Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Podsumowanie

Tworzenie funkcjonalnych mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga stabilizacji fenotypów komórek poprzez dostosowanie tradycyjnych technik hodowli komórkowych do ograniczonych wymiarów przestrzennych w mikrourządzeniach. Modyfikacja kolagenu umożliwia osadzanie się warstwa po warstwie ultracienkich zespołów kolagenowych, które mogą stabilizować komórki pierwotne, takie jak hepatocyty, jako mikroprzepływowe modele tkankowe.

Streszczenie

Chociaż mikrofluidyka zapewnia znakomitą kontrolę mikrośrodowiska komórkowego, hodowla komórek w urządzeniach mikroprzepływowych może być challenging. 3D hodowla komórek w żelach kolagenowych typu I pomaga ustabilizować morfologię i funkcję komórki, co jest niezbędne do tworzenia mikroprzepływowych modeli tkanek w mikrourządzeniach. Przełożenie tradycyjnych technik hodowli 3D na płytki do hodowli tkankowych na urządzenia mikroprzepływowe jest często trudne ze względu na ograniczone wymiary kanału. W tej metodzie opisujemy technikę modyfikacji natywnego kolagenu typu I w celu wygenerowania polikationowych i polianionowych roztworów kolagenu, które można stosować z osadzaniem warstwa po warstwie w celu stworzenia ultracienkich zespołów kolagenowych na komórkach hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Te cienkie warstwy kolagenu stabilizują morfologię i funkcję komórki, jak pokazano na przykładzie hepatocytów pierwotnych, co pozwala na długotrwałą hodowlę mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych.

Wprowadzenie

Chociaż mikrofluidyka pozwala na znakomitą kontrolę mikrośrodowiska komórkowego, hodowla komórek, zwłaszcza pierwotnych, w urządzeniach mikroprzepływowych może być wyzwaniem. Wiele tradycyjnych technik hodowli komórkowych zostało opracowanych w celu podtrzymania i ustabilizowania funkcji komórek podczas hodowli na płytkach do hodowli tkankowej, ale przełożenie tych technik na urządzenia mikroprzepływowe jest często trudne.

Jedną z takich technik jest hodowla komórek na lub umieszczonych pomiędzy żelami kolagenowymi jako model fizjologicznego środowiska komórek 3D. ¹ Kolagen typu I jest jednym z najczęściej używanych białek do zastosowań w biomateriałach ze względu na jego wszechobecność w macierzy zewnątrzkomórkowej, naturalną obfitość, solidne miejsca przyczepiania komórek i biokompatybilność. ² Wiele komórek czerpie korzyści z hodowli 3D z kolagenem, w tym między innymi komórki rakowe^3,45, komórki śródbłonka mikronaczyniowego⁶ i hepatocyty⁷. Podczas gdy stosowanie żeli kolagenowych jest łatwe w otwartych formatach, takich jak płytki do hodowli tkankowych, ograniczone wymiary kanałów i zamknięty charakter urządzeń mikroprzepływowych sprawiają, że stosowanie płynów, które żelują bez zablokowania całego kanału, jest niepraktyczne.

Aby przezwyciężyć ten problem, połączyliśmy technikę osadzania warstwa po warstwie⁸ z chemicznymi modyfikacjami roztworów kolagenu natywnego, aby stworzyć ultracienkie zespoły kolagenu na komórkach hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Warstwy te mogą stabilizować morfologię i funkcję komórek podobnie jak żele kolagenowe i mogą być osadzane na komórkach w urządzeniach mikroprzepływowych bez blokowania kanałów spolimeryzowaną matrycą. Celem tej metody jest modyfikacja kolagenu natywnego w celu wytworzenia polikationowych i polianionowych roztworów kolagenu oraz stabilizacja komórek w kulturze mikroprzepływowej poprzez osadzanie cienkich zespołów macierzy kolagenowej na komórkach. Technika ta została wykorzystana do stabilizacji morfologii i funkcji pierwotnych hepatocytów w urządzeniach mikroprzepływowych. ⁹

Chociaż wcześniej opisywano osadzanie warstwa po warstwie za pomocą naturalnych i syntetycznych polielektrolitów¹⁰ w celu pokrycia hepatocytów w kulturze płytkowej^11,12 oraz jako warstwę siewną dla hepatocytów w urządzeniach mikroprzepływowych^13,14, ta metoda opisuje osadzanie czystej warstwy kolagenu na wierzchu hepatocytów, naśladując techniki hodowli kolagenu 3D. W tym protokole używamy hepatocytów jako przykładowych komórek, które można utrzymywać za pomocą warstw kolagenu 3D. Wiele innych typów komórek, które czerpią korzyści z hodowli 3D w kolagenie, może podobnie korzystać z hodowli po osadzaniu warstwa po warstwie ultracienkiego zespołu macierzy kolagenowej.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu kolagenu rozpuszczalnego w natywnym

1. Przygotuj lub kup 200 mg zakwaszonego, rozpuszczalnego kolagenu typu I z ogonów szczurów w dawce 1-3 mg / ml przy użyciu standardowych protokołów izolacji, takich jak zgłoszone przez Piez i wsp. ¹⁵
2. Skaluj ilość materiału wyjściowego w oparciu o pożądaną objętość końcową zmodyfikowanych roztworów kolagenu. Z około 200 mg rozpuszczalnego kolagenu natywnego przygotować 25–30 ml metylowanych i 25–30 ml roztworów kolagenu sukcynylowanego, każdy w stężeniu 3 mg/ml.

2. Metylacja kolagenu

1. Rozcieńczyć 100 mg natywnego, zakwaszonego (pH 2-3) roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/ml lodowatą sterylną wodą i utrzymywać roztwór na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.
2. Dostosuj pH roztworu kolagenu do 9–10 za pomocą kilku kropli 1 N NaOH i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Obserwuj, jak wytrąca się osad kolagenu, powodując, że roztwór staje się mętny.
3. Odkręcać wytrącony roztwór kolagenu o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut. Na dnie probówek powinien być widoczny przezroczysty, żelowy osad. Odessać i odpowiednio zutylizować płyn szwadronowy.
4. Zawiesić wytrącony kolagen w 200 ml metanolu z 0,1 N HCl i pozostawić reakcję metylacji z mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Kolagen nie rozpuści się, ale powinien rozpaść się na bardzo małe, widoczne kawałki, które spowodują, że roztwór będzie mętny.
5. Po metylacji odwirować roztwór o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut, aby osadzać metylowany kolagen. Odessać i usunąć zakwaszony supernatant metanolu.
6. Rozpuścić metylowany kolagen w 25 ml sterylnego PBS, uzyskując stężenie około 3 mg/ml, przy wielokrotnym pipetowaniu, i przefiltrować roztwór przez sitko do komórek 60 μm. Dostosować pH roztworu do 7,3–7,4, stosując przyrosty co 20 μl 1 N NaOH.
7. Oceń stężenie roztworu za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA do pomiaru kolagenu szczura lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Rozcieńczyć roztwór do 3 mg/ml jałowym PBS.
8. Wysterylizuj roztwór metylowanego kolagenu, przenosząc go do szklanej butelki z zakrętką, ostrożnie nakładając 3 ml chloroformu na dno butelki, pozwól butelce ustawić O/N na 4 °C, a następnie aseptycznie usuń i przechowuj górną warstwę, którą jest metylowany kolagen.
9. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 1 miesiąca.

3. Sukcynylacja kolagenu

1. Rozcieńczyć pozostałe 100 mg natywnego, zakwaszonego (pH 2-3) roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/ml lodowatą sterylną wodą i utrzymywać roztwór na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.
2. Dostosuj pH roztworu kolagenu do 9–10 za pomocą kilku kropli 1 N NaOH i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Kolagen powinien się wytrącić, powodując, że roztwór stanie się mętny.
3. Rozpuścić 40 mg bezwodnika bursztynowego (0,4 mg na mg kolagenu) w 10 ml acetonu (1/20 objętości roztworu kolagenu). Powoli (w odstępach co około 0,5 ml) dodawać tę mieszaninę do roztworu kolagenu, mieszając, stale monitorując pH. Utrzymuj pH powyżej 9,0, dodając 1 lub 2 krople 1 N NaOH, gdy pH zbliża się do 9,0.
4. Kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez 120 minut po dodaniu całego bezwodnika bursztynowego do acetonu. Obserwuj roztwór, aby stał się klarowny, gdy sukcynylowany kolagen rozpuszcza się. Okresowo sprawdzaj pH, aby upewnić się, że utrzymuje się powyżej 9,0.
5. Dostosować pH roztworu do 4,0 z przyrostami co 20 μl 1 N HCl. Ponownie obserwować, że roztwór jest mętny, gdy sukcynylowany kolagen wytrąca się.
6. Po sukcynylacji odwirować roztwór o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut, aby osadzać sukcynylowany kolagen. Odessać i usunąć zakwaszony supernatant z nieprzereagowanym bezwodnikiem bursztynowym.
7. Rozpuścić sukcynylowany kolagen w 25 ml sterylnego PBS, uzyskując stężenie około 3 mg/ml, przy wielokrotnym pipetowaniu, i przefiltrować roztwór przez sitko do komórek 60 μm. Dostosować pH roztworu do 7,3–7,4, stosując przyrosty co 20 μl 1 N NaOH.
8. Ocenić stężenie roztworu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do badania szczurów kolagenowych lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Rozcieńczyć roztwór do 3 mg/ml jałowym PBS.
9. Wysterylizuj sukcynylowany roztwór kolagenu, przenosząc go do szklanej butelki z zakrętką, ostrożnie nakładając 3 ml chloroformu na dno butelki, pozwól butelce ustawić O/N na 4 °C, a następnie aseptycznie usuń i przechowuj górną warstwę, którą jest kolagen sukcynylowany.
10. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 1 miesiąca.

4. Weryfikacja modyfikacji kolagenu

1. Przygotować 1 ml próbek z każdego z natywnych, metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu i rozcieńczyć do stężenia 0,1 mg/ml sterylną czystą wodą do miareczkowania jonów wodorowych. Dalej rozcieńczyć bufor co najmniej 1000-krotnie przez dializę z wodą przez membranę odcinającą o natężeniu 10 kDa, używając 3 podmian roztworu przez co najmniej 4 godziny każda.
2. Dostosuj pH roztworów do 7,3 z niewielkimi ilościami NaOH i HCl. Używając pH 7,3 jako dowolnego odniesienia, wykonaj miareczkowanie jonów wodorowych na każdej z próbek, jak opisano w Tanford¹⁶, aby utworzyć krzywe miareczkowania dla natywnych, metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu.
3. Wykreślić zmianę pH na objętość dodanego kwasu w funkcji liczby związanych jonów H⁺ na cząsteczkę. Zakres "aminowy" o wysokim pH powinien wykazywać przesunięcie kolagenu sukcynylowanego w kierunku punktu neutralnego (utrata grup aminowych), a zakres "karboksylowy" o niskim pH powinien wykazywać przesunięcie w lewo w kolagenie metylowanym (utrata grup karboksylowych) i przesunięcie w prawo w kolagenie sukcynylowym (przyrost grup karboksylowych), w porównaniu z kolagenem natywnym.
4. Ocenić skuteczność reakcji sukcynylacji, oznaczając % grup aminowych w kolagenie natywnym zastąpionym sukcynylacją przy użyciu metody kolorymetrycznej kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBA), zgodnie ze standardowymi protokołami^17,18.

5. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych i zasiewanie komórek

1. Wytwarzaj urządzenia mikroprzepływowe przy użyciu standardowych metod⁹. Użyj repliki formowania PDMS z wzorców SU-8 na krzemie zdefiniowanym za pomocą fotolitografii, aby stworzyć mikroprzepływowe komory do hodowli komórek z kanałami o wysokości 100 μm, szerokości 0,4–1,5 mm i długości 1–10 mm do wzrostu komórek.
2. Użyj myjki plazmowej, aby utlenić powierzchnie urządzenia i szkiełka podstawowego, a następnie dociśnij do siebie, aby skleić. Po wysterylizowaniu urządzenia przez wystawienie na działanie światła UV przez co najmniej 30 minut, napełnić komorę 50 μg/ml fibronektyny w sterylnym PBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
3. Zasiej urządzenie komórkami, takimi jak pierwotne hepatocyty szczura lub człowieka, które wymagają żelu kolagenowego do stabilizacji fenotypu lub stanu różnicowania. Używamy 20 μl świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów szczura^7,19 lub dostępnych w handlu kriokonserwowanych pierwotnych ludzkich hepatocytów wysiewanych w ilości 14×10⁶ komórek/ml na urządzenie.
4. Pozwól komórkom przyczepić się przez 4–6 godzin, a następnie wypłucz nieprzyłączone komórki i zastąp pożywkę galwaniczną pożywką wzrostową. Inkubuj O/N, aby zapewnić pełne rozprzestrzenianie się komórek i utworzyć zlewającą się monowarstwę komórek.

6. Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie

1. W kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym przygotuj wystarczającą ilość metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu na 10 aplikacji każdego roztworu na urządzenie, a także kilka ml pożywki. Utrzymuj roztwory na lodzie. Używamy 20 μl (10-15 razy więcej niż całkowita objętość urządzenia) kolagenu na warstwę na urządzenie.
2. Zaczynając od roztworu metylowanego (polikationowego), naprzemiennie przepłukuj urządzenia 20 μl metylowanych, a następnie sukcynylowanych roztworów kolagenu, odczekując 1 minutę między każdą aplikacją. Przepłucz urządzenie w sumie 10 razy na roztwór, co powinno zająć około 20 minut. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas, w którym komórki są bez nośnika.
3. Obserwuj, jak kolagen powoli gromadzi się na wlocie/wylocie w zależności od jego wielkości. Jeśli opór przepływu płynu wzrośnie, przepłucz urządzenie raz lub dwa razy media, a następnie kontynuuj nakładanie warstw.
4. Po nałożeniu wszystkich warstw należy dwukrotnie przepłukać urządzenie świeżą pożywką i ponownie umieścić je w inkubatorze. W zależności od typu komórki, zmiany morfologiczne wywołane macierzą zewnątrzkomórkową, takie jak zwiększona polaryzacja hepatocytów, powinny być widoczne w ciągu kilku godzin.
5. Przygotować reprezentatywne urządzenia do transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu metod standardowych⁹ w celu sprawdzenia obecności zespołu macierzy kolagenowej na wierzchu hodowanych komórek.

7. Stabilizacja fenotypu i funkcji komórki

1. Zobrazuj morfologię, żywotność i polaryzację komórki przy użyciu standardowych metod dla typu komórki. W przypadku hepatocytów zbieraj obrazy przez 14 dni za pomocą mikroskopii fazowej, barwienia LIVE/DEAD w celu zapewnienia żywotności i barwnika CMFDA do polaryzacji wierzchołkowej, aby zademonstrować efekty odkładania kolagenu.
2. W celu uzyskania morfologii komórek przepłucz urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknij 20 μl PBS i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
3. W przypadku barwienia LIVE/DEAD przepłukać urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknąć 20 μl roztworu barwiącego LIVE/DEAD z DAPI przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C, ponownie przepłukać urządzenie 20 μl PBS, i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
4. W przypadku barwienia kanałów żółciowych przepłukać urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknąć 20 μl roztworu barwiącego CMFDA o stężeniu 2 μM z DAPI przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, ponownie przepłukać urządzenie 20 μl PBS, i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
5. Zbierz zużytą pożywkę i zmierz produkty przemiany materii w odpowiednich punktach czasowych w czasie trwania hodowli, aby określić funkcję komórki. W przypadku hepatocytów zmierz ilość albuminy i mocznika w zużytym pożywce.
6. Wykonaj analizy funkcjonalne punktów końcowych samych komórek, takie jak ocena poziomu aktywności enzymów, barwienie przeciwciał lub analiza RNA. W przypadku hepatocytów indukuj i mierz aktywność enzymu cytochromu P450 lub enzymu sprzęgającego fazy II S-transferazy glutationowej.

Wyniki

Kolagen natywny może być modyfikowany za pomocą metylacji i sukcynylacji w celu stworzenia polikationowych i polianionowych roztworów kolagenu do stosowania w osadzaniu warstwa po warstwie. Sukcynylacja modyfikuje grupy ε-aminowe kolagenu natywnego grupami sukcynylowymi, a metylacja modyfikuje grupy karboksylowe kolagenu natywnego za pomocą grupy metylowej (ryc. 1A). Te modyfikacje łańcuchów bocznych aminokwasów białka kolagenowego zmieniają krzywe miareczkowania pH roztworów. Sukcynylacja zmniejsza licz...

Dyskusja

Ultracienkie zespoły czystego kolagenu mogą być osadzane na naładowanych komórkach lub powierzchniach materiałów za pomocą osadzania warstwa po warstwie zmodyfikowanych kolagenów. Wyniki tego badania pokazują, że metylacja i sukcynylacja kolagenu natywnego tworzą polikationowe i polianionowe roztwory kolagenu (ryc. 1), które można stosować techniką warstwa po warstwie do osadzania ultracienkich zespołów macierzy kolagenowej na komórkach (ryc. 2) lub innych naładowanych powierzchniach mat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kolagen typu I, ogon szczura	Life Technologies	A1048301	opcja dla skoncentrowanego kolagenu z ogona szczura
I, ogon szczura	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	opcja dla skoncentrowanego kolagenu
typu I z ogona szczura,	ogona szczura EMD Millipore	08-115	dla skoncentrowanego kolagenu z ogona szczura
systemy		badawczo-rozwojowe ogona szczura3440-100-01	opcja dla skoncentrowanego bezwodnika bursztynowego kolagenu z ogona szczura
	Sigma-Aldrich	239690-50G	odczynnik do sukcynylacji
bezwodny metanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	odczynnik do metylacji
wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Odczynnik do wytrącania pH
kwas solny	Sigma-Aldrich	320331-500ML	Odczynnik do wytrącania pH
kolagen szczurzy typu I Opcja ELISA	Chondrex	6013	do wykrywania zawartości kolagenu
Zestaw do oznaczania hydroksyproliny	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	opcja do wykrywania zawartości kolagenu
Zestaw do oznaczania hydroksyproliny	Opcja Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	do wykrywania zawartości kolagenu