To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia przyżyciowe to metoda, która może być używana do badania różnych procesów w różnych regionach i naczyniach u żywych zwierząt. W tym protokole opisujemy mikroskopię przyżytkową żył krezkowych. Można to zrobić w krótkim czasie, uzyskując powtarzalne wyniki pokazujące interakcje leukocyty-śródbłonek in vivo. Opisujemy stan zapalny po prowokacji śródbłonka przez LPS. Ale w tym modelu można zastosować wiele różnych rodzajów stanów zapalnych, takich jak bakteryjne, chemiczne lub biologiczne, i badać podawanie leków i ich bezpośredni wpływ na żywe zwierzę oraz jego wpływ na rekrutację leukocytów. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w wielu różnych metodach leczenia myszy i ich wpływie na odpowiedź zapalną w naczyniach. W niniejszym artykule opisujemy wizualizację leukocytów i płytek krwi poprzez fluorescencyjne znakowanie ich rodaminą 6G. Dodatkowo, dowolne specyficzne obrazowanie może być wykonane przy użyciu ukierunkowanych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie.
Wprowadzenie
Celem tego protokołu jest opisanie uproszczonej techniki mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u żywych myszy do bezpośredniej obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i leukocytów-płytek krwi w warunkach zapalnych.
Mikroskopia przyżyciowa została opracowana do badania interakcji leukocytów i śródbłonka in vivo w warunkach zapalnych1,2, co nie jest trywialne, ale ważne dla zrozumienia rekrutacji i funkcji leukocytów zapalnych. Metoda, którą opisujemy w niniejszym protokole, została opracowana w oparciu o wcześniej opublikowane publikacje. Podobnie jak w przypadku wizualizacji włączenia płytek krwi do rosnącej skrzepliny3 i równolegle do tego, co zostało opublikowane wcześniej4, zewnętrzna żyła krezkowa jest badana za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Istnieje wiele innych modeli mikroskopii przyżyciowej, takich jak mięsień cremaster u szczurów5 lub wątroba myszy i szczurów6.
Mikroskopia przyżylna żyły krezkowej została opracowana i zastosowana w poprzednich badaniach przez kilka grup. Użyliśmy tej techniki, aby zaobserwować różnice w rekrutacji leukocytów między myszami typu dzikiego a hydroksylazą tryptofanu1 (Tph1) -/- myszy, które mają niedobór nieneuronalnej serotoniny i porównaliśmy wyniki z myszami, u których serotonina płytkowa była farmakologicznie zubożona przez długotrwałe stosowanie selektywnego inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny fluoksetyny7. Zbadano również interakcje leukocyty-śródbłonek po ostrym leczeniu fluoksetyną8.
W tym protokole skupiamy się na mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych, ponieważ ten model można wykonać szybko i pozwala na prawidłowe pomiary interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów. Jest to znacznie trudniejsze i bardziej czasochłonne w mikroskopii przyżyciowej innych narządów, takich jak kości, wątroba, skóra lub mięsień cremaster. Opisany tutaj model jest idealny do powtarzalnej oceny interakcji zapalnej komórka-komórka po sprowadzeniu jej za pomocą bodźca zapalnego, takiego jak dootrzewnowe wstrzyknięcie lipopolisacharydu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt (TierSchG). Myszy trzymano w pomieszczeniach i obchodzono się z nimi zgodnie z dobrą praktyką zwierzęcą określoną przez FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) i krajowy organ ds. dobrostanu zwierząt GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Komisja ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu we Fryburgu Bryzgowijskim oraz władze lokalne (Regierungspräsidium Freiburg) zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Postępowanie ze zwierzętami, przygotowanie i indukcja stanu zapalnego
- Użyj 4-6 tygodniowych samców myszy o wadze 16 - 20 g. Uwaga: Jeśli myszy są starsze lub cięższe, wykazują nadmierną ilość tłuszczu otaczającego naczynie, co ogranicza obserwację mikroskopową.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia i stół mikroskopowy przed zabiegiem.
- Wstrzyknąć 20 mg/kg LPS (lipopolisacharyd) dootrzewnowo na 4 godziny przed mikroskopią żywej myszy w celu wywołania zapalenia bakteryjnego.
- Podgrzej 0,9% roztwór soli fizjologicznej w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby nawilżyć plastikową komorę i tkankę krezkową.
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) tuż przed zabiegiem mikroskopowym. Można zastosować alternatywne znieczulenie, np. inhalację 2% izofluranu. Prawidłowe znieczulenie potwierdzić utratą odpowiedzi na stymulację odruchową (uszczypnięcie palca u nogi lub ogona przy mocnym ucisku).
- Zdepiluj brzuch za pomocą golarki i usuń luźne włosy gazą nasączoną etanolem 70%.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Chirurgia
- Wysterylizuj brzuch przy użyciu 70% etanolu. Ta metoda nie jest metodą sterylną i może być śmiertelna pod koniec eksperymentu.
- Wykonaj laparotomię pośrodkową: Otwórz skórę brzucha za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy i małych nożyczek. Zidentyfikuj naczynia epigastryczne i otwórz otrzewną w okolicy kresy białej, aby chronić naczynia.
- Nałóż kilka kropli podgrzanej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać wilgotność tkanki.
- Znakować fluorescencyjnie leukocyty i płytki krwi przez wstrzyknięcie 50 μl rodaminy 6G (1 mg/ml) po orbicie, jak opisano wcześniej w punkcie 9,10.
- Zewnętrznie uformować pętlę jelita krętego i umieścić ją w pietryszku o średnicy 10 cm i upewnić się, że tkanka jest wilgotna, stosując wstępnie podgrzany roztwór soli o temperaturze 37 °C (0,9%) co drugą minutę.
3. Mikroskopia przyżyciowa
- Umieść mysz pod mikroskopem i umieść żyłę krezkową o średnicy 200 - 300 μm w centrum view. Wybierz naczynie bez widocznego tłustego otoczenia.
- Nie dotykaj naczyń krezki, unikając w ten sposób stymulacji śródbłonka. Z pętlą jelita krętego należy obchodzić się ostrożnie.
- Wizualizuj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem za pomocą mikroskopu odwróconego lub pionowego i kamery za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Rejestruj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem przez 1 minutę w 4 różnych żyłach na mysz.
- Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po zakończeniu eksperymentów obrazowych.
4. Analiza
- Przeprowadź analizę w trybie offline i z zaślepieniem dla wszystkich parametrów. Przeprowadź analizę za pomocą dowolnego odpowiedniego oprogramowania.
- Potwierdź stabilne i porównywalne międzyosobniczo warunki przepływu krwi w klipach filmowych o wysokiej rozdzielczości czasowej (maksymalna liczba klatek na sekundę) skoncentrowanych na wewnątrzświetlnym przepływie krwinek.
- Określ ilościowo liczbę toczących się leukocytów. W tym celu narysuj pionową linię przechodzącą przez żyłę i policz wszystkie leukocyty przekraczające tę linię w ciągu 1 minuty.
- Określ prędkość toczenia, mierząc czas, w którym pojedynczy leukocyt musi przejść odległość 50 μm podczas stabilnego toczenia się po śródbłonku. Aby to zrobić, narysuj dwie pionowe linie w odległości 50 μm przez żyłę.
- Zmierz czas, w którym reprezentatywny leukocyt musi przejść z jednej linii do drugiej. Oblicz prędkość leukocytów, dzieląc 50 μm przez potrzebny czas (μm/s).
- Zmierz adhezję leukocytów w polu 0,04 mm2 . Aby to zrobić, narysuj kwadrat o boku długości 200 μm do żyły.
- Policz twarde przylegające leukocyty, zdefiniowane jako brak widocznego ruchu przez 30 sekund, w tym kwadracie.
- Policz liczbę płytek krwi związanych z jednym leukocytem, aby określić ilościowo interakcje płytk-leukocyty.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przegląd ustawień eksperymentalnych opisanych w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawia on mysz z zewnętrznioną pętlą jelita cienkiego (ileum) oraz jej naczyniami, które można obserwować za pomocą mikroskopii wewnątrzorganowej. Rysunek 2 pokazuje pewien stopień aktywacji u zwierząt nieleczonych, wynikający z samego zabiegu. Jednak w porównaniu z myszami traktowanymi LPS niemal nie obserwuje się powolnego toczenia ani trwałej adhezji leukocytów. Rysunek 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym artykule opisano przygotowanie i wykonanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych myszy in vivo. Metoda ta daje nam możliwość obserwacji oddziaływań leukocytów-śródbłonka i płytek-śródbłonka11 bezpośrednio w żywym organizmie.
Jako wczesna reakcja na stan zapalny śródbłonek zostaje aktywowany i wchodzi w interakcję z leukocytami i płytkami krwi, powodując toczenie, adhezję i transmigrację12. Ale leukocyty oddziałują również z płytkami krwi, tworząc t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rodamina 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolisacharydy z Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
Bibliografia
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316(2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
