Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Podsumowanie

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Streszczenie

Hodowla komórkowa była tradycyjnie przeprowadzana na dwuwymiarowych (2D) podłożach, gdzie komórki przylegają za pomocą receptorów brzusznych do powierzchni biomateriału. Jednak in vivo większość komórek jest całkowicie otoczona macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), co powoduje trójwymiarową (3D) dystrybucję receptorów. Może to wywołać różnice w szlakach sygnałowych na zewnątrz-wewnątrz, a tym samym w zachowaniu komórek.

Ten artykuł pokazuje, że stymulacja receptorów grzbietowych komórek już przyklejonych do podłoża 2D poprzez nałożenie warstwy nowego materiału (kultura przypominająca kanapkę) powoduje ważne zmiany w stosunku do standardowych kultur 2D. Co więcej, jednoczesne wzbudzenie receptorów brzusznych i grzbietowych przesuwa zachowanie komórki bliżej tego, które można znaleźć w środowiskach 3D. Dodatkowo, ze względu na charakter systemu, kultura przypominająca kanapkę jest wszechstronnym narzędziem, które pozwala na badanie różnych parametrów interakcji komórka/materiał, np. topografii, sztywności i różnych powłok białkowych zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Wreszcie, ponieważ kultury typu sandwich są oparte na podłożach 2D, kilka procedur analitycznych opracowanych już dla standardowych kultur 2D może być normalnie stosowanych, pokonując bardziej złożone procedury potrzebne w systemach 3D.

Wprowadzenie

Tradycyjnie, hodowla komórkowa była przeprowadzana na dwuwymiarowych (2D) podłożach, chociaż większość mikrośrodowisk komórkowych in vivo ma charakter trójwymiarowy (3D). To nienaturalne środowisko 2D wywołuje zmiany w zachowaniu komórek jako sposób na samoadaptację do płaskiego świata, co bezpośrednio wpływa na los komórki^1,2. W związku z tym wyniki uzyskane na hodowlach komórkowych 2D nie zawsze są odtwarzalne in vivo. Zachęciło to do opracowania nowych odpowiednich systemów hodowli, mających na celu zapewnienie warunków bardziej zbliżonych do fizjologicznych, aby uzyskać dalszy wgląd w dowolny mechanizm biologiczny zależny od wymiaru^3,4.

Jedną z głównych różnic między hodowlą 2D a środowiskiem 3D in vivo jest rozmieszczenie receptorów komórkowych zakotwiczonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM): podczas gdy na podłożach 2D komórki przylegają brzusznie, większość komórek in vivo jest całkowicie otoczona przez ECM, a zatem adhezja komórek następuje poprzez dystrybucję receptorów 3D. Uruchamia to różne szlaki sygnałowe adhezji komórek, modulując w ten sposób ważne procesy, takie jak wzrost komórek, różnicowanie komórek i ekspresja genów. W ciągu ostatnich dziesięcioleci powstało wiele różnych systemów hodowli 3D^5-8, chociaż ich zmienność i złożoność utrudniają ich standaryzację w typowych procedurach hodowli komórkowych. Co więcej, systemy 3D zwykle nie są łatwe w obsłudze, a obecne procedury eksperymentalne na podłożach 2D nie mogą być łatwo ustalone dla kultur 3D. Ponadto literatura rzadko porównuje hodowle 3D z równoważnymi warunkami 2D lub innymi systemami 3D, co utrudnia właściwe zrozumienie zachowania komórek w tych modelach.

Po przyklejeniu komórek do podłoża 2D, wzbudzenie receptorów grzbietowych — poprzez nałożenie warstwy nowego materiału (kultura typu sandwich) — może wywołać reakcje komórek podobne do środowisk 3D. Powodem tego jest jednoczesna aktywacja zarówno receptorów grzbietowych, jak i brzusznych w celu przylegania i rozprzestrzeniania się w środowisku kanapkowym (ryc. 1)^9,10. W konsekwencji w komórkach zachodzą ważne zmiany w stosunku do kultur 2D^11,12. W ten sposób los komórki jest determinowany podczas składania z powodu kultury kanapkowej, ponieważ stymulacja grzbietowa wyzwala zmiany w kluczowych szlakach komórkowych. Dlatego los komórki jest wysoce zdeterminowany przez czas kiedy składa się kultura przypominająca kanapkę¹¹.

Ze względu na charakter systemu, kultura przypominająca kanapkę jest prostym i wszechstronnym narzędziem, które pozwala na badanie różnych parametrów interakcji komórka/materiał, takich jak chemia, topografia, sztywność i powłoki białkowe zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Zapewnia to wyższy stopień wszechstronności w porównaniu z innymi systemami 3D (ilustracja 2) ze względu na niezależną kombinację grzbietową i brzuszną w szerokim zakresie warunków powierzchni. Dodatkowo można badać różne linie komórkowe i różne czasy składania kultury przypominającej kanapkę, co zwiększa szerokie spektrum możliwości.

Standardowy protokół hodowli kanapkowej jest szczegółowo opisany poniżej, używając albo elektroprzędzonych włókien lub folii z poli-L-kwasu mlekowego (PLLA) jako substratów grzbietowych, szklanego szkiełka nakrywkowego jako substratu brzusznego i fibronektyny jako powłoki białkowej. Kultury przypominające kanapki montowano tuż po wysianiu komórek lub po 3 godzinach hodowli 2D. Należy jednak pamiętać, że można użyć innych systemów materiałowych i białek; Podobnie kultura przypominająca kanapkę może być montowana w różnych punktach czasowych.

Protokół

1. Produkcja podłoży grzbietowych

1. Produkcja płaskiej folii PLLA metodą odlewania rozpuszczalnikowego.
   1. Pracować pod wyciągiem, aby przygotować roztwór 2% (w/v) PLLA w chloroformie (2 g PLLA w 100 ml chloroformu), mieszając w temperaturze pokojowej (RT) aż do całkowitego rozpuszczenia (około 3 godziny).
   2. Umieść podkładki na szklanej szalce Petriego.
      Uwaga: Stosować podkładki ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 10,5 mm (nieco mniejszej niż średnica brzuszna próbki) tak, aby podkładka była umieszczona na podłożu brzusznym. Można również zastosować inne materiały, takie jak politetrafluoroetylen (PTFE) lub podkładki szklane.
   3. Dodać 200 μl roztworu PLLA do myjki i pozostawić do powolnego odparowania przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby umożliwić powolne odparowywanie rozpuszczalnika, należy zamknąć szalkę Petriego folią aluminiową z kilkoma otworami.
   4. Ogrzewać próbki w temperaturze 120 °C przez 5 minut w celu odparowania śladowych ilości rozpuszczalnika.
   5. Poczekaj, aż próbki ostygną w temperaturze pokojowej.
   6. Po ostygnięciu próbek (około 30 minut) zalać szalką Petriego wodą o mocy 18,2 MΩ·cm i inkubować przez 8 minut w temperaturze RT.
      Uwaga: Jeśli próbki nie zostaną całkowicie schłodzone, mogą pobrać 18,2 MΩ·cm wody i przyjąć stan gumowaty. Dodatkowo inkubacja w wodzie o mocy 18,2 MΩ·cm przez mniej niż 8 minut może skutkować niewłaściwym odłączeniem, a przez ponad 8 minut odłączeniem od myjki.
   7. Za pomocą żyletki podważ podkładki, aby oderwać je od szalki Petriego.
   8. Usuń wszelkie niedoskonałości z krawędzi pralki za pomocą pęsety i pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu.
   9. Próbki należy przechowywać w eksykatorze próżniowym (80 mbar) do dnia eksperymentu, ponieważ PLLA ulega degradacji w procesie hydrolizy.
2. Produkcja włókien PLLA metodą elektroprzędzenia.
   1. Pracować w dygestorium, aby przygotować roztwór 8% (w/v) PLLA w heksafluoroizopropanolu (8 g PLLA w 100 ml heksafluoroizopropanolu), mieszając w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia (około 3 godziny).
   2. Umieść podkładki z politetrafluoroetylenu (PTFE) na blasze aluminiowej lub na bębnie do elektroprzędzenia, aby uzyskać odpowiednio losowe lub wyrównane włókna.
      Uwaga: Użyć podkładek z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej 10,5 mm (nieco mniejszej niż średnica brzuszna próbki) tak, aby podkładka była umieszczona na podłożu brzusznym. Można również użyć innych materiałów, takich jak stal nierdzewna lub podkładki szklane. Bęben powinien obracać się z prędkością kątową 160,7 ^sec-1 (promień = 7 cm) w celu uzyskania wyrównanych włókien. Mniejsza prędkość może nie spowodować wyrównania włókien, a większa prędkość spowoduje uszkodzenie włókien.
   3. Naładować strzykawkę roztworem polimeru i umieścić ją na pompie strzykawkowej.
   4. Roztworu PLLA należy odwirować elektrolitycznie, wykorzystując natężenie przepływu 0,9 ml/h przy napięciu 30 kV i odległości od kolektora 12 cm.
   5. Przerwij proces elektroprzędzenia po 20-30 minutach, po osiągnięciu dobrej gęstości włókien (ponieważ komórki muszą oddziaływać z kilkoma włóknami jednocześnie).
   6. Ogrzewać próbki w temperaturze 120 °C przez 5 minut w celu odparowania śladowych ilości rozpuszczalnika.
   7. Próbki należy przechowywać w eksykatorze próżniowym (80 mbar) do dnia eksperymentu, ponieważ PLLA ulega degradacji w procesie hydrolizy.

2. Kultura kanapkowa

1. Złóż kulturę przypominającą kanapkę, gdy komórki przykleją się do brzusznego podłoża 2D.
   1. Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.
   2. Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco zawierającym Ca²⁺ i Mg²⁺ (200 μl / próbkę) przez 1 godz.
      Uwaga: Ze względu na proces wytwarzania, podłoża grzbietowe mają wyznaczoną górną i dolną stronę, ponieważ folia odlewana rozpuszczalnikiem i włókna elektroprzędzone są przymocowane do jednej ze stron podkładki. Ta strona jest zatem tą, która jest skierowana w stronę komórek (rysunek 3).
      1. Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS aż do ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ powoduje to denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca²⁺ i Mg²⁺, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.
   3. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych¹³,
      Uwaga: Ponieważ kultura przypominająca kanapkę jest oparta na podłożach 2D, wysiew komórek zostanie przeprowadzony podobnie jak na próbce 2D. Na przykład mioblasty C2C12 wysiewa się w 17 500 komórkach ^cm-1 w celu eksperymentów różnicowania, a fibroblasty NIH3T3 wysiewa się w 7 000 komórek ^cm-1 w izolowanych kulturach w celu zbadania morfologii i adhezji komórek.
   4. Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i pozostawić komórkom przyleganie do podłoża brzusznego przez 3 godziny.
   5. Umieść brzuszne podłoże wysiewane w nowej studzience z 12-dołkową płytką wielodołkową (gdzie pasują podkładki).
      Uwaga: Złożenie kultury przypominającej kanapkę w nowej studzience jest jednym ze sposobów na pozbycie się komórek, które przylgnęły do dna studzienki po wysianiu, ponieważ będą one zużywać składniki odżywcze i wydzielać czynniki wzrostu i odpady, które wpływają na komórki hodowane w systemie przypominającym kanapkę. Jest to również konieczne w przypadku ekstrakcji komórkowych w celu lizy tylko komórek hodowanych w środowisku przypominającym kanapkę.
   6. Ostrożnie i za pomocą pęsety nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Uzupełnić pożywką (1 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
      Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.
   7. Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, tak jak w standardowych kulturach 2D. Nie przesuwaj podłoża grzbietowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek.
2. Złóż kulturę przypominającą kanapkę zaraz po wysianiu komórek.
   1. Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.
   2. Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w DPBS zawierającej Ca²⁺ i Mg²⁺ (200 μl/próbkę) przez 1 godzinę.
      1. Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS aż do ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ powoduje to denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca²⁺ i Mg²⁺, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.
   3. Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych w studzience z 12-dołkową płytką (gdzie mieszczą się podkładki). Aby to zrobić, użyj wysoce skoncentrowanej zawiesiny komórkowej, aby uniknąć utraty komórek po ułożeniu podłoża grzbietowego.
   4. Ostrożnie i za pomocą pęsety nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Uzupełnić pożywką (1 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
      Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.
   5. Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, jak w standardowych kulturach 2D.
      Uwaga: Nie przesuwaj podłoża grzbietowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek.

3. Analiza

Uwaga: Kultury kanapkowe są oparte na substratach 2D, więc mogą być często analizowane przez procedury już opracowane dla standardowych kultur 2D. Na przykład, ponieważ PLLA jest przezroczysta, a komórki są ograniczone do poruszania się w płaszczyźnie x-y, mikroskopia jest wykonywana jak na podłożach 2D. Migracja komórek może być zatem analizowana jak w przypadku kultur 2D, bez konieczności śledzenia komórek w osi z, jak w przypadku kultur 3D, co upraszcza eksperyment i analizę obrazu. Aby zbadać test gojenia się ran za pomocą testu zadrapania, postępuj zgodnie z tym protokołem:

1. Zbadaj migrację komórek (test gojenia się ran) w kulturze przypominającej kanapkę.
   1. Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.
   2. Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającej Ca²⁺ i Mg²⁺ przez 1 godzinę.
      1. Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS do czasu ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ może to spowodować denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca²⁺ i Mg²⁺, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.
   3. Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych o dużej gęstości¹³.
   4. Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i pozwolić komórkom osiągnąć zbieżność.
   5. Użyj końcówki pipety, aby zarysować monowarstwę komórek, aby uzyskać 2 populacje komórek oddzielone szczeliną.
   6. Umieść brzuszny substrat wysiewany w nowej studzience odpowiedniej do akwizycji poklatkowej i w miejscu, w którym mieszczą się podłoża grzbietowe (tj. 12-dołkowa płytka wielodołkowa).
   7. Ostrożnie i za pomocą pęsety nałożyć podłoże grzbietowe na komórki, a następnie ponownie napełnić pożywką (1 ml na płytkę 12-dołkową).
      Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.
   8. Umieścić próbkę w mikroskopie poklatkowym (ustawionym na 37 °C i 5% CO_{2 )} i wykonywać zdjęcia zamknięcia szczeliny co 20 minut.
   9. Przeanalizuj zamknięcie luki za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak wtyczka MiToBo firmy ImageJ. ¹⁴

Uwaga: Ekstrakcja białek i kwasów nukleinowych odbywa się podobnie jak na podłożach 2D. Jest tylko jeden dodatkowy krok, który polega na rozebraniu kultury przypominającej kanapkę w celu dodania buforu do lizy bezpośrednio na komórki w celu zwiększenia wydajności ekstrakcji. Na przykład w przypadku ekstrakcji mRNA:

2. Ekstrakcja mRNA z kultur podobnych do kanapek
   1. Przygotuj wszystkie z zestawu komercyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Wyjmij kulturę przypominającą kanapkę z inkubatora.
   3. Usunąć pożywki hodowlane z próbek.
   4. Przemyć próbki raz DPBS zawierającym Ca²⁺ i Mg²⁺ (1 ml) i usunąć cały roztwór.
   5. Za pomocą pęsety usuń podłoże grzbietowe i dodaj bufor do lizy (350 μl) do podłoża brzusznego. Ponownie nałożyć substrat grzbietowy na substrat brzuszny w celu lizy również komórek przylegających do podłoża grzbietowego.
   6. Usuń podłoże grzbietowe, aby wyizolować roztwór do lizy.
   7. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać mRNA.

Uwaga: Immunodetekcja białek może być również przeprowadzona jak na podłożach 2D. Ponieważ kultury przypominające kanapki mogą utrudniać prawidłową dyfuzję przeciwciał i, należy wydłużyć czas inkubacji. Kanapkę można również zdemontować przed rozpoczęciem protokołu barwienia, ale w tym ostatnim przypadku niektóre komórki pozostaną przyczepione do podłoża grzbietowego, a niektóre do podłoża brzusznego.

3. Immunodetekcja białek w kulturze przypominającej kanapkę
   1. Przemyć próbkę raz za pomocą DPBS i utrwalić 4% formaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Podłoże grzbietowe można usunąć podczas procesu utrwalania, aby uniknąć problemów z dyfuzją.
   2. Płukać preparatem DPBS (1 ml), a następnie przepuszczać wodę 0,5% Triton X-100 w DPBS (1 ml) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 1% albuminy w DPBS (1 ml) przez 30 minut w RT.
   4. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (2 μg/ml; 1 ml) w roztworze blokującym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj 3 razy przez 10 minut za pomocą DPBS/0,5% Tween 20 (1 ml).
   6. Inkubować przez 2 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi (2 μg/ml) i 1 μg/ml DAPI w roztworze blokującym (1 ml) w temperaturze pokojowej.
   7. Prać 3 razy przez 10 minut w DPBS/0,5% Tween 20 (1 ml).
   8. Prać w DPBS.
      Uwaga: Próbki można zamontować na szkiełku z Vectashield i uszczelnić lakierem do paznokci, gdy podłoża grzbietowe zostaną usunięte przed wykryciem immunologicznym.
   9. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym jak dla standardowych podłoży 2D.

Wyniki

Stymulacja receptorów grzbietowych w kulturze przypominającej kanapkę powoduje zmiany w morfologii komórki, adhezji komórek i wewnątrzkomórkowych szlakach sygnałowych (np. ogniskowa kinaza adhezyjna, FAK)^10-12. Na przykład fibroblasty hodowane w systemie przypominającym kanapkę wykazywały nadekspresję podjednostki integryny α₅ w porównaniu z 2D, jak zaobserwowano dla innych kultur 3D^15,16.

Los komórki jest wysoce zależny od czasu, kiedy receptory grzbi...

Dyskusja

W dzisiejszych czasach hodowla 3D jest ważnym tematem dla przemysłu farmaceutycznego i biotechnologicznego, a także badań w zakresie biologii komórki, w tym nowotworów i komórek macierzystych. W związku z tym opracowano kilka systemów hodowli 3D. Niestety, różnice między systemami 3D zwykle skutkują różnym zachowaniem komórek, co utrudnia zrozumienie ich losu. Poza tym procedury eksperymentalne zwykle nie są tak proste, jak w przypadku systemów hodowli 2D. Dlatego bardzo ważne jest opracowywanie nowych systemów kulturowy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ploy(kwas mlekowy)	NatureWorks	4042D	Odczynnik
Okulary nakrywkowe (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Sprzęt
Chloroform	Scharlab	CL0200	Odczynnik
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Odczynnik
Strzykawka (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Sprzęt
Pompa strzykawkowa	New Era Systemy pompowe	NE1000	Sprzęt
Zasilacz wysokiego napięcia DC	Inkubator sprzętu wysokonapięciowego	Glassman serii FC
	Hucoa-Herlö s	3111	Sprzęt Przepływ
laminarny  kaptur	Telstar	AV30/70	Sprzęt
Ludzka fibronektyna	Sigma	F2006	Odczynnik
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
Odczynnik Mikroskop odwrócony	Leica Microsystems	DMI 6000	Sprzęt
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Odczynnik Albumina	Sigma-Aldrich	A7409
Odczynnik Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Odczynnik