Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53079

⸱

19 sierpnia 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Streszczenie

Różne rusztowania używane w inżynierii tkankowej wymagają kontrolowanego środowiska biochemicznego, aby naśladować fizjologiczną niszę komórkową. Włókna międzyfazowego kompleksowania polielektrolitów (IPC) mogą być stosowane do kontrolowanego dostarczania różnych czynników biologicznych, takich jak leki małocząsteczkowe, komórki, białka i czynniki wzrostu. Prostota metodologii wytwarzania włókien IPC daje elastyczność w jej zastosowaniu do kontrolowanego dostarczania biomolekuł. W tym miejscu opisujemy metodę włączania włókien IPC do dwóch różnych rusztowań polimerowych, hydrofilowego polisacharydu i hydrofobowego polikaprolaktonu, w celu stworzenia wieloskładnikowego rusztowania kompozytowego. Wykazaliśmy, że włókna IPC można łatwo osadzić w tych strukturach polimerowych, zwiększając zdolność do przedłużonego uwalniania i poprawiając zachowanie biomolekuł. Stworzyliśmy również kompozytowe rusztowanie polimerowe ze wskazówkami topograficznymi i przedłużonym uwalnianiem biochemicznym, które może mieć synergiczny wpływ na zachowanie komórek. Kompozytowe rusztowania polimerowe z włóknami IPC stanowią nowatorską i prostą metodę odtwarzania niszy komórkowej.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa ma wrodzone biochemiczne i biofizyczne wskazówki, które kierują zachowaniem komórki. Naśladowanie tego fizjologicznego trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska jest szeroko badaną strategią w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Na przykład zarówno podłoża pochodzenia naturalnego, jak i syntetycznego zostały zmodyfikowane za pomocą wskazówek topograficznych jako sposób na naśladowanie biofizycznego środowiska komórkowego. 1 Na przykład rusztowania polikaprolaktonowe (PCL) można łatwo modelować, odlewając je na wzorzystych podłożach PDMS. 2 Jednak większość syntetycznych rusztowań nieodpowiednio podsumowuje kontrolowane środowisko biochemiczne in vivo. Modyfikacje masowe lub powierzchniowe materiałów syntetycznych wykazują jedynie biochemiczne wskazówki dotyczące przyłączania komórek, ale nadal brakuje czasowej regulacji dostarczania biochemicznego. 3 W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na optymalne rusztowania, które mogą naśladować czasowo regulowany biochemiczny system dostarczania macierzy zewnątrzkomórkowej.

Biochemiczne systemy dostarczania, takie jak mikrosfery, są nękane problemami utraty bioaktywności i niską wydajnością inkorporacji ze względu na dotkliwość i złożoność wieloetapowego procesu syntezy. 4-6 Udowodniono, że alternatywne metody, które wykorzystują jednoetapową metodę wytwarzania i włączania, mają doskonały potencjał w tworzeniu korzystnego mikrośrodowiska biochemicznego bez towarzyszącej mu nieefektywności inkorporacji i utraty bioaktywności. Jednym z realnych rozwiązań jest zastosowanie włókien kompleksowania międzyfazowego polielektrolitu (IPC) do dostarczania i ochrony czynników biologicznych. Po połączeniu dwóch przeciwnie naładowanych wodnych roztworów polielektrolitu można wyciągnąć włókna IPC z interfejsu. Praktycznie każdy rodzaj biomolekuły hydrofilnej w roztworze wodnym może być dodany do ujemnie lub dodatnio naładowanego roztworu polielektrolitu, ułatwiając w ten sposób włączenie użytecznych biomolekuł do włókna IPC podczas procesu kompleksowania. Co więcej, proces ten wymaga jedynie warunków wodnych i otoczenia, co zmniejsza ryzyko utraty bioaktywności. Za pomocą tej metody udało się dostarczyć aktywne czynniki wzrostu2,7 nawet komórki8,9. Ponadto prosta metoda formowania włókien IPC pozwala na formowanie w dowolny kształt i orientację. Stabilność takich włókien była korzystna w ich włączaniu zarówno do polimerów hydrofobowych2, jak i hydrofilowych7 w celu tworzenia rusztowań kompozytowych. Te kompozytowe rusztowania z włóknami IPC są korzystne dla tworzenia fizjologicznie istotnego środowiska biochemicznego, zapewniając jednocześnie fizyczne zakotwiczenie komórek.

W tym badaniu pokazujemy metodę włączania włókien IPC do hydrofilowego i hydrofobowego rusztowania z topografią w celu kontrolowanego uwalniania aktywnych biomolekuł. Jako dowód słuszności koncepcji, włączamy włókna IPC wykonane z chitozanu i alginianu do biokompatybilnego, nieimmunogennego i nieantygenowego hydrofilowego hydrożelu pullulan-dekstran lub biokompatybilnego hydrofobowego rusztowania polikaprolaktonowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów polielektrolitu

  1. Oczyść chitozan, jak szczegółowo opisano w Liao i wsp. Krótko mówiąc, utwórz 1% (w/v) roztwór chitozanu w 2% (v/v) kwasie octowym i przefiltruj próżniowo, używając bibuły filtracyjnej klasy 93. Zneutralizować filtrat za pomocą 5M NaOH, aż pH ustabilizuje się do 7. Odwirować wytrącony chitozan o sile 1 200 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant i dodać wodę dejonizowaną, aby przemyć chitozan. Powtórz etap wirowania i mycia jeszcze dwa razy. Zamrozić wytrącony chitozan w temperaturze -80 °C i liofilizować O/N w celu uzyskania oczyszczonej postaci. Oczyszczony chitozan należy przechowywać w osuszonej szafce.
  2. Odważyć 1 g oczyszczonego chitozanu do sterylnego naczynia do hodowli tkankowych. Umieścić chitozan w naczyniu do hodowli tkankowej jak najbliżej lampy UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wystawić na działanie światła UV przez 15 minut. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wysterylizowany chitozan w szklanym pojemniku. Rozpuścić chitozan za pomocą przefiltrowanego 0,15 M kwasu octowego do końcowego stężenia od 0,5% do 1% (w/v).
  3. Odważyć 0,1 g soli sodowej kwasu alginowego i rozpuścić w 10 ml destylowanej wody dejonizowanej (DDI) do uzyskania 1% (w/v) roztworu. Mieszaj sól sodową kwasu alginowego przez co najmniej 2 godziny w mieszalniku wirowym, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Przefiltrować roztwór alginianu przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Przechowywać roztwór alginianu w temperaturze 4 °C.
  4. Należy rozpuścić ludzkie rekombinowane czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) lub czynnik wzrostu beta - nerwów (NGF), zgodnie z zaleceniami producenta.

2. Rysunek włókien IPC

  1. Wymieszaj białka, czynniki wzrostu lub inne biomolekuły w 10-20 μl podwielokrotności roztworu polielektrolitu o podobnym ładunku netto. Cząsteczki biologiczne o ujemnym ładunku netto (np. albumina surowicy bydlęcej [BSA]) należy zmieszać z roztworem alginianu. Cząsteczki biologiczne o dodatnim ładunku netto (np. VEGF) należy zmieszać z roztworem chitozanu.
  2. Umieść małe porcje (10-20 μl) chitozanu i alginianu na stabilnej płaskiej powierzchni pokrytej parafilmem. Kropelki chitozanu i alginianu należy umieszczać w bliskiej odległości, ale nie stykać się ze sobą.
  3. Lekko zanurz każdą końcówkę na kleszkach w kropelkach chitozanu i alginianu. Zbliż do siebie kropelki polielektrolitów, ściskając kleszcze. Gdy kropelki zetkną się ze sobą, powoli pociągnij kleszcze pionowo do góry, aby wyciągnąć włókno IPC z interfejsu dwóch kropel (rysunek 1A).
  4. Ostrożnie umieść koniec ciągnionego włókna IPC na kleszkach na kolektorze, takim jak płaskie rusztowanie polimerowe przymocowane do obracającego się trzpienia (patrz rozdział 3 i 4). Obracaj trzpień ze stałą prędkością 10 mm/s, aby umożliwić formowanie jednolitych i pozbawionych koralików włókien IPC. Zwiększenie prędkości ciągnięcia włókien IPC spowoduje utworzenie koralików, które spowodują pęknięcie wbudowanego biochemicznego i przedwczesne zakończenie włókna. 10
  5. Aby określić skuteczność włączania, należy zebrać wszystkie pozostałe ciecze pozostawione na parafilmie, rozcieńczając 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS). Zmierzyć zawartość białka lub czynnika wzrostu w pozostałości za pomocą testu BCA (dla BSA), ELISA (dla VEGF i NGF) lub odpowiedniego testu w celu wykrycia włączonej biocząsteczki.

3. Wytwarzanie kompozytowego rusztowania hydrożelowego z polisacharydu pullulan-dekstranu (PD) i włókien IPC

  1. Wytwarzanie protektorowej ramy pullulanowej do zbierania włókien IPC
    1. Odważyć polisacharyd pullulanu i wymieszać z destylowaną wodą dejonizowaną (DDI), aby uzyskać 20% (w/v) roztwór wodny. Wymieszać roztwór pullulanu O/N, aby zapewnić jednorodność.
    2. Wlać 15 g roztworu pullulanu do naczynia z polistyrenu tkankowego (TCPS) o średnicy 10 cm. Wysuszyć roztwór pullulanu O/N w temperaturze 37 °C. Pociąć folie pullulan na kwadratowe ramki o wymiarach 7 mm x 7 mm.
  2. Przygotowanie roztworu polisacharydów pullulan-dekstran
    1. Stworzyć 30% (w/v) roztwór polisacharydów pullulanu i dekstranu (w stosunku 3:1) w wodzie DDI. Wymieszać O/N, aby zapewnić jednorodność roztworu polisacharydów. Powoli dodawać wodorowęglan sodu do roztworu polisacharydów, aby osiągnąć końcowe stężenie 20% (w/v). Wymieszać O/N, aby zapewnić jednorodność roztworu. Roztwór polisacharydu przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Zbieranie włókien IPC na ramie pullulan
    1. Przymocować ramkę z pullulana (sekcja 3.1) za pomocą zacisku krokodylkowego. Przyklej zacisk krokodylkowy i ramkę pullulan na końcu obrotowego trzpienia za pomocą taśmy klejącej pokrytej tworzywem sztucznym. Obracać trzpień z zamontowaną ramą ze stałą prędkością 10 mm/s. Ramę pullulan można przymocować do trzpienia obrotowego w żądanej orientacji.
  4. Narysuj włókna IPC za pomocą kleszczy (sekcja 1) i przymocuj narysowany koniec włókien IPC do obracającej się ramy pullulan. Narysuj włókna IPC ze stałą prędkością. Po dotarciu do końcowego końca włókna IPC, wysusz włókna na ramie konstruktor O / N w RT.
  5. Osadzanie włókien IPC w rusztowaniu hydrożelowym PD
  6. Aby usieciować każdy gram roztworu pullulanu-dekstranu, należy dodać 100 μl 11% (w/v) wodnego roztworu trimetafosforanu sodu i 100 μl 10M wodorotlenku sodu. 7 Mieszaj roztwór przy 60 obr./min za pomocą mieszadła przez 1 do 2 minut. Po dodaniu trimetafosforanu sodu i wodorotlenku sodu roztwór polisacharydu usieciuje się niemal natychmiast. Wlej lepki roztwór polisacharydu na konstrukcję włókien na ramie, aby w pełni osadzić włókna IPC. Inkubować połączone włókna pullulan-dektran-IPC (PD-IPC) w temperaturze 60 °C przez 30 minut, aby utworzyć chemicznie usieciowane rusztowania kompozytowe (ryc. 1B).
  7. UWAGA: Wykonaj krok 3.3.2 w dygestoriach i użyj odpowiedniego sprzętu ochronnego, ponieważ kwas octowy jest substancją i łatwopalną.
  8. W celu wywołania tworzenia się porów w rusztowaniu PD-IPC należy zanurzyć całe rusztowanie w 20% (w/v) kwasie octowym na 20 minut.
  9. Usunąć nieprzereagowane odczynniki, myjąc rusztowania PD-IPC w 1X PBS przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 100 obr./min. Powtórz ten krok 2 razy.
  10. Usunąć nadmiar PBS i natychmiast zamrozić rusztowania PD-IPC w temperaturze -80 °C O/N. Liofilizować rusztowania co najmniej 24 godziny przed użyciem w jakichkolwiek testach kontrolowanego uwalniania lub bioaktywności.

4. Produkcja rusztowań kompozytowych z włókien PCL i IPC

UWAGA: Dichlorometan jest materiałem niebezpiecznym. Podczas obchodzenia się z dichlorometanem należy używać dygestorium i środków ochrony osobistej.

  1. Tworzenie nieskazitelnych i wzorzystych podłoży PDMS
    1. Stwórz nieskazitelne podłoże elastomerowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) za pomocą kawałka TCPS o pożądanym wymiarze, korzystając z procesu miękkiej litografii. Twórz wzorzyste podłoża PDMS przy użyciu standardowych metod miękkiej litografii na szablonach z poli(metakrylanu metylu) o pożądanej topografii. 12
  2. Wytwarzanie protektorowej ramy PCL do zbierania włókien IPC
    1. Odważyć PCL i rozpuścić w dichlorometanie, aby uzyskać 0,9% (w/v) roztwór. Na każde 1cm2 powierzchni podłoża PDMS upuść 500 μl 0,9% roztworu PCL. Pozwolić, aby cały rozpuszczalnik dichlorometanu całkowicie odparował w dygestorium. Powtórz proces odlewania 0,9% PCL, aby zagęścić folię do pożądanej grubości. Usuń wysuszoną folię PCL z podłoża PDMS. Utwórz otwór w ramie PCL za pomocą dziurkacza o odpowiedniej wielkości. cyfra arabska
  3. Zbieranie włókien IPC na ramie PCL
    1. Przymocować protektorową ramę PCL z otworem (od 4.2.1) do zacisku krokodylkowego. Przyklej zacisk krokodylkowy do obracającego się trzpienia za pomocą taśmy klejącej pokrytej tworzywem sztucznym. Przymocuj narysowany koniec światłowodu IPC do ramy PCL przed rozpoczęciem obrotu ze stałą prędkością 10 mm/s (sekcja 2). Po zakończeniu ciągnienia włókien IPC wysuszyć konstrukcję światłowodową na ramie O/N w temperaturze 4 °C.
  4. Osadzanie konstrukcji światłowodowej na ramie w wzorzystym podłożu PCL
    1. Upuść 500 μl 0,9% roztworu PCL na podłoże PDMS, aby stworzyć nieskazitelną lub wzorzystą bazę PCL, zgodnie z wymaganiami. Odlewać wiele warstw 0,9% roztworu PCL, aby uzyskać rusztowanie o pożądanej grubości. Pozwolić, aby cały rozpuszczalnik dichlorometanu całkowicie odparował w dygestorium.
    2. Umieść konstrukcję fiber-on-frame (sekcja 4.3.1) na górze podstawy PCL. Kilkakrotnie dodać 0,9% roztwór PCL do konstrukcji fiber-on-frame, aby uzyskać pożądaną grubość i w pełni osadzić włókna IPC, tworząc rusztowanie kompozytowe PCL-IPC (rysunek 1C).

5. Pomiar uwalniania czynników biologicznych z kompozytowych rusztowań IPC

  1. Kompozytowe rusztowania PD-IPC lub PCL-IPC oraz samodzielne włókna IPC należy umieszczać oddzielnie w płytce 24-dołkowej.
  2. Zanurz rusztowanie i samodzielne włókna IPC w 500 μl 1X PBS. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C. Zebrać PBS w różnych punktach czasowych (pożywka antyadhezyjna) i zastąpić 500 μl 1X PBS.
  3. Zmierzyć ilość białka lub czynnika wzrostu w pożywce uwalniającej za pomocą testu BCA (BSA), ELISA (VEGF i NGF) lub innego odpowiedniego testu w celu obliczenia profilu łącznego uwalniania dla włączonej biocząsteczki.

6. Wysiewanie komórek na kompozytowych rusztowaniach IPC w celu zbadania bioaktywności uwolnionych czynników biologicznych

  1. Sterylizować liofilizowane rusztowania kompozytowe PD-IPC lub PCL-IPC za pomocą światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 20 minut.
  2. Stosować standardowe techniki hodowli komórkowej, aby uzyskać zawiesinę komórkową składającą się z 2 x 105 komórek w pożywce wzrostowej o objętości 200 μl. Zasiądź skoncentrowaną zawiesinę komórkową na rusztowaniach kompozytowych. Po 20 minutach uzupełnij objętość pożywki wzrostowej, aby całkowicie zanurzyć rusztowania.
  3. Mierz aktywność komórek za pomocą standardowych technik, takich jak test aktywności metabolicznej błękitu Alamar, test wzrostu neurytów PC12 lub immunofluorescencja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym artykule dążyliśmy do stworzenia rusztowań kompozytowych z włóknami IPC do przedłużonego uwalniania różnych biomolekuł. Charakterystyka biomolekuł wykorzystanych w tej badaniu znajduje się w Tabeli 1. Włókna IPC osadzono najpierw w hydrofilowym hydrożelu PD, aby stworzyć kompozytowe rusztowanie PD-IPC (Rysunek 1B). W celu sprawdzenia wykonalności zastosowania rusztowania kompozytowego do kontrolowanego uwalniania biomolekuł, w pierwszej kolejności przetestowano cząsteczkę mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Włókna IPC powstają w wyniku interakcji dwóch przeciwnie naładowanych polielektrolitów. Proces wykorzystuje ekstrakcję kompleksu z granicy faz polielektrolitów, ułatwiając proces samoorganizacji w celu stabilnego tworzenia włókien. Mechanizm powstawania włókien IPC zapewnia, że każda biomolekuła dodana do podobnie naładowanego polielektrolitu może zostać włączona podczas procesu kompleksowania. 10,11 I odwrotnie, dodanie biomolekuły do przeciwnie naładowanego polielektrolitu spowoduje natychmiastowe wytrącenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Singapurską Narodową Fundację Badawczą zarządzaną przez jedno z jej Centrów Doskonałości Badawczej, Instytut Mechanobiologii w Singapurze. MFAC jest wspierany przez Agencję ds. Nauki, Technologii i Badań (Singapur) oraz Narodową Agencję ds. Badań Naukowych (Francja) w ramach projektu nr 1122703037. BKKT jest wspierany przez Instytut Mechanobiologii. Dziękujemy Panu Danielowi HC Wong za korektę manuskryptu oraz Pani Dawn JH Neo za pomoc w produkcji filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pullulan Hayashibara Inc, Okayama, JaponiaMasa cząsteczkowa (MW) 200 kDa. Materiał ten to pullulan klasy farmaceutycznej używany do produkcji ram pullulan i rusztowań PD-IPC.
DextranSigma AldrichD1037MW 500 kDa. Materiał ten nie jest już produkowany przez Sigma Aldrich. Alternatywnie sugerowany jest numer katalogowy 31392 (Sigma Aldrich). Materiał ten służy do produkcji rusztowań PD-IPC.
Wodorowęglan sodu Sigma AldrichS5761Wodorowęglan sodu należy powoli dodawać do roztworu polisacharydów pullulan-dekstran. Szybkie dodanie wodorowęglanu sodu spowoduje wytrącanie się. 
Trimetafosforan soduSigma AldrichT5508Ta substancja chemiczna jest higroskopijna i musi być przechowywana w szafie osuszającej. Wodny roztwór trimetafosforanu sodu musi być zawsze świeży.
Wodorotlenek soduSigma AldrichS5881Ten materiał jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawice nitrylowe.
ChitozanSigma Aldrich448877MW 190-310 kDa. Stopień acetylacji od 75% do 85%. Oczyszczanie chitozanu jest wymagane do wytworzenia stabilnych włókien IPC.
Kwas octowyMerckMożna go zastąpić innym typem marki. Ten materiał jest i łatwopalny. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną w dygestoriach należy nosić sprzęt ochronny, taki jak osłona twarzy, rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i pokrowiec na buty.
Kwas alginowy sól sodowa z alg brunatnych, niska lepkośćSigma AldrichA2158Rozpuścić w wodzie na noc. Przefiltruj przez sterylne 0,2  &mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Surowica bydlęca AlbuminaSinopharm OdczynnikRozpuścić w sterylnym PBS i przefiltrować za pomocą 0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem.
Zestaw testowy BCAPierce23225Ten zestaw służył do pomiaru uwalniania BSA z rusztowań PD-IPC. 
Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowegoR& Systemy D293-VERozpuszczają czynnik wzrostu w 0,2% roztworze heparyny do końcowego stężenia 5  mg/ml.
Heparyna Sól sodowa z wieprzowinySigma AldrichH3393Można ją zastąpić innym typem marki. Rozpuść sól heparyny w sterylnej wodzie o końcowym stężeniu 1% i przefiltruj przez 0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy przed użyciem.
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)LonzaC2517ATen pierwotny typ komórek został wykorzystany w teście do określenia bioaktywności VEGF po uwolnieniu z rusztowań PD-IPC.
Alamar blueLife TechnologiesDAL1025Służy do pomiaru aktywności metabolicznej komórek. Inkubuj błękit Alamar z komórkami i utrzymuj w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 2 do 4 godzin. Zmierz absorbancję przy 570 nm, aby określić procentową redukcję błękitu Alamar, która jest skorelowana z aktywnością komórki.
Liofilizator ScanVac CoolsafeLabogene7.001.200.060Jest to nieprogramowalny liofilizator, który działa w zakresie od -105 do -110  °C. Można go zastąpić innymi standardowymi liofilizatorami laboratoryjnymi.
Polikaprolakton (PCL)Sigma Aldrich181609MW 65 kDa. Nie jest on już produkowany przez Sigma Aldrich. Można go zastąpić numerem katalogowym Sigma Aldrich 704105.
DichlorometanSigma AldrichV800151Można go zastąpić innym typem marki. Materiał ten jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
Polidimetylosiloksan (PDMS; zestaw elastomerów silikonowych 184)DowCorning(240)4019862Zestaw elastomerów jest dostarczany z bazą polimerową i środkiem sieciującym. Mieszanie bazy polimerowej i środka sieciującego w różnych proporcjach spowoduje różną sztywność PDMS.
Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu nerwów beta (NGF)R& Systemy D256-GFRozpuszczony w sterylnej wodzie demineralizowanej do końcowego stężenia 100  &mikro; g⁠/⁠ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C do momentu użycia.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC)CambrexTen typ komórek został wykorzystany w teście w celu określenia synergicznego efektu NGF i nanotopografii.
Szczurze komórki guza chromochłonnego PC12 ATCCTen typ komórek został wykorzystany w teście wzrostu neurytów w celu określenia bioaktywności NGF. Po ekspozycji na pożywkę antyadhezyjną z NGF zmierz liczbę komórek z rozszerzeniami neurytów i znormalizuj do całkowitej liczby komórek.
Bibuła filtracyjna klasy 93WhatmanZ699675Służy do oczyszczania chitozanu po jego wytrąceniu wodorotlenkiem sodu o pH 7.
Wirówka kubełkowaEppendorf5810RDo stosowania podczas oczyszczania chitozanu przy użyciu prędkości 1 200 x g.
Silnik z trzpieniem obracającym się ze stałą prędkościąRhymebusRM5ESilnik służy do wytwarzania włókien IPC na ramie pullulan lub PCL.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFirstBaseSterylizować przez filtrację (0,2 &mikro; m filtr) i autoklaw. 
Naczynie z polistyrenu do kultur tkankowych o średnicy 10 mm (TCPS)GreinerNaczynie TCPS służy do odlewania ramy pullulanowej. 
Ludzki zestaw VEGF ELISAR& Systemy DDVE00Zestaw ELISA służy do wykrywania VEGF w podłożu antyadhezyjnym.
Ludzki zestaw NGF ELISAR& Systemy DDY256Zestaw ELISA służy do wykrywania NGF w medium uwalniającym.
Taśma klejąca powlekana tworzywem sztucznymBel-Art9040336Taśma klejąca służy do bezpiecznego przyklejenia zacisku krokodylkowego do obracającego się trzpienia
chemiczny

Bibliografia

  1. Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  2. Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
  3. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  4. Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
  5. Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  6. King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
  7. Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
  8. Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
  9. Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
  10. Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
  11. Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
  12. Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
  13. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
  14. Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
  15. Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
  16. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
  17. Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
  18. Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
  19. Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
  20. Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353(2013).
  21. Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165(2005).
  22. Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
  23. Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
  24. Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
  25. Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kontrolowane dostarczanie biomolekułkompozytowe rusztowania polimerowerusztowanie poświęcalneformowanie włókien IPCrusztowanie polisacharydowerusztowanie z polikaprolaktonuuwalnianie przedłużonewskazówki topograficznezachowanie biomolekuł
Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.