referencji 24 i użyto za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres zmiany częstotliwości, ΔCzęstotliwość vs. Czas, szybkości przepływu cieczy, analiza danych, zmienność Hz.
Rysunek 3. Wpływ szybkości wymiany rozpuszczalnika na proces tworzenia SALB. Zmiany częstotliwości QCM-D (Δf) odpowiadające ostatniemu etapowi (patrz Strzałka 4 na Rysunku 2C) w metodzie SALB zostały zmierzone na dwutlenku krzemu przy dwóch różnych szybkościach wymiany, 100 i 600 µl/min, stosując (A) 0,5 mg/ml oraz (B) 0,125 mg/ml lipidu DOPC w izopropanolu. Określono również końcowe wartości Δf w porównaniu do linii bazowej pomiaru w wodnym roztworze buforowym. Adaptowano z referencji 24 i wykorzystano za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające struktury komórkowe w skali 30μm w fluorescencji czerwonej.
Rysunek 4. Próg stężenia lipidów dla pełnego tworzenia SALB. Mikroskopia epifluorescencyjna warstw lipidowych na dwutlenku krzemu przygotowanych metodą SALB przy zastosowaniu stężenia lipidów (A) 0,05 mg/ml; (B) 0,1 mg/ml; oraz (C) 0,25 mg/ml. Adaptowano z publikacji 26 i użyto za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wpływ rozpuszczalnika na dwuwarstwę; wykres częstotliwości i dyssypacji dla izopropanolu, etanolu, n-propanolu.
Rycina 5. Wpływ stężenia lipidów i rozpuszczalnika organicznego na tworzenie wspieranej lipidowej dwuwarstwy metodą SALB. Końcowe zmiany częstotliwości (A) i dyssypacji energii (B) w QCM-D dla eksperymentów SALB z użyciem różnych rozpuszczalników organicznych w funkcji stężenia lipidów. Zielone linie przerywane odpowiadają oczekiwanym przesunięciom częstotliwości i dyssypacji dla pełnej dwuwarstwy (-30 Hz < Δf < -25 Hz oraz ΔD < 1 x 10-6). Adaptowano z referencji 26 i użyto za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tworzenie domen w SALB z różną zawartością cholesterolu; mikroskopia fluorescencyjna; analiza histogramu danych.
Rysunek 6. Analiza powrotu fluorescencji po fotobieleniu w przypadku wspieranych dwuwarstw lipidowych z różnymi frakcjami cholesterolu, przygotowanych metodą SALB na podłożu szklanym. (A-E) Mikrografie fluorescencyjne dwuwarstw przygotowanych przy użyciu różnych frakcji cholesterolu w mieszaninie prekursorowej. Obrazy zarejestrowano bezpośrednio (góra) oraz 1 min (środek) po fotobieleniu. Ciemna plama w centrum obrazu odpowiada obszarowi poddanemu fotobieleniu. Paski skali wynoszą 20 µm. Przedstawiono również histogramy powierzchni poszczególnych domen wykluczających barwnik w każdej próbce (dół). Adaptowano z odniesienia 36 i użyto za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment dynamicznego rozpraszania światła na pęcherzykach; mikroskopia fluorescencyjna pokazująca stabilność pęcherzyków w czasie.
Rysunek 7. Analiza FRAP dla wspartych dwuwarstw zawierających cholesterol, przygotowanych metodą fuzji pęcherzyków. (A-D) Mikrografie fluorescencyjne dwuwarstw przygotowanych z wykorzystaniem różnych frakcji cholesterolu (od 10 do 40 mol%) w pęcherzykach prekursorowych. Obrazy zarejestrowano natychmiast (góra) oraz 1 min (dół) po fotowybielaniu. Ciemna plama w centrum obrazu odpowiada obszarowi poddanemu fotowybielaniu. Paski skali wynoszą 20 µm. Adaptowano z referencji 36 i użyto za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza mieszaniny lipidów: wykres czasu w funkcji częstotliwości; wyniki badania uszczuplenia cholesterolu w porównaniu z fuzją pęcherzyków.
Rysunek 8. Ilościowe oznaczenie frakcji cholesterolu w lipidowych dwuwarstwach wspartych. (A) Pozytywne przesunięcie częstotliwości QCM-D po wstrzyknięciu 1 mM MβCD do lipidowych dwuwarstw wspartych z różnymi ułamkami molowymi cholesterolu w mieszaninie prekursorowej (od 0 do 50 mol%). (B) Procent molowy cholesterolu usuniętego z dwuwarstw przygotowanych metodami SALB i fuzji pęcherzyków w funkcji frakcji cholesterolu w mieszaninach prekursorowych lub pęcherzykach. Adaptacja z odniesienia 36, użyte za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Seria obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej; agregacja białek w czasie, t=0, t=10 min, t=20 min.
Rycina 9. Zależna od czasu ewolucja mikrostruktury fluorescencyjnej w podpartej dwuwarstwie DOPC/Chol (stosunek molowy 4:6 zawierający 0.5% Rhodamine-PE) przygotowanej metodą SALB. Jednorodna faza stopniowo ulega rozdzieleniu na obszar koegzystencji ciecz-ciecz po całkowitej wymianie rozpuszczalnika. Adaptacja z referencji 37, użyte za zgodą American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono protokół wymiany rozpuszczalnika, w którym lipidy w alkoholu (izopropanolu, etanolu lub n-propanolu) są inkubowane ze stałym podłożem, a następnie alkohol jest stopniowo zastępowany wodnym roztworem buforowym w celu wywołania szeregu przemian fazowych, ostatecznie tworząc dwuwarstwy lipidowe w fazie blaszkowatej24. Wykazano, że metoda ta umożliwia wytwarzanie podpartych dwuwarstw lipidowych na powierzchniach takich jak złoto, co jest niewykonalne w przypadku metody fuzji pęcherzykowej.

Określono optymalny zakres stężeń lipidów (0,1 - 0,5 mg/ml) dla pełnego utworzenia dwuwarstw w standardowych formatach eksperymentalnych testowanych do tej pory. Przy stężeniach lipidów poniżej 0,1 mg/ml tworzą się dyskretne, mikroskopijne plamy dwuwarstw. Z drugiej strony przy stężeniach powyżej 0,1 mg/ml i niższych niż 0,5 mg/ml tworzy się kompletna i jednolita dwuwarstwa. Przy stężeniach lipidów powyżej tego zakresu nadal tworzyła się płynna dwuwarstwa, co zweryfikowano za pomocą analizy FRAP, jednak mikroskopia fluorescencyjna ujawnia obecność dodatkowych struktur lipidowych na wierzchu dwuwarstwy. Uderzające jest to, że morfologia tych dodatkowych struktur lipidowych, określona za pomocą analizy QCM-D, zależała od alkoholu, który został użyty na etapie inkubacji. W przypadku etanolu stosunkowo wysokie przesunięcia Δf i ΔD przypominają sygnaturę QCM-D uzyskaną dla zaadsorbowanej warstwy pęcherzyków. Gdy zamiast tego zastosowano izopropanol lub n-propanol, Δf było nieco wyższe niż wartość oczekiwana dla dwuwarstwy (końcowe Δf między -30 a -40 Hz), podczas gdy ΔD było znacznie wyższe. Takie odpowiedzi QCM-D można by się spodziewać w przypadku rozszerzonych struktur lipidowych (np. miceli przypominających robaki) wystających na zewnątrz z powierzchni błony (co w niektórych przypadkach widać pod mikroskopią fluorescencyjną).

Szybkość wymiany rozpuszczalnika jest kolejnym ważnym parametrem, który może mieć kluczowe znaczenie, zwłaszcza gdy stosowane są niższe stężenia lipidów (np. 0,1 mg/ml). Szybka wymiana rozpuszczalnika przy niskim stężeniu lipidów może prowadzić do powstania niekompletnych dwuwarstw. W standardowej komorze pomiarowej używanej do pomiarów QCM-D w tym artykule (komora pomiarowa Q-Sense E4) natężenia przepływu wynoszące około 100 μl/min były odpowiednie do wysoce powtarzalnego kompletnego tworzenia dwuwarstw. W przypadku komór przepływowych o innych geometriach i objętości optymalne natężenie przepływu może się różnić i musi zostać empirycznie określone na podstawie kroków sugerowanych w niniejszym dokumencie.

Oprócz tworzenia podpartych dwuwarstw lipidowych na powierzchniach, które są trudne do fuzji pęcherzyków, SALB może być stosowany do obejścia potrzeby pęcherzyków lipidowych, które mogą pękać, otwierając w ten sposób drzwi do wytwarzania wspieranych błon o złożonym składzie. Jako przykładowy skład przedstawiono mieszaniny lipidowe o wysokiej zawartości cholesterolu. Cholesterol jest ważnym składnikiem błon komórkowych ssaków, a jego frakcja może zbliżać się do 45−50% mol% składu lipidowego błony (np. w erytrocytach). Tak więc nawet prosty model dwuwarstwy lipidowej reprezentującej błonę komórkową człowieka powinien zawierać cholesterol.

Podczas gdy fuzja pęcherzykowa może być wykorzystana do wytwarzania płynnych dwuwarstw lipidowych zawierających tylko 10-15% cholesterolu, metoda SALB umożliwia tworzenie płynnych dwuwarstw lipidowych zawierających wysokie frakcje cholesterolu (do 57% mol., jak określono ilościowo za pomocą pomiarów QCM-D)36. Jednak, gdy poziom cholesterolu był jeszcze bardziej podwyższony (do 63 mol.), zaobserwowano domeny w kształcie pasków37. Współistniejące domeny były płynne, przypominające te obserwowane w regionie β na schemacie fazowym monowarstwy cholesterol/fosfolipidy na granicy faz powietrze-woda.

Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że metoda SALB jest prostym i skutecznym podejściem do tworzenia dwuwarstw lipidowych, szczególnie w przypadkach wykraczających poza zakres konwencjonalnej metody fuzji pęcherzyków. Do tej pory technika QCM-D i mikroskopia fluorescencyjna były wykorzystywane głównie do charakteryzowania dwuwarstw lipidowych utworzonych metodą SALB. Patrząc w przyszłość, szeroki zakres technik pomiarów analitycznych wrażliwych na powierzchnię, w tym powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)38, mikroskopia sił atomowych (AFM)39,40, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera41, promieniowanie rentgenowskie42 i odbicie neutronów43, mogą być wykorzystane do dalszego charakteryzowania i badania prostych i złożonych konfiguracji dwuwarstwowych przygotowanych metodą SALB. Te pojawiające się możliwości otwierają drzwi dla większej liczby naukowców, którzy mogą badać sztuczne błony komórkowe, korzystając z prostego i solidnego protokołu eksperymentalnego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Badawczej (NRF -NRFF2011-01 i NRF2015NRF-POC0001-19), Narodowej Rady Badań Medycznych (NMRC/CBRG/0005/2012) oraz Uniwersytetu Technologicznego Nanyang dla N.J.C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
QCM-D Podłoża powlekane dwutlenkiem krzemuQSense AB, 
QCM-D pozłacane podłożaQSense AB, 
Moduł Q-Sense E4QSense AB, 
Szwedzki środek do czyszczenia plazmowego, PDC-32GHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-001 (115V) 
1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polar Lipids850375P
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa) (Rh-PE)Avanti Polar Lipids810150P
cholesterolAvanti Polar Lipids700000P
Metylo-β-cyklodekstrynaSigma C4555
IzopropanolSigma 
EtanolSigma 
n-propanolSigma 
Sticky-Slide I 0,1 LuerIBIDI81128
Kolano męskie 1/8"Cole-Parmer30505-70
Rurka silikonowa 1.6  mm IDIBIDI10842
Szkiełko nakrywkowe szklane nr 1,5H, 25 mm x 75 mmIBIDI10812
Reglo Digital M2-2/12 Pompa perystaltycznaIsmatec
Dodecylosiarczan soduSigma Numer telefonu 71725
SzwecjaSzwecja673773459844279544

Bibliografia

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104(2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wspierana dwuwarstwa lipidowafuzja pęcherzykówtworzenie dwuwarstwy lipidowejwymiana rozpuszczalnikapowrót fluorescencji po fotowybielaniumikrowaga kwarcowaoznaczanie ilości cholesterolutest płynności błonykanał mikroprzepływowy
Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.