Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Podsumowanie

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Streszczenie

Proces morfogenezy nabłonka sutka jest pod wpływem hormonów. Badanie działania hormonów na nabłonek piersi przy użyciu kultur 2D ogranicza się do punktów końcowych proliferacji komórek i ekspresji genów. Jednak w organizmie morfogeneza sutka zachodzi w środowisku 3D. Systemy hodowli 3D pomagają wypełnić lukę między jednowarstwową hodowlą komórkową (2D) a złożonością organizmu. W tym artykule opisujemy model hodowli 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów. Wykorzystuje dostępną na rynku reagującą na hormony ludzką linię komórkową nabłonka piersi, T47D i kolagen typu 1 ze szczurzego ogona jako matrycę. Ten model hodowli 3D reaguje na główne hormony mammotropowe: estradiol, progestageny i prolaktynę. Wpływ tych hormonów na morfogenezę nabłonka można zaobserwować po 1- lub 2-tygodniowym leczeniu w zależności od punktu końcowego. Kultury 3D można pobrać w celu analizy morfogenezy nabłonka, proliferacji komórek i ekspresji genów.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do standardowych kultur 2D, modele zastępcze hodowli komórkowych 3D pozwalają na badanie zachowania komórek nabłonka w fizjologicznie istotnym kontekście, przypominającym tissue. 3D hodowle gruczołu sutkowego pomogły wyjaśnić wiele aspektów rozwoju gruczołu sutkowego i neoplazji. Jednak większość obecnie dostępnych modeli hodowli 3D nie nadaje się do badania działania hormonów, ponieważ ludzkie linie komórkowe nabłonka używane do tego zadania nie mają ekspresji receptorów hormonalnych ^6,7,9.

Tutaj opisujemy model 3D kulturowy ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów ¹². Model ten wykorzystuje dostępną na rynku reagującą na hormony linię komórek nabłonka piersi ludzkiej, T47D ^3,11,13, która pierwotnie pochodziła z wysięku opłucnowego uzyskanego od 54-letniej pacjentki z naciekającym rakiem przewodowym piersi. Jako matrycę używamy kolagenu typu 1 z ogona szczura. Ten model hodowli 3D jest odpowiedni do badania działania trzech głównych hormonów mammotropowych (estradiolu, promegestonu (analogu progesteronu) i prolaktyny) na ludzkie komórki nabłonka piersi. Morfologię nabłonka indukowaną hormonami można ocenić ilościowo w czasie za pomocą analizy morfometrycznej¹².

Odpowiednia gęstość wysiewu pozwala na przechowywanie tych kultur 3D przez 2 tygodnie. Do tego czasu rozwój struktur jest wystarczający do solidnej oceny ilościowej działania hormonów na morfologię nabłonka. Żele mogą być również zbierane we wcześniejszych punktach czasowych w celu analizy proliferacji komórek i ekspresji genów. Dodatkowo model ten nadaje się do testowania efektów sekwencyjnego leczenia hormonalnego; Na przykład po leczeniu estradiolem w pierwszym tygodniu i zastąpieniu go innym hormonem/kombinacją hormonów w następnym tygodniu. Wpływ związków estrogenowych i antyestrogenów, takich jak ICI 182,780, można również badać za pomocą tego modelu hodowli 3D ¹².

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Rozpuść syntetyczny progestagen promegeston (R5020) i 17-β-estradiol (E2) w etanolu, aby uzyskać ^10-3 M roztwory podstawowe. Rozpuścić prolaktynę w destylowanej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Rozpuść antyestrogen ICI 182,780 w DMSO, aby uzyskać ^10-2M roztwór podstawowy. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze -20 ° C do 6 miesięcy.
2. Surowica pozbawiona dekstranu węglowego (CD) i pożywki CDFBS:
   1. Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 57 °C przez 30 min.
      Uwaga: Do pozostałej części tego protokołu należy używać wyłącznie naczyń szklanych mytych kwasem.
   2. Oblicz potrzebną ilość węgla drzewnego. Używając o 10% więcej objętości niż ilość surowicy, aby skompensować przemieszczenie spowodowane przez węgiel drzewny, zważ 5% wag./obj. aktywowanego węgla drzewnego w proszku.
   3. Umyj węgiel drzewny dwukrotnie zimną dejonizowaną wodą destylowaną, używając tej samej objętości co ilość serum. Dla każdego mycia odwirować przy 50 x g przez 2 minuty, aby granulować węgiel drzewny. Usuń wodę między praniami. Dodaj 0,5% wag./obj. Dekstran T-70 do ostatniej granulki węgla drzewnego. Zawiesić w destylowanej, dejonizowanej wodzie i odwirować przy 100 x g przez 5 minut. Zassać wodę.
   4. Dodaj odpowiednią objętość surowicy do granulki i ponownie zawiesić granulkę dekstranu z węgla drzewnego w surowicy. Inkubować podczas walcowania (6 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 60 min. Wirować przy 2.000 x g przez 20 min. Jeśli sklarkat wydaje się mętny, powtórzyć wirowanie; Jednak surowica może nie być całkowicie przezroczysta w tym czasie, ale zostanie usunięta podczas filtracji.
   5. Przefiltruj przez filtr 0,80 mikrona, a następnie ponownie przez filtr 0,45 mikrona, aby usunąć większe cząstki stałe. Na koniec wysterylizuj filtr za pomocą filtra 0,20 mikrona. Przefiltrowane CDFBS należy przechowywać w szklanych probówkach lub kolbach hodowlanych T-25 w temperaturze -20 °C.
   6. Pożywka zawierająca dekstran węglowy (pożywka CDFBS): zmieszać 375 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej i 125 ml DMEM/F-12. Usunąć 37,5 ml i zastąpić go taką samą objętością surowicy bydlęcej Charcoal Dextran Stripped Fetal Bullal. Dodać 10⁶ U/ml penicyliny i L-glutaminy do końcowego stężenia 2 mM. Otrzymane podłoże to 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Węgiel drzewny pozbawiony dekstranu-FBS, 2 mM L-glutaminy i 10⁶ U / ml penicyliny.
3. Przygotuj 10X PBS, 1N NaOH i destylowaną wodę dejonizowaną. Przygotuj wystarczającą objętość każdego z nich zgodnie z potrzebną objętością roztworu kolagenu. Wysterylizuj wszystkie roztwory przez filtrowanie. Przechowuj 10x PBS i sterylną destylowaną wodę dejonizowaną w temperaturze 4 ° C przez okres do 1 miesiąca. Nie przechowywać roztworu 1N NaOH.
4. Przygotować roztwór kolagenu o stężeniu końcowym 1 mg/ml zgodnie z protokołem "Alternatywnej procedury żelowania kolagenu I, ogon szczura" dostarczonym przez producenta. Każdy żel składa się z 1,5 ml roztworu kolagenu. Na przykład przygotuj 18,5 ml (0,5 ml w celu uwzględnienia ubytku podczas pipetowania) roztworu kolagenu, aby przygotować 12 żeli. Roztwór kolagenu należy stosować od razu lub trzymać na lodzie do 2-3 godzin.
5. Barwnik karminowy ałun:
   1. Połącz 1 g karminu i 2,5 g siarczanu glinu potasu w 500 ml wody destylowanej. Gotować mieszając przez 20 minut. Obserwuj uważnie, aby uniknąć wykipienia. Dostosuj końcową objętość z powrotem do 500 ml za pomocą dodatkowej wody destylowanej.
   2. Dodaj kryształ tymolu dla aktywności przeciwdrobnoustrojowej i przykryj butelkę folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Przefiltruj przez papierowy filtr klasy laboratoryjnej przed każdym użyciem. Używaj ponownie roztworu karminu przez okres do trzech miesięcy. Przechowywać w temperaturze RT, chronić przed światłem.
6. Roztwór kolagenazy: rozpuścić kolagenazę w pożywce DMEM/F12 w stężeniu 0,125% w/v. Nie przechowuj tego roztworu.

2. 3D Hodowla komórek T47D w żelach z kolagenem typu 1 ze szczurzego ogona i leczenie hormonalne

Uwaga: sterylne pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową i przeprowadzić zliczanie komórek. Podziel hodowle komórek T47D, zanim osiągną 70% konfluencji. Odwirować objętość zawierającą potrzebną ilość komórek. Weź pod uwagę, że jeden żel powinien zawierać około 75 000 komórek T47D.
2. Za pomocą zimnej pipety ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości kolagenu. Weź pod uwagę, że każdy żel składa się z 1,5 ml kolagenu. Delikatnie wymieszaj komórki i kolagen, aby uniknąć wprowadzania bąbelków.
3. Aby zapobiec wpływowi elektryczności statycznej na rozkład komórek, po rozpakowaniu płytki należy wyszczotkować krawędzie, górę i spód płytki 12-dołkowej szczoteczką redukującą ładunki elektrostatyczne. Aby uniknąć gromadzenia się ładunków elektrostatycznych podczas kontaktu z powierzchnią roboczą okapu, umieść tę płytkę na innej 12-dołkowej płytce (pustej płytce), która również została wyszczotkowana szczotką redukującą ładunki elektrostatyczne. Delikatnie wlej 1,5 ml mieszanki do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
4. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją z powrotem w kapturze.
5. Za pomocą sterylnej końcówki p200 ostrożnie oderwij żel delikatnymi okrężnymi ruchami od krawędzi studzienki. Żel powinien również oderwać się od dna studni.
6. Rozcieńczyć hormony w pożywkach CDFBS, które mają być dodane do studzienek. Stosować E2 i R5020 w stężeniu końcowym 10 ^-10 M oraz prolaktynę w stężeniu końcowym ^10-7 M. Jako kontrolę, należy użyć pożywki CDFBS bez dodatku hormonów, ale nadal zawierającej największą objętość DMSO równą zastosowanym zapasom hormonów. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 1,5 ml pożywki. Umieść kultury 3D w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 i} wilgotności 100%. Utrzymuj kultury przez 1 lub 2 tygodnie, zmieniając pożywkę co 2 dni.

3. Przetwarzanie żelu dla całych wierzchowców

1. Usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 1,5 ml PBS do każdej studzienki.
2. Przenieś żel na szkiełko. Przetnij żel na pół za pomocą zakrzywionego ostrza chirurgicznego. Kontynuuj przetwarzanie z jedną połową, a drugą połowę zachowaj do analizy histologicznej.
3. Przenieś połówkę żelu na całe mocowanie na szkiełko. Pozostaw żel do wyschnięcia na 5 minut, a następnie przenieś szkiełko do słoika z kopiną zawierającego 10% formaliny.
   Uwaga: wszystkie inkubacje powinny być wykonywane w RT.
4. Utrwal żele w słoiku coplin na shakerze O/N.
5. Umyj szkiełka dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy na shakerze. Przenieś szkiełka do 70% EtOH; Inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce. Przenieś szkiełka do karminowego ałunu O/N.
6. Następnego dnia odwodnić szkiełka na shakerze w 70% EtOH, 95% EtOH i 100% EtOH przez 1 godzinę każdy. Przenieś szkiełka do ksylenu dwa razy po 1 godzinę i trzymaj na shakerze. Użyj podłoża montażowego na bazie toluenu do montażu żeli i szkiełek nakrywkowych o grubości 1,5 mm.
7. Zbadaj całe mocowania w zwykłym świetle (mikroskop lub stereoskop). Do bardziej szczegółowej analizy kształtu i światła należy użyć mikroskopii konfokalnej i uwidocznić barwnik karminowy za pomocą lasera HeNE 633 nm.

4. Przetwarzanie żelu do analizy histologicznej

1. Przenieść pozostałą połowę żelu do szklanej fiolki o pojemności 20 ml zawierającej 10% formaliny i utrwalić na shakerze O/N.
2. Umyj żele dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy na shakerze. Umieść żele w kasetach przetwórczych do zatapiania parafiny.
3. Przenieś żele do 70% EtOH, inkubuj przez 1 godzinę, a następnie 95% EtOH przez 1 godzinę, zmień na świeże 95% EtOH na 1 godzinę, 100% EtOH na 1 godzinę i zmień na świeże 100% EtOH przez 1 godzinę. W tym momencie żele mogą być przechowywane w 100% EtOH O/N w temperaturze pokojowej lub inkubowane z ksylenem przez 1 godzinę, a następnie ponownie w świeżym ksylenie przez 1 godzinę.
4. Przenieść kasety do parafiny na 1 godzinę w temperaturze 60 °C w inkubatorze próżniowym, powtórzyć ze świeżą parafiną jeszcze dwa razy.
5. Napełnij plastikowe formy czystą parafiną. Otwórz kasetę, wyjmij żel i umieść go w plastikowej formie zawierającej parafinę. Napełnij parafiną i dodaj górną część kasety zawierającej etykietę na górze i pozwól blokowi ostygnąć.
6. Wyjmij plastikową formę i pokrój blok za pomocą mikrotomu. Uzyskać skrawki o grubości 5 μm do barwienia HE i immunocytochemii.

5. Ekstrakcja komórek z komórek z żeli za pomocą leczenia kolagenazą

1. Usuń żel ze studzienki i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą PBS. Krótko spłucz żel.
2. Przenieść żel do 15 ml probówki zawierającej 2 ml 0,125% kolagenazy. Pipetować w górę i w dół 4-5 razy, aby rozbić żel na małe kawałki.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut (do momentu rozpuszczenia żelu i uzyskania zawiesiny komórek)
4. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą. Zebrać komórki przez odwirowanie (1 000 x g, 5 min), odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki i policzyć.

Wyniki

Rysunek 1 podsumowuje procedurę przygotowania hormonowo-wrażliwych kultur 3D. Struktury nabłonkowe obserwuje się w całych preparatach żeli hodowanych przez 2 tygodnie w obecności samego E2 oraz w połączeniu z innymi hormonami. Jedynie pojedyncze komórki lub grupy 2-3 komórek występują w przypadku, gdy do pożywki hodowlanej (pożywka CDFBS) nie dodano hormonów (Rysunek 2). Stan ten służy jako kontrola negatywna.

Komórki w hodowli 3D tworzą struktury różniące się...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy wrażliwy na hormony model hodowli 3D w celu przetestowania działania hormonów na nabłonek piersi. Odpowiedź na hormony można ocenić na poziomie morfologii tkanki, proliferacji komórek i ekspresji genów ¹². Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że wizualizacja w okresie hodowli jest ograniczona do mikroskopii świetlnej, ponieważ kultury są hodowane na plastikowej płycie dolnej. System hodowli 3D można dostosować do szklanych płyt dennych, aby umożliwić obrazowanie kultur ^{na żywo...}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych (Falcon)	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml polistyrenowe probówki stożkowe	Fisher Scientific	14-959-49D
Węgiel aktywowany	Sigma	C-5510
Karminowy ałun	Sigma	C1022-100G
Kolagenaza, typ 3	Worthington	S0C11784
Mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM510	Wyposażony w laser HeNe 633nm
Dextran T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej	Life Technologies	11339-021	Pożywka bez czerwieni fenolowej do stosowania hormonalnego
DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	Life Technologies	11054-020	Pożywka bez czerwieni fenolowej do stosowania hormonalnego
17-β-estradiol	EMD Millipore	3301	rozpuszczony w etanolu
	Etanol Koptec	V1001
Hykon	płodowej surowicy bydlęcej	SH30070.03	Do stosowania z hormonami musi być usunięty dekstran z węgla drzewnego
Filtry (115 ml)	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	odpowiednio 0,88, 0,45, 0,20 mikrona
Formalina, 10%	Fisher Scientific	SF93-20
L-Glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780 (fulwestrant)	Sigma Aldrich	I4409-25MG	rozpuszczona w
mikrotomie DMSO	Leica	RM2155
Podłoże do zatapiania tkanek	McCormick Scientific	39502004
Penicylina	Sigma	7794-10MU	Rozpuszczona w 10 ml destylowanej wody dejonizowanej
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7.4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
Prolaktyna	Sigma Aldrich	L4021-50UG	Rozpuszczony w destylowanej wodzie dejonizowanej
Promegeston	Perkin Elmer	NLP004005MG	Rozpuszczony w etanolu
Kolagen ze szczurzego ogona	Corning	354236	Partie mogą zawierać różne stężenia, należy na to zwrócić uwagę Skalpel
	Miltex	4311
Półzamknięty stacjonarny procesor tkanek	Leica	TP1020
Wodorotlenek sodu	Sigma Aldrich	S5881	Przygotuj zapas 1N NaOH
Szczotka antystatyczna StaticMaster	Pipety	C3500
stripette	Corning	4101
Kolby T-25	Corning
Kasety na tkanki	Fisher Scientific	15-200-403E
Fiolki pszeniczne, szkło, 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
Ksylen	VWR	95057-822

serologiczne Amstat 430168